Name: Ablation spécifique des hépatocytes chez le poisson zèbre pour étudier conduit biliaire-Régénération hépatique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Découvrez l'ablation spécifique des hépatocytes chez Danio rerio pour étudier la régénération hépatique dépendante des voies biliaires. Cette méthode permet d'analyser les mécanismes de régénération du foie en temps réel.

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Les auteurs remercient les Drs Hukriede et Tsang pour les discussions. M.K. a été soutenu par une subvention de formation des NIH (T32EB001026). Ce travail a été soutenu en partie par des subventions de l’American Liver Foundation, de la March of Dimes Foundation (5-FY12-39) et du NIH (DK101426) à D.S.

Poisson zèbre ont été soulevées et élevés selon la procédure standard; expériences ont été approuvés par l&#39;Université de Pittsburgh institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité. 1. Préparation d&#39;embryons / larves <ol><li> Pour mener accouplements chronométrés, mis en place adulte mâle et femelle Tg (fabp10a: CFP-NTR) S931 poissons hémizygotes ou homozygotes O / N et placer une séparation entre eux. Retirer ce diviseur le lendemain matin lorsque l&#39;accouplement est souhaitée. Recueillir des embryons en forçant l&#39;eau en utilisant une maille fine passoire en plastique. </li><li> Tourner la crépine à l&#39;envers et rincer la surface de maille avec un mince filet d&#39;eau d&#39;œuf distribué à partir d&#39;un flacon souple. Transférer 100 embryons dans une boîte de Pétri de 100 mm avec 25 ml d&#39;eau de l&#39;œuf. Gardez pas plus de 100 embryons par boîte de Pétri et les élever à 28 ° C. </li><li> Pour inhiber la pigmentation, ajouter phénylthiourée (PTU) dans les boîtes de Pétri avant 10 h après la fécondation (HPF), et d&#39;élever embryos / larves jusqu&#39;au 80 HPF. La concentration finale de 0,2 mM est PTU. ATTENTION: PTU est toxique. Utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées. </li><li> Anesthésier les larves par addition de 3-amino benzoïque ester éthylique de l&#39;acide (tricaïne), à ​​une concentration finale de 0,016%, dans les boîtes de Pétri. Puis, en utilisant un microscope à épifluorescence, larves sorte CFP-positif. Utilisez les larves avec une taille de foie et jeter semblable à celles d&#39;un foie plus petit ou plus grand. REMARQUE: les larves de PCP-positif, indépendamment de l&#39;intensité, peut être utilisé car il n&#39;y a aucune différence dans la mesure des hépatocytes ablation entre les larves hémizygote et homozygotes. ATTENTION: tricaïne est toxique. Utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées. </li><li> Retirer l&#39;eau d&#39;œuf contenant Tricaine et ajouter de l&#39;eau d&#39;œuf supplémenté avec 0,2 mM PTU. Garder les embryons / larves à 28 ° C. </li></ol> 2. Traitement Mtz <ol><li> Préparer une solution fraîche mM Mtz 10 en dissolvant 0,171 g de poudre Mtz en 100 ml d&#39;eau d&#39;œuf complété avec 0,2% de DMSO et 0,2 mM PTU. Pour dissoudre complètement le Mtz, mélanger la solution à la température ambiante sous agitation rapide pendant 20-30 minutes. Pour aider à solubiliser Mtz et d&#39;améliorer Mtz perméation dans les larves, ajouter DMSO lors de la préparation Mtz. ATTENTION: L&#39;exposition prolongée ou accrue concentration de Mtz est toxique. Utiliser conformément aux directives de manipulation appropriées. </li><li> Séparer les larves dans des groupes de contrôle et expérimentales en transférant nombre désiré de larves dans deux différents plat 100 mm de Pétri ou plaque multi-puits. Pour le groupe expérimental, garder les larves dans une solution 10 mM Mtz; pour le groupe de contrôle, gardez-les dans de l&#39;eau contenant de l&#39;œuf 0,2% de DMSO. </li><li> Couvrir les plaques ou les boîtes de Pétri contenant la solution Mtz avec du papier d&#39;aluminium pour éviter la photo-inactivation de Mtz, et incuber à 28 ° C. La durée du traitement dépend