Name: À faire et à ne pas faire dans la préparation de Muscle cryosections pour lanalyse histologique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Apprenez la préparation de cryosections musculaires pour l'analyse histologique en évitant les artéfacts de congélation. Cette méthode rapide préserve l'intégrité tissulaire et permet une évaluation précise de la biologie musculaire.

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Nous tenons à remercier Alex Miller pour les révisions du manuscrit. Ce travail a été soutenu par les subventions de recherche accordées à M.G. par Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) et Muscular Dystrophy Association (218938).

1. Tissue récolte et de congélation des tissus musculaires <ol><li> Euthanasier la souris avec une dose excessive de l&#39;isoflurane (2-chloro-2- (difluorométhoxy) -1,1,1-trifluoro-éthane). Effectuez cette étape dans une hotte et utiliser une méthode de confinement secondaire comme un dessiccateur ou une cloche de verre contenant un coton-tige imbibé d&#39;isoflurane. </li><li> Confirmer la mort en serrant fermement coussinet plantaire. Utilisez une méthode secondaire de l&#39;euthanasie telle que la dislocation cervicale. </li><li> Mouiller la fourrure avec 70% d&#39;alcool pour réduire le collage des mèches de cheveux en vrac sur les muscles. Peler la peau du membre en utilisant une pince fine tels que # 5. </li><li> Séparez délicatement le muscle d&#39;intérêt (jambier antérieur (TA) dans ce cas) à partir des os en dessous, à partir du tendon et à enlever. </li><li> Exciser le muscle, le couvrir dans l&#39;OCT (coupe optimale du composé Température), et posez-le à plat sur un moule de congélation jetable marqué. Assurez-vous que le muscle est à son orientation physiologique normal (tête tail) sans étirement. Alternativement, geler le muscle sur des petits carrés de mousse de polystyrène et l&#39;épingler en utilisant des épingles insectes pour assurer la bonne longueur des muscles. </li><li> Réfrigérer 2-méthylbutane (isopentane) dans un bêcher en acier avec de l&#39;azote liquide. Cela prend en moyenne de 3 - 5 min. Gardez en remuant de façon intermittente jusqu&#39;à précipités blancs commencent à se former sur le fond et les parois du bécher. REMARQUE: Lorsque cela se produit, l&#39;isopentane a atteint la température de congélation optimale (-150 ° C) </li><li> Trempez les moules contenant muscles dans le réfrigérée 2-méthylbutane. Congeler petits muscles comme le muscle long extenseur des orteils diaphragme et (EDL) pour les 6 - 12 sec et gros muscles comme le soléaire gastrocnémien (GS) et les triceps pour 15 - 20 sec. Ne pas congeler les muscles trop longtemps car cela pourrait conduire à la fissuration. </li><li> Transférer les tissus congelés sur de la glace sèche et laissez évaporer isopentane (à noter que ce processus prend en moyenne environ 15 - 20 min). Envelopper les tissus dans du papier aluminium et les stocker à ultra basse température (-70 ° C à -80 ° C) jusqu&#39;à ce que le sectionnement. </li></ol> 2. Intégrer les tissus dans PTOM Préparer bloc de tissu <ol><li> tissus de transport sur la glace sèche pour cyrostat pour éviter la décongélation. tissu Transfert à cryostat chambre (mis à -20 à -24 ° C pour éviter la décongélation complète des tissus) et les laisser équilibrer pendant 30 min. </li><li> Tournez la baie de refroidissement Peltier sur. Si le cryostat ne possède pas ce refroidissement, utiliser un aérosol de refroidissement pour congeler rapidement les PTOM. Ne laissez pas le dégel musculaire à tout moment au cours de l&#39;incorporation car cela peut entraîner des dommages dus au gel. </li><li> Ajouter une couche mince et uniforme de l&#39;OCT sur le disque de l&#39;échantillon et le laisser refroidir. Lorsque la plupart des PTOM est gelé sur le fond tout en liquide sur le dessus, insérez le tissu à l&#39;orientation correcte (perpendiculaire PTOM pour les sections transversales et parallèles PTOM pour les sections longitudinales). Utilisez un aérosol de refroidissement pour congeler rapidement octobre Touchez la partie unembeded du tissu avec poste de