Ablation spécifique des hépatocytes chez le poisson zèbre pour étudier conduit biliaire-Régénération hépatique

L’objectif global de cette procédure est d’induire l’ablation des hépatocytes chez le poisson-zèbre pour l’analyse de la régénération hépatique induite par les voies biliaires. Ceci est accompli en exposant d’abord les larves transgéniques qui expriment la nitro réductase dans leurs hépatocytes à metrona ou MTZ. Dans la deuxième étape, le niveau d’ablation des hépatocytes est évalué en fonction de la taille relative du foie.

Après le traitement MTZ à l’étape finale, des larves ablées par bully avec un minuscule foie sont collectées, en fin de compte, la taille du foie et l’expression des marqueurs hépatiques dans le foie en régénération sont mesurées respectivement par épifluorescence et microscopie confocale. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme les modèles d’activation de cellules ovales de rongeurs est qu’avec cette technique, les hépatocytes régénératifs sont principalement dérivés de cellules épithéliales biliaires. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la régénération du foie, telles que comment les cellules biliaires ou progénitrices hépatiques contribuent-elles à la régénération du foie.

Pour effectuer des accouplements chronométrés, installez des poissons adultes mâles et femelles hémizygotes ou homozygotes pendant la nuit avec un séparateur entre eux. Retirez le séparateur le lendemain matin lorsque l’accouplement est souhaité, à l’aide d’une passoire à mailles fines en plastique pour récolter les embryons, retournez la passoire et utilisez une bouteille compressible pour rincer la surface de la maille avec un fin filet d’eau d’œuf. Transférez ensuite jusqu’à 100 embryons dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant 25 millilitres d’eau d’œuf, et placez la boîte à 28 degrés Celsius pour inhiber la pigmentation.

Ajoutez du PTU à la culture jusqu’à 10 heures. Post-fertilisation à 80 heures. Après la personnalisation, anesthésez les larves avec des trica et utilisez un microscope à épifluorescence pour collecter les larves positives au CFP, en ne gardant que les animaux ayant des foies de taille similaire.

Remplacez ensuite l’eau de l’œuf trica par de l’eau d’œuf fraîche complétée par du PTU et remettez les larves de poisson-zèbre positives au CFP dans l’incubateur à 28 degrés Celsius. Pour traiter d’abord les larves de poisson-zèbre avec du MTZ, divisez le nombre approprié de larves dans deux récipients d’élevage différents. Conservez le groupe larvaire expérimental dans une solution de MTZ fraîchement préparée et le groupe témoin dans de l’eau d’œuf.

Complété par du DMSO. Couvrez le groupe expérimental avec une feuille d’aluminium pour éviter la photo-inactivation du MTZ et incubez les deux groupes de larves de poisson-zèbre à 28 degrés Celsius à la fin de la période d’ablation. Retirez la solution MTZ des plaques et lavez les larves traitées MTZ deux à trois fois avec 25 millilitres d’eau d’œuf et en remuant en jetant l’eau d’œuf après chaque lavage.

Après le dernier lavage, immobiliser les larves avec la moitié de la concentration de trica précédemment utilisée pour éviter l’œdème cardiaque et la mort chez les larves traitées par MTZ. Ensuite, utilisez le filtre CFP sur un microscope à épifluorescence pour évaluer les niveaux d’ablation des hépatocytes en fonction de la taille relative du foie des larves traitées par MTZ. Considérons le poisson zèbre avec de gros foies représentant de zéro à 5 % des larves à non ablation.

Ceux avec des foies de taille moyenne représentant 10 à 20 % des larves à ablater partiellement et ceux avec des foies très petits représentant 80 à 90 % des larves à ablater complètement. Après avoir classifié tous les animaux, découvrez les larves avec des foies non ablatés ou partiellement ablatés, ne gardant que les poissons zèbres avec des foies minuscules indiquant une ablation hépatocytaire sévère pour l’analyse du foie. Au point de régénération de l’heure zéro, transférez les larves dans un microtube à centrifuger de 1,5 millilitre.

Immédiatement après le lavage MTZ et l’approvisionnement en CFP, remplacez l’eau de l’œuf par un tampon MPEM à 3 % de formaldéhyde pour une fixation nocturne sur un rotor de quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, remplacez la solution de fixation par un millilitre de P-B-S-D-T et faites pivoter les larves pendant cinq minutes supplémentaires. Ensuite, placez toutes les larves fixes dans une boîte de Pétri de 100 millimètres contenant du P-B-S-D-T frais sous un microscope de dissection et utilisez une pince pour retirer manuellement le vitellus et les nageoires pectorales lorsque toutes les larves ont été coupées.

Transférez jusqu’à 20 animaux dans un tube de 1,5 millilitre et remplacez le P-B-S-D-T par un millilitre de solution de blocage. Après deux heures sur le rotateur à température ambiante, remplacez la solution de blocage par 100 microlitres du cocktail d’anticorps primaires pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius. Avec le balancement le lendemain, retirez la solution d’anticorps primaire et lavez le poisson zèbre avec P-B-S-D-T pendant cinq lavages de 10 minutes.

Après le dernier lavage, ajoutez 100 microlitres de l’anticorps secondaire pour une incubation de deux heures à température ambiante avec balancement. Enfin, lavez les larves cinq fois dans P-B-S-D-T comme nous venons de le démontrer. Orientez les larves latéralement sur une lame de microscope et ajoutez une goutte de support de montage.

Ensuite, couvrez soigneusement chaque poisson zèbre avec un verre de protection et scellez le verre de couverture avec du vernis à ongles. Le traitement MTZ pendant 36 heures de 3,5 à cinq jours après la fécondation réduit considérablement la taille du foie. Après le lavage de la MTZ, une forte expression de CFP et de rouge réapparaît dans les 30 heures, comme l’évalue l’expression de la LCAM dans la membrane des cellules épithéliales biliaires.

Le réseau biliaire intrahépatique s’effondre d’abord, mais est ensuite rétabli 54 heures après le lavage, ce qui indique une régénération et une récupération rapides du foie. Dans ces images, on voit que la plupart de ces cellules H, deux BM positives positives dans le foie en régénération expriment HNF quatre alpha à l’heure de régénération zéro à l’heure quatre C huit. Les hépatocytes positifs à la CFP traités par MTZ conservent toujours leur expression de cerise H two BM, indiquant la conversion des cellules épithéliales biliaires en hépatocytes en cas de perte sévère d’hépatocytes.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de sélectionner une ablation complète après le traitement MTT pour la régénération hépatique ultérieure à la lyse. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la régénération du foie pour explorer les mécanismes sous-jacents au progéniteur du foie, la régénération du foie induite par les cellules. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser ce modèle de fonctionnement spécifique aux cytes géographiques pour les études de dégénérescence hépatique pilotées par bilio.