de la Mtz stade larvaire et la lignée transgénique. </li><li> Pour observer similaire sévère ablation des hépatocytes dans le <em&gt; Tg (fabp10a: CFP-NTR) en ligne, traiter les larves avec la solution Mtz soit de 3,5 jours après la fécondation (DPF) (pour une durée de 36 h) ou de 5 dpf (pour une durée de 24 heures). </li></ol> 3. Analyse des voies biliaires axée sur la régénération du foie <ol><li> A la fin de la période d&#39;ablation, on élimine la solution Mtz des plaques. Laver les larves Mtz traitée par addition de 25 ml d&#39;eau de l&#39;oeuf. Agiter la plaque 2-3 fois pour laver les larves avant de jeter l&#39;eau d&#39;œuf. Répétez trois fois et puis plonger les larves une fois de plus dans l&#39;eau d&#39;œuf. Pour éviter l&#39;œdème cardiaque et la mort larvaire chez les larves traitées Mtz, ajouter une plus faible concentration de tricaïne, à une concentration finale de 0,008%, pour immobiliser les larves. </li><li> Pour l&#39;analyse du foie, examiner la taille du foie des larves Mtz traité sous un microscope à épifluorescence avec le filtre de la PCP. Évaluer les niveaux d&#39;ablation d&#39;hépatocytes fonction de la taille relative du foie: un grand (non-ablation; 0-10% larves), moyen (partiellement ablation; 10-20%) et très faible (entièrement ablation; 80 à 90%). </li><li> Retirer les larves avec des foies non soumises à une ablation ou partiellement ablation. Seulement conserver des larves avec une minuscule foie, qui est indicative d&#39;ablation sévère des hépatocytes. Pour l&#39;analyse du foie à la régénération 0 point de temps de h (R0H), récolter les larves après Mtz lavage et de la PCP tri. Sinon, conservez les larves triés dans l&#39;eau d&#39;œuf supplémenté avec 0,2 mM PTU avant d&#39;être prêt pour la récolte. </li><li> Transfert larves récoltées dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml et remplacer l&#39;eau d&#39;oeuf avec la solution de fixation de 3% de formaldehyde dans du tampon PEM. Incuber le tube sur un rotateur O / N à 4 ° C. </li><li> Remplacer la solution de fixation avec 1 ml de PBSDT et faire tourner le tube contenant les larves sur le rotateur pendant 5 min. </li><li> Transférer les larves fixe dans une boîte de Pétri de 100 mm contenant PBSDT et en utilisant une pince, retirer manuellement jaune et pectorales sous un microscope de dissection. Transférer jusqu&#39;à 20 larves tp disséqué dans un tube de 1,5 ml. </li> &lt;li&gt; Remplacer solution PBSDT avec 1 ml de solution de blocage et de rock du tube sur un rotateur à température ambiante pendant 2 h. </li><li> Remplacer la solution de blocage avec 100 ul de solution de blocage contenant des anticorps primaires. Lentement balancer le tube sur un rotateur O / N à 4 ° C. </li><li> Retirer la solution d&#39;anticorps primaire et laver avec PBSDT 5 fois pendant 10 min à chaque fois. Puis ajouter 100 ul de la solution de blocage contenant des anticorps secondaires et le rock sur un agitateur à température ambiante pendant 2h. </li><li> Laver 5 fois avec PBSDT pour 10 min à chaque fois à la température ambiante en basculant sur un rotateur. </li><li> Orientez les larves latéralement sur une lame de microscope et ajouter une goutte de milieu de montage. Les couvrir soigneusement avec un couvercle en verre et sceller le couvercle en verre avec un polissoir à ongles. Maintenant, il est prêt pour la microscopie confocale. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Sévère, mais pas doux, hépatocytes ablation suscite conduit biliaire-régénération du foie. Par conséquent, après un traitement Mtz et lavage, il est important d&#39;examiner la taille du foie de la larve Mtz-traité, qui peut être évaluée par fluorescence intrinsèque de la PCP fabp10a: CFP-NTR transgène. Comme un faible pourcentage de larves traitées Mtz affiche non-ablatée (0-5%) ou partiellement ablation (10-20%) des foies, il est essentiel de régler et d&#39;analyser seulement les larves avec une très petite ...

