Name: Chick Coeur Invasion Assay pour tester les techniques invasives des cellules cancéreuses et lactivité des composés potentiellement anti-invasives (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Découvrez une méthode de culture d'organes pour étudier l'invasion tumorale en trois dimensions en utilisant des fragments de cœur de poulet embryonnaire. Cette technique permet d'évaluer l'efficacité des médicaments anti-invasifs.

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Nous remercions Marleen De Meulemeester d’avoir démontré la technique de dosage dans le film vidéo. B. I. R. est chercheur postdoctoral à la Fondation pour la recherche en Flandre (FWO – Flandre). L.M.M. est récipiendaire d’une bourse Emmanuel van der Schueren de la Ligue flamande contre le cancer (Vlaamse Liga tegen Kanker).

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Pendant la préparation de PHF, les fragments ne peuvent pas rester en suspension, mais adhérer à la paroi de la cuve; cela peut être surmonté en augmentant le volume du milieu de culture. Si le nombre de PHF est trop faible et leur taille est trop grande, diminuer le volume du milieu de culture. La défaillance des cellules de test pour agréger peut être due aux fluctuations de la température ou à une infection microbienne. En variante, une incapacité à se regrouper peut être une caractéristique intrinsèque des cellules....

Invasion est la marque de tumeurs malignes. Cette activité conduit non seulement à la destruction des tissus environnants, mais est également impliquée dans la formation de métastases. Étant donné que les patients cancéreux meurent de l&#39;invasion et la métastase, et les traitements anti-invasives sont encore efficaces, des essais de laboratoire rares qui imitent l&#39;invasion de cellules tumorales ont été développés. L&#39;objectif de l&#39;essai de coeur de poulet est de proposer une méthode de culture d&#39;organes pertinents pour étudier l&#39;invasion tumorale en trois dimensions. L&#39;essai peut distinguer entre les cellules invasives et non invasives, et permet d&#39;étudier les effets des composés d&#39;essai sur l&#39;invasion tumorale. La raison derrière l&#39;utilisation de l&#39;essai est le concept même que les tumeurs sont des écosystèmes où les cellules néoplasiques interagissent en permanence avec leur stroma (cellules hôtes et la matrice extracellulaire), et que, grâce à ces interactions moléculaires invasion est affiné 1. Ainsi, dans le test des cellules tumorales sont confrontés à livifragments embryonnaires de poussin cardiaques ng deux, qui servent non seulement en tant que substrats pour l&#39;invasion par les cellules tumorales, mais également en tant que source de différents types de cellules stromales et les éléments de matrice. Le cœur de poussin contient les myocytes, les fibroblastes et les cellules endothéliales et la matrice extracellulaire est constituée de la laminine, la fibronectine et les différents types de collagène. De cette façon, la technique de culture d&#39;organe tridimensionnel couvre de nombreuses interactions cellulaires et moléculaires impliqués dans l&#39;invasion des tumeurs de patients. Le principal avantage de l&#39;essai de coeur de poulet est la mise en œuvre des effets stromales. Cet aspect est plus complète que dans les autres essais d&#39;invasion in vitro qui sont basés sur l&#39;invasion des cellules tumorales dans des gels non vivants constitués de membrane basale trois ou quatre matrice interstitielle des molécules. Le concept de la confrontation entre les cellules tumorales et les tissus de l&#39;hôte de la vie normale que l&#39;on trouve dans la culture d&#39;organes expérimentation a été introduite par plusieursauteurs y compris Wolff et Schneider en France 5, Easty et Easty au Royaume-Uni 6 et 7 Schleich en Allemagne. Deux avantages techniques de l&#39;invasion dosage de coeur de poulet sur les méthodes citées est que le volume des fragments peut facilement être normalisé, et qu&#39;ils restent contractile, qui permet la surveillance de l&#39;intégrité fonctionnelle pendant la culture d&#39;organes. En outre, les embryons aviaires sont préférés, car ils peuvent être facilement disséquées à partir du contenu stérile de l&#39;œuf. L&#39;essai a ressemblance conceptuelle pour le poussin chorio-allantoïde membrane dosage 8 en offrant un stroma complexe environnante pour les cellules tumorales. L&#39;essai a été appliquée avec succès à la distinction entre les variants de cellules invasives et non invasives des mêmes tumeurs humaines comme dans la MCF-7 (mammaire) 9 et HCT-8 (côlon) 10 familles de lignée cellulaire. La technique est utile pour tester des composés potentiellement anti-invasives ainsi <sup&gt; 11,12. Comme expliqué plus loin, il peut être utilisé pour l&#39;établissement de relations structure-activité des petites molécules organiques. L&#39;essai ne cependant pas tenir compte de la contribution des cellules immunologiques à l&#39;invasion du cancer. Il convient de souligner que la technique ne peut pas être considéré comme un système d&#39;analyse à haut débit, en raison du nombre élevé de manipulations, le nombre limité de séries de dosage (maximum 30 cultures) et le long temps de demi-tour (environ 1 mois).