chaleurractor et attendre 45 sec. </li><li> Ajoutez une autre couche mince de l&#39;OCT autour du muscle, vaporiser avec un aérosol de refroidissement et d&#39;extraire la chaleur comme dans l&#39;étape précédente. </li><li> Continuez à ajouter des PTOM petits incréments et rapidement geler les PTOM en utilisant une combinaison d&#39;aérosol et d&#39;un extracteur de chaleur de refroidissement jusqu&#39;à ce que le muscle entier est couvert. </li><li> Mettre l&#39;extracteur de chaleur sur le dessus du bloc de tissu et attendre 5 min. </li></ol> 3. Préparer Sections et identifier les sections à partir de mi-ventre Région des Muscles <ol><li> Placer le spécimen sur la tête de l&#39;objet. Serrez la molette pour fixer le disque. Assurez-vous que la platine est en bon contact avec la tête de l&#39;objet. </li><li> Réglez la température de la chambre à entre -21 et -24 ° C et attendre jusqu&#39;à ce que la température de consigne est atteint. </li><li> Réglez les paramètres d&#39;épaisseur (7 pm); couper le bloc en avançant ou en rétractant le bloc en utilisant les réglages grossiers et fins. </li><li> Recueillir les sectionspréchauffée sur des lames de microscope chargées positivement en appuyant sur la partie supérieure de la glissière sur les sections, en utilisant l&#39;attraction entre les charges opposées pour faciliter l&#39;adhérence des sections de coupe de la lame. </li><li> Identifier les sections à mi-ventre par mesure de surface en coupe transversale (CSA) des sections. Pour ce faire, le logiciel d&#39;imagerie à l&#39;aide de l&#39;ordinateur qui est connecté au microscope. REMARQUE: des images à contraste de phase sont prises et la circonférence de l&#39;ensemble du muscle est mesurée via une fonction de traçage sur le logiciel. Cela donnera à la fois la CSA ainsi que diamètre minimum de furet (mesure des fibres taille transversale qui est exprimé comme la plus petite distance entre deux tangentes parallèles sur les côtés opposés d&#39;une particule) mesures. Remarque: Lors de la CSA et de diamètre de furet minimum mesures commencent à plateau, mi ventre a été atteint. </li><li> Inventaire et archiver les diapositives à -80 ° C pour la coloration avenir. REMARQUE: octobre n&#39;a pas besoin d&#39;être enlevé avant staininprocédures de g. Lorsque les lames sont sous une lamelle, ils sont prêts à être colorées immédiatement. </li></ol> 4. Coloration REMARQUE: Bien que les procédures détaillées étape par étape peuvent être trouvés sur la feuille de données du produit et doivent être suivies pour les procédures de coloration, l&#39;optimisation personnelle peut être nécessaire pour obtenir une coloration optimale. <ol><li> Parce que les médias de montage (voir tableau) est non miscible à l&#39;eau, déshydrater diapositives en augmentant les qualités d&#39;alcool (2 min chacun à 70%, 95% et 100% d&#39;éthanol) et les effacer avec du xylène (100% pendant 5 min) pour assurer diapositives ne deviennent pas opaque au fil du temps. </li><li> Lamelle sections et les laisser sécher. Image avec microscope équipé d&#39;un logiciel d&#39;imagerie. </li></ol>

<ol><li>Bonnemann, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnostic+approach+to+the+congenital+muscular+dystrophies%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+disorders+%3A+NMD%22%5BJournal%5D)">Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies.</a> Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).</li>
<li>Caughey, J. E., Pachomov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diaphragm+in+dystrophia+myotonica%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The diaphragm in dystrophia myotonica.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 22, 311-313 (1959).</li>
<li>Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscular+dystrophy.+I.+History%2C+clinical+status%2C+muscle+strength%2C+and+biopsy+findings%5BTitle%5D)+AND+%22AMA+J+Dis+Child%22%5BJournal%5D)">Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings.</a> AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).</li>
<li>Platzer, A. C., Chase, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histologic+