Le foie est un organe très régénérative. Au cours de la régénération du foie, régénération des hépatocytes, les cellules du parenchyme du foie, sont dérivés des hépatocytes pré-existantes (entraînée hépatocytes régénération du foie (BEC) ou entraîné biliaire de régénération du foie) 1,2. Des lésions hépatiques suscite habituellement la prolifération des hépatocytes pré-existante; cependant, lorsque la prolifération des hépatocytes est compromise, BEC peut contribuer à hépatocytes 2-4. Ces deux modes de régénération du foie sont cliniquement significatives. Après l&#39;ablation chirurgicale d&#39;une partie du foie humain (par exemple, en raison de tumeurs du foie ou des donneurs vivants de foie), les hépatocytes dans le foie restant prolifèrent pour récupérer la masse du foie perdu. En revanche, chez des patients atteints de maladies hépatiques graves, la prolifération des hépatocytes est fortement compromise, de sorte que BEC ou de cellules souches du foie (LPC) semblent contribuer à la régénération des hépatocytes 5,6. Le modèle de hépatectomie partielle rongeurs 2/3, dans lequelhépatocytes prolifèrent pour récupérer la masse du foie perdu, a largement contribué à la compréhension actuelle de entraîné hépatocytes de foie de régénération 7,8. Cependant, il n&#39;y a pas modèle de rongeur valide dans lequel les hépatocytes régénération proviennent principalement de BEC. Bien que plusieurs modèles de rongeurs de la toxine du foie ont conduit à l&#39;identification de conduit biliaire du foie régénération 2-4, des études récentes de la lignée de traçage chez les souris indiquent une contribution minimale de BEC pour la régénération des hépatocytes dans ces modèles 9,10. Certains des modèles de lésions hépatiques de rongeurs, y compris une hépatectomie partielle et induite par l&#39;acétaminophène 11-13-14,15 dommages au foie, ont été appliquées pour le poisson zèbre et conduit à l&#39;identification de nouveaux gènes ou des voies impliquées dans la régénération du foie. Cependant, les hépatocytes entraînée, mais pas BEC-entraînée, la régénération du foie se produit dans ces modèles de lésion du foie de poisson zèbre. Par conséquent, un modèle de lésion du foie roman dans lequel CAE contribuent largement à regenerating hépatocytes est nécessaire pour une meilleure compréhension du BEC-entraîné la régénération du foie. Les objectifs globaux du modèle d&#39;ablation des hépatocytes décrits ici sont (1) pour générer un modèle de lésion du foie dans laquelle CAE contribuent largement aux hépatocytes de régénération, et (2) élucider les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents BEC-driven la régénération du foie. Nous émettons l&#39;hypothèse que la gravité des blessures détermine le mode de régénération du foie; ainsi, nous avons prédit que conduit biliaire-régénération du foie lancerait lors d&#39;une lésion des hépatocytes sévère. Pour tester cette hypothèse, nous avons développé un modèle de lésion du foie de poisson zèbre en générant une lignée transgénique, Tg (fabp10a: CFP-NTR) S931, qui exprime très nitroreductase bactérienne (NTR) fusionnée avec une protéine fluorescente cyan (CFP) dans le cadre du fabp10a spécifique hépatocytes promoteur. Depuis NTR convertit le promédicament non toxique, le métronidazole (Mtz), en un médicament cytotoxique, il ne l&#39;ablation destiné NTR-cellules exprimant 16-18, dans ce cas, les hépatocytes. En manipulant la durée du traitement Mtz, l&#39;étendue des hépatocytes ablation peut être contrôlée. En utilisant ce modèle, nous avons récemment signalé que sur une perte sévère des hépatocytes, BEC donne lieu à beaucoup hépatocytes régénération 19, qui a été confirmée par deux autres études indépendantes 20,21. Par conséquent, par rapport à l&#39;rongeur ci-dessus et les modèles de lésions du foie de poisson zèbre, notre modèle d&#39;ablation des hépatocytes est plus avantageux pour l&#39;étude BEC-driven la régénération du foie. Ce protocole décrit la procédure pour effectuer des expériences de régénération du foie en utilisant le modèle hépatocytes d&#39;ablation poisson zèbre. Ce modèle sera appropriée pour déterminer les mécanismes sous-jacents conduit biliaire-régénération du foie et pour les écrans chimiques pour identifier de petites molécules qui peuvent réprimer ou d&#39;augmenter la régénération du foie.