<table><tbody><tr><td>Solution saline de Ringer</td><td>Braun</td><td>CEO123</td><td></td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar</td><td>VWR</td><td>103157P</td><td></td></tr><tr><td>BSA : albumine de sérum bovin, cohn V fract.</td><td>Sigma</td><td>A4503-500G</td><td></td></tr><tr><td>MEM-Rega 3</td><td>Life Technologies&nbsp ;</td><td></td><td></td>19993013</tr><tr><td>Agitateurs gyrotory</td><td>New Brunswick Scientific</td><td>G10 et G33</td><td></td></tr><tr><td>Fioles Erlenmeyer 50 ml</td><td>Novolab</td><td>92717</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri en verre</td><td>Novolab</td><td>68516</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux d’iridectomie</td><td>Rumex</td><td>11-0625</td><td></td></tr><tr><td>Macroscope avec grille oculaire calibrée</td><td>Wild</td><td>157702</td><td></td></tr><tr><td>Cire de paraffine</td><td>International Medical products</td><td>8599956</td><td></td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>230251-25g</td><td></td></tr><tr><td>Hématoxyline de Harris</td><td>Sigma</td><td>HHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>Résine de lamelle (Tissue-Tek)</td><td>Sakura</td><td>4494</td><td></td></tr><tr><td>Appareil de fusion de paraffine</td><td>GFL</td><td>1052</td><td></td></tr><tr><td>Microtome pour sectionnement de la paraffine</td><td>Reichert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stppers pour flacons Erlemeyer avec entrées et sorties de gaz</td><td>Novolab</td><td>2602421 et 260243</td><td></td></tr><tr><td>Diaminobenzidine</td><td>Sigma</td><td>D8001</td><td></td></tr><tr><td>REAX Table à bascule</td><td>Heidolph</td><td>54131</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes en tissu à 24 puits</td><td>VWR</td><td>NUNC142475</td><td></td></tr><tr><td>Cuillère d’énucléation ophtalmologique</td><td>Rumex</td><td>16-060</td><td></td></tr><tr><td>Pince tranchante</td><td>Rumex</td><td>4-111T</td><td></td></tr><tr><td>Pince émoussée</td><td>Nickel-Electro LTD</td><td>7112</td><td></td></tr><tr><td>Fioles Erlenmeyer 5 ml</td><td>Novolab</td><td>211901</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope lavées et dégraissées</td><td>International Medical</td><td>products 8613908</td><td></td></tr></tbody></table>

chick coeur invasion assay pour tester les techniques invasives des cellules cancéreuses et l&#39;activité des composés potentiellement anti-invasives

Chick Heart Invasion Assay for Testing the Invasiveness of Cancer Cells and the Activity of Potentially Anti-invasive Compounds