<table><tbody><tr><td>Poudre d’ester éthylique d’acide 3-aminbenzoïque (tricaïne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td>Produire 0,4 % (15 mM) de tricaïne : Porter 0,4 g de tricaïne à 100 mL avec de l’eau d’œuf. Ajuster au pH 7.</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>Métronidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1547</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>Formaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252549</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de calcium dihydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3771</td><td></td></tr><tr><td>N-Phénylthiourée (PTU)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7629</td><td></td></tr><tr><td>Support de montage (Vectashield)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>100 x 15 mm boîte de Pétri&nbsp ;</td><td>Denville Scientific Inc.</td>Vernis à ongles transparent <td>M5300</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>50949071</td><td></td></tr><tr><td>pince fine</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Dumont #5&nbsp ;</td></tr><tr><td>lame de verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>lamelle en verre</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-540-A et 12-542-A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>zn-5 (souris anti-Alcam)</td><td>ZIRC</td><td>zn-5</td><td>1:10</td></tr><tr><td>dilution chèvre anti-Hnf4a</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-6556 (C-19)</td><td>1:50</td></tr><tr><td>dilution rat anti-RFP</td><td>Allèle Biotechnology</td><td>ACT-CM-MRRFP10</td><td>1:300 dilution</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-chèvre IgG (H+L)</td><td>Jackson laboratories</td><td>705-605-147</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-souris IgG (H+L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21240</td><td>dilution 1:500</td></tr><tr><td>Cy3 âne anti-rat IgG</td><td>Jackson laboratories</td><td>712-165-150</td> 1<td>:500</td></tr><tr><td>microscope de dissection</td> à dilution <td>Leica Microsystems</td><td>S6F</td><td></td></tr><tr><td>microscope à épifluorescence</td><td>Leica Microsystems</td><td>M205FA</td><td></td></tr><tr><td>microscope confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM700</td><td></td></tr><tr><td>eau d’œuf</td><td></td><td></td><td>0,3 g/L de sels marins ' Océan instantané et 0,5 mM de CaSO4 dans de l’eau distillée. 
&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; </td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td></td><td></td><td>25,6 g Na2HPO4&middot ; 7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4.&nbsp ; Porter à 1 L avec de l’eau distillée. Ajuster le pH 7. Autoclave pendant 20 min à 121&deg ;C.</td></tr><tr><td>1X PBSDT,</td><td></td><td></td><td>0,2 % Triton X-100 et 0,2 % DMSO dans 1 X PBS.</td></tr><tr><td>Tampon</td><td></td><td></td> PEM <td>30,2 g POINTES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Porter à 1 L avec de l’eau distillée. Ajustez le pH 7.</td></tr><tr>Solution <td></td><td></td><td>bloquante</td><td>Mélangez 1 ml de sérum de cheval inactivé par la chaleur avec 9 ml de 1X PBSDT.</td></tr></tbody></table>

ablation spécifique des hépatocytes chez le poisson zèbre pour étudier conduit biliaire-régénération hépatique

Hepatocyte-specific Ablation in Zebrafish to Study Biliary-driven Liver Regeneration

Le foie a une grande capacité à se régénérer. Les hépatocytes, les cellules du parenchyme du foie, peut régénérer en une de deux manières: ou conduit biliaire hepatocyte--régénération du foie. Dans entraîné hépatocytes la régénération du foie, régénération des hépatocytes sont dérivés d&#39;hépatocytes préexistantes, alors que, dans la régénération conduit biliaire, de régénération des hépatocytes sont dérivées de cellules epitheliales biliaires (BEC). Pour entraîné hépatocytes la régénération du foie, il ya d&#39;excellents modèles de rongeurs qui ont contribué de manière significative à la compréhension actuelle de la régénération du foie. Cependant, rien de tel modèle de rongeur existe pour entraînée bilio-régénération du foie. Nous avons récemment rapporté sur un modèle de blessure de foie de poisson zèbre dans lequel BEC donne lieu à beaucoup hépatocytes sur une perte sévère des hépatocytes. Dans ce modèle, les hépatocytes sont spécifiquement ablation par un moyen pharmacogénétiques. Ici, nous présentons en détail les méthodes pour l&#39;ablation des hépatocytes et d&#39;analyser le processus de régénération du foie BEC-driven.Ce modèle d&#39;ablation spécifiques hépatocytes peut encore être utilisé pour découvrir les mécanismes moléculaires et cellulaires sous-jacents de conduit biliaire-régénération du foie. En outre, ces méthodes peuvent être appliquées à des écrans chimiques pour identifier de petites molécules qui inhibent ou augmentent la régénération du foie.

Mtz traitement pendant 36 heures (A36h, A représente ablation) de 3,5 à 5 dpf réduit considérablement la taille du foie (figure 1B). Après Mtz lavage, considéré comme le début de la régénération du foie (R), forte fabp10a: CFP-NTR et fabp10a: expression DsRed réapparu dans les 30 heures (figure 1B). Le réseau des voies biliaires intra-hépatique, tel qu&#39;évalué par l&#39;expression de Alcam qui est présente dans la membrane du BEC 22, d&#39;abord effondrée...

Pour aider à évaluer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la régénération biliaire du foie due au poisson-zèbre, nous avons établi un modèle de lésion hépatique dans lequel les hépatocytes exprimant la nitroréductase sont génétiquement ablatés lors d’un traitement au métronidazole. Dans ce protocole, nous décrivons comment manipuler, surveiller et analyser habilement l’ablation des hépatocytes et la régénération hépatique induite par les voies biliaires.

Ablation spécifique des hépatocytes chez le poisson zèbre pour étudier conduit biliaire-Régénération hépatique

The liver has a great capacity to regenerate. Hepatocytes, the parenchymal cells of the liver, can regenerate in one of two ways: hepatocyte- or ...

L'objectif général de cette procédure est d'induire une ablacion d'hépatocytes chez le poisson zèbre afin d'analyser la régénération hépatique dirigée par les voies biliaires. Cela est réalisé en exposant d'abord des larves transgéniques exprimant une nitro-réductase dans leurs hépatocytes au métronidazole ou MTZ. Dans une deuxième étape, le degré d'ablacion des hépatocytes est évalué en fonction de la taille relative du foie.Après le traitement par MTZ à l'étape finale, les larves dont le foie a été ablaté sont collectées ; la taille du foie ainsi que l'expression des marqueurs hépatiques dans le foie en régénération sont mesurées respectivement par microscopie de fluorescence épifluorescente et par microscopie confocale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les modèles d'activation des cellules ovales chez les rongeurs, réside dans le fait que, avec cette méthode, les hépatocytes régénérateurs proviennent principalement de cellules épithéliales biliaires. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération hépatique, comme la manière dont les cellules progénitrices biliaires ou hépatiques contribuent à la régénération du foie. En général, une personne nouvellement initiée à cette méthode éprouvera des difficultés, car la taille du foie chez les larves de poisson zèbre en dégénérescence est variable.Pour effectuer des accouplements dirigés, placer un mâle et une femelle adultes hémizygotes ou homozygotes dans un même aquarium séparé par une cloison la nuit précédente. Retirer la cloison le lendemain matin au moment souhaité pour l'accouplement, puis récupérer les embryons à l’aide d’une passoire en plastique fin. Retourner la passoire et rincer la surface du tamis à l’aide d’un filet fin d’eau pour œufs provenant d’une bouteille pression. Transférer ensuite jusqu’à 100 embryons dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant 25 millilitres d’eau pour œufs, puis placer la boîte à 28 degrés Celsius afin d’inhiber la pigmentation.Ajouter du PTU à la culture jusqu'à 10 heures. Après fécondation à 80 heures. Après personnalisation, anesthésier les larves avec de la trica et utiliser un microscope à fluorescence épifluorescence pour collecter les larves positives pour le CFP, en ne conservant que les animaux ayant des foies de taille similaire.Ensuite, remplacez l'eau des œufs trica par de l'eau fraîche d'œufs supplémentée en PTU et replacez les larves de zebrafish positives pour la CFP dans l'incubateur à 28 degrés Celsius. Pour traiter d'abord les larves de zebrafish avec du MTZ, répartissez le nombre approprié de larves dans deux récipients de culture différents. Conservez le groupe de larves expérimentales dans une solution de MTZ fraîchement préparée et le groupe témoin dans de l'eau d'œufs.Supplémenté avec du DMSO. Couvrir le groupe expérimental avec du papier d'aluminium pour éviter l'inactivation photochimique du MTZ et incuber les deux groupes de larves de poisson zèbre à 28 degrés Celsius à la fin de la période d'ablation. Retirer la solution de MTZ des plaques et laver les larves traitées au MTZ deux à trois fois avec 25 millilitres d'eau d'œufs, en vortexant puis en éliminant l'eau d'œufs après chaque lavage.Après le dernier lavage, immobiliser les larves avec la moitié de la concentration de trica utilisée précédemment afin d'éviter l'œdème cardiaque et la mort chez les larves traitées au MTZ. Ensuite, utiliser le filtre CFP sur un microscope à fluorescence épifluorescente pour évaluer les niveaux d'ablation des hépatocytes en fonction de la taille relative du foie des larves traitées au MTZ. Considérer les poissons zèbres présentant de grands foies, représentant de zéro à 5 % des larves, comme non ablatés.Ceux possédant des foies de taille moyenne, représentant 10 à 20 % des larves devant subir une ablât partielle, et ceux ayant des foies très petits, représentant 80 à 90 % des larves devant subir une ablât totale. Après avoir classé tous les animaux, identifier les larves dont le foie n'est pas ablaté