L&#39;objectif de l&#39;essai de coeur de poulet est de proposer une méthode de culture d&#39;organes pertinents pour étudier l&#39;invasion tumorale en trois dimensions. L&#39;essai peut distinguer entre les cellules invasives et non invasives, et qui permet l&#39;étude des effets des composés d&#39;essai sur l&#39;invasion tumorale. Les cellules cancéreuses - soit comme des agrégats ou des cellules individuelles - sont confrontés à des fragments de coeur de poussin embryonnaire. Après culture d&#39;organes en suspension pendant quelques jours ou quelques semaines, les cultures sont fixées et auxquels sont confrontés noyés dans de la paraffine pour une analyse histologique. L&#39;interaction à trois dimensions entre les cellules cancéreuses et les tissus normaux est ensuite reconstruit à partir de coupes sériées colorées à l&#39;hématoxyline-éosine ou après coloration immunohistochimique pour des epitopes dans le tissu cardiaque ou les cellules cancéreuses se posent. L&#39;analyse est compatible avec la notion que récente invasion du cancer est le résultat d&#39;interactions moléculaires entre les cellules cancéreuses et leurs éléments d&#39;accueil du stroma voisin (myofibroblastes, endothElial cellules, des composants de la matrice extracellulaire, etc.). Ici, cet environnement stromal est offerte aux cellules cancéreuses en tant que fragment de tissu vivant. Aspects de soutien à la pertinence de l&#39;essai sont multiples. Invasion dans le dosage est en conformité avec les critères de l&#39;invasion du cancer: l&#39;occupation et le remplacement progressif dans le temps et l&#39;espace du tissu hôte, et le caractère invasif et non invasif in vivo des cellules se posent généralement corrélée avec les résultats de l&#39;essai. En outre, le motif de l&#39;invasion des cellules in vivo, tel que défini par les pathologistes, se reflète dans les images histologiques dans le dosage. Quantitative relation structure-activité (QSAR) l&#39;analyse des résultats obtenus avec de nombreux composés potentiellement anti-invasives congénères organiques a permis l&#39;étude des relations structure-activité pour les flavonoïdes et les chalcones, et les médicaments anti-métastatiques connus utilisés dans la clinique (par exemple, les inhibiteurs des microtubules ) inhibent l&#39;invasion dans le dosage ainsi. However, l&#39;analyse ne tient pas compte des contributions immunologiques à l&#39;invasion du cancer.

Les coupes histologiques telles que présentées dans la figure 5 montrent le résultat d&#39;un certain nombre de tests réussis d&#39;extrémité. L&#39;histologie bruit des cultures indique cellules viables et permet d&#39;interpréter l&#39;interaction entre les cellules tumorales et des tissus normaux. En outre, aucune réaction immunitaire du tissu normal peut être observée, ce qui confirme que l&#39;âge exact des embryons de poulet utilisés, par exemple, avant que le système de rejet immunitaire est développé. I...

Ici, nous présentons un protocole d&#39;étudier l&#39;invasion des cellules tumorales dans des fragments de tissus normaux vivant en trois dimensions. Cette technique de culture d&#39;organe est principalement appliqué pour tester des médicaments potentiellement anti-invasif in vitro.

Chick Coeur Invasion Assay pour tester les techniques invasives des cellules cancéreuses et l&#39;activité des composés potentiellement anti-invasives

The goal of the chick heart assay is to offer a relevant organ culture method to study tumor invasion in three dimensions. The assay can distinguish ...