ou est partiellement ablaté, en ne conservant que les poissons zèbre présentant de très petits foies, indiquant une ablât sévère des hépatocytes, pour l'analyse hépatique. Au point temporel zéro de la régénération, transférer les larves dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre.Immédiatement après l'élimination du MTZ et l'approvisionnement en CFP, remplacer l'eau des œufs par du tampon MPEM contenant 3 % de formaldéhyde pour une fixation nocturne sur un rotor à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, remplacer la solution de fixation par un millilitre de P-B-S-D-T et agiter doucement les larves pendant cinq minutes supplémentaires. Ensuite, transférer toutes les larves fixées dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant du P-B-S-D-T frais sous un microscope stéréoscopique, et utiliser des pinces pour retirer manuellement le jaune d'œuf et les nageoires péctorales une fois que toutes les larves auront été triées.Transférez jusqu'à 20 animaux dans un tube de 1,5 millilitre et remplacez le P-B-S-D-T par un millilitre de solution bloquante. Après deux heures d'agitation à température ambiante, remplacez la solution bloquante par 100 microlitres du mélange d'anticorps primaires, puis incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le jour suivant, sous agitation, éliminez la solution d'anticorps primaires et lavez les poissons zèbres avec du P-B-S-D-T selon cinq lavages de 10 minutes chacun.Après le dernier lavage, ajouter 100 microlitres d'anticorps secondaire pour une incubation de deux heures à température ambiante sous agitation. Enfin, laver les larves cinq fois dans du P-B-S-D-T comme vient d'être montré. Orienter les larves latéralement sur une lame de microscope et ajouter une goutte de milieu de montage.Ensuite, recouvrir soigneusement chaque poisson zèbre avec un lamelle et sceller le lamelle avec du vernis à ongles. Un traitement au MTZ pendant 36 heures, de 3,5 à cinq jours après la fécondation, réduit de manière spectaculaire la taille du foie. Après l'élimination du MTZ, une forte expression de CFP et de rouge réapparaît en 30 heures, comme en témoigne l'expression de LCAM dans la membrane des cellules épithéliales biliaires.Le réseau biliaire intra-hépatique s'effondre initialement, puis est rétabli 54 heures après le lavage, indiquant une régénération et une récupération hépatiques rapides. Sur ces images, des hépatocytes en cours de régénération, transgéniques pour une protéine fluorescente rouge nucléaire exprimée exclusivement dans les cellules épithéliales biliaires du foie, sont montrés ; la majorité de ces cellules positives pour H deux BM cherry dans le foie en régénération expriment HNF quatre alpha à l'heure zéro de la régénération, à l'heure quatre de la régénération C huit. Les hépatocytes traités au MTZ et positifs pour CFP conservent encore leur expression de H deux BM cherry, indiquant la conversion des cellules épithéliales biliaires en hépatocytes suite à une perte sévère d'hépatocytes.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de sélectionner complètement l'ablation après le traitement par MTT pour la régénération hépatique ultérieure lors de l'action de lyse après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régénération du foie pour explorer les mécanismes sous-jacents à la régénération hépatique dirigée par les cellules progénitrices hépatiques. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'utiliser ce modèle opérationnel spécifique aux cytes géographiques pour des études sur la dégénérescence hépatique biliaire.

hepatocyte-specific-ablation-zebrafish-to-study-biliary-driven-liver

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

L’article décrit l’ablation hépatique ciblée, une méthode pour induire la mort des hépatocytes avec du métronidazole chez les larves de poisson-zèbre transgénique. L’exemple de protocole décrit le processus de génération, de manipulation et d’évaluation de l’ablation ciblée du foie chez le poisson-zèbre.

Ablation ciblée du foie : induire la mort des hépatocytes avec du métronidazole chez des larves de poisson-zèbre transgénique

Une fibrose soutenue avec dépôt excessif de protéines de la matrice extracellulaire conduit à la cirrhose. L’abus d’alcool est l’une des principales causes de maladies graves du foie. Nous avons établi un modèle de foie fibrotique de poisson-zèbre induit par l’éthanol pour étudier les mécanismes et les stratégies de promotion de la régénération des hépatocytes lors de lésions induites par l’alcool.

Développement d&#39;un fibrotique du foie Modèle induite de l&#39;éthanol en Zebrafish pour étudier de cellules souches médiée hépatocytes Régénération

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