L'objectif général de cette procédure est de proposer une méthode de culture d'organes pertinente pour l'étude de l'invasion tumorale en trois dimensions. Cela est réalisé en préparant tout d'abord des fragments de tissus normaux obtenus à partir de cœurs de poulet embryonnaires. Dans une deuxième étape, des agrégats de cellules tumorales sont préparés en suspension.Les agrégats de cellules tumorales sont ensuite mis individuellement en confrontation avec les fragments de tissu normal sur un lit d'agar semi-solide, puis incubés en culture en suspension. Dans la dernière étape, les cultures confrontées sont fixées pour être incluses dans la paraffine et sectionnées histologiquement. Enfin, l'envahissement des cellules tumorales dans les fragments de tissu peut être visualisé par une analyse microscopique en série des coupes tissulaires.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que les tests d'envahissement avec des gels, est qu'elle met en présence des cellules tumorales et des fragments de tissu vivant tridimensionnels. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie du cancer, car il existe un besoin non satisfait de médicaments anti-invasifs. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, et la raison en est qu'elles négligent l'importance d'utiliser des dimensions spécifiques pour les fragments de tissu et pour les agrégats de cellules tumorales.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur l'invasion cancéreuse, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes. Par exemple, l'étude de l'invasion des tissus périphériques par les cellules inflammatoires ou l'intégration des cellules souches dans le tissu cardiaque. Dans la culture supreme, les fragments de cœur de poulet commencent par une incubation d'un œuf fécondé à 37 degrés Celsius pendant neuf jours.Le neuvième jour, désinfecter la coquille avec de l'éthanol à 70 %. Puis, dans une cabine de culture tissulaire, utiliser une pince émoussée pour ouvrir la coquille. Ensuite, positionner une cuillère à énucléation autour du cou de l'embryon et extraire l'embryon de la coquille.Placer l'embryon dans une boîte de Pétri en verre de cinq centimètres contenant cinq millilitres de solution saline de Ringer. Ensuite, tenir une pince fine dans chaque main. Ouvrir la peau thoracique ventrale, retirer le sternum et utiliser des ciseaux d'iridectomie pour disséquer le cœur et sectionner ses principaux vaisseaux sanguins.Transférez le cœur dans une nouvelle boîte de Pétri en verre de cinq centimètres contenant cinq millilitres de milieu de culture, supplémenté avec 5 % de sérum de veau fœtal, sous un microscope équipé d'une grille oculaire étalonnée. À l’aide de ciseaux de microdissection, résectionnez le tiers crânien supérieur du cœur afin d’éliminer les oreillettes et les vaisseaux associés.Ensuite, utilisez une pince fine pour disséquer le péricarde à partir des ventricules. Puis, réalisez une hémissection sagittale des ventricules et retirez le sang. Transférez ensuite les ventricules dans une autre boîte de Pétri de cinq centimètres contenant cinq millilitres de milieu de culture frais et de sérum bovin fœtal, et découpez le tissu en morceaux de 0,4 millimètre de diamètre.Lorsque tous les ventricules ont été coupés, faites tourner doucement la boîte pour diriger tous les fragments vers le centre du plat. Ensuite, utilisez une aiguille en acier inoxydable pour déplacer toutes les Cora Eliana vers la périphérie de la boîte de Pétri. Utilisez maintenant une pipette Pasteur en verre pour transférer les fragments cardiaques dans un ballon Erlenmeyer de 50 millilitres recouvert d'une fine pellicule de culture.Gazez le flacon avec 5 % de dioxyde de carbone et incubez les fragments sur un agitateur rotatoire à 37 degrés Celsius à 70 tours par minute pendant 24 heures. Le lendemain, transférez les fragments dans une boîte de Pétri et utilisez une aiguille pour éliminer les Corpora Eliana, les fragments nécrotiques sombres et tous les agrégats tissulaires. Incubez les fragments dans un flacon Erlenmeyer de 50 millilitres contenant six millilitres de milieu de culture sur l’agitateur rotatoire pendant encore 60 heures ; deux jours et demi plus tard, utilisez le microscope et les aiguilles pour sélectionner les fragments stéroïdiens qui présentent une fine couche homogène de cellules fibroblastiques et un diamètre de 0,4 millimètre.Transférez ensuite les fragments cardiaques préalablement cultivés dans une autre boîte de Pétri contenant du milieu de culture frais. Trois jours avant le début de la culture confrontante, suspendez 100 000 cellules-tests par millilitre dans six millilitres de milieu de culture approprié dans un flacon Erlenmeyer de 50 millilitres. Incubez ensuite le flacon sur un agitateur rotatoire à 37 degrés Celsius et 70 tours par minute, avec le pourcentage approprié de dioxyde de carbone.Après 72 heures, observer les agrégats au microscope et sélectionner les agrégats cellulaires stéroïdiens ayant un diamètre de 0,2 millimètre. Ensuite, transférer huit fragments cardiaques pré-cultivés de 0,4 millimètre, suspendus dans une quantité minimale de milieu de culture, dans une boîte de Pétri embryologique contenant un milieu d'agar semi-solide.Déplacez les fragments en cercle et utilisez un petit morceau de papier filtre pour aspirer le milieu excédentaire. Placez 10 agrégats cellulaires stéroïdiens de 0,2 millimètre dans le cercle. Après avoir retiré le milieu excédentaire, déplacez un agrégat vers chacun des fragments cardiaques préalablement cultivés jusqu’à ce qu’ils entrent en contact.Scellez à présent le couvercle de la boîte de Pétri avec du paraffine et incubez la coculture à 37 degrés Celsius pendant quatre à 24 heures, selon les propriétés adhésives des cellules testées aux fragments cardiaques préalablement cultivés. À la fin de l'incubation, immergez chaque paire confrontée dans un milieu de culture préchauffé à 37 degrés Celsius, puis utilisez une pipette Pasteur pour transférer chaque paire dans des flacons coniques d’Erlenmeyer de cinq millilitres contenant chacun 1,5 millilitre de milieu de culture. Incubez ensuite les flacons sur un agitateur rotatoire à 37 degrés Celsius et 120 tours par minute, en faisant circuler le pourcentage approprié de dioxyde de carbone. Deux flacons coniques supplémentaires de cinq millilitres, remplis chacun de deux millilitres de solution saline de Ringer, sont prévus pour l’analyse histologique des confrontations.À la fin de la période d'incubation, transférez les cultures dans une solution saline de Ringer pendant quelques secondes afin d'éliminer les protéines sériques. Ensuite, transférez les poires dans des boîtes de Pétri individuelles de trois centimètres contenant trois millilitres de solution Bowen Holland. Après deux heures, rincez les cultures trois fois dans trois millilitres d'eau déminéralisée avant de les incuber dans de l'eau du robinet pendant deux heures afin d'éliminer autant que possible la solution fixative.Enfin, transférez les paires dans trois millilitres d'éthanol à 70 % chacun pendant plusieurs jours au maximum. Sur ces images de cultures réussies, aucune réaction immunitaire par les tissus normaux n'est observée, ni dans le tissu tumoral ni dans le tissu cardiaque, ce qui confirme que les embryons de poulet ont été utilisés avant le développement du système de rejet immunitaire. Aucune bactérie n'est non plus visible, indiquant l'absence de contamination importante pendant la période de culture.En outre, le pourtour arrondi des sections confirme que les cultures ont été maintenues en suspension, sans signe d'adhérence temporaire à la paroi de la fiole Erla mire. De nombreux composés ont été testés à l'aide de cet essai d'envahissement cardiaque de poulet. Pour ceux qui étaient structurellement apparentés, une relation quantitative entre structure et activité a été établie à partir des résultats de l'essai, les données montrant une corrélation nette entre les activités anti-envahissantes prédites et expérimentales.En effet, cette matrice de confusion peut être utilisée pour résumer les points faibles et les points forts du test, donnant une indication approximative de la précision et de la reproductibilité de l'expérience. Lors de la mise en œuvre de cette nouvelle procédure, il est extrêmement important de respecter strictement les dimensions prescrites des fragments de tissu en suivant cette procédure. D'autres méthodes, comme la confrontation avec des cellules non cancéreuses, peuvent être réalisées pour répondre à des questions supplémentaires, telles que : Les cellules inflammatoires envahissent-elles le tissu ?Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment distinguer les cellules tumorales invasives des cellules non invasives. N'oubliez pas que le travail avec des fixateurs peut être extrêmement dangereux et que des précautions, telles que la ventilation de l'air, doivent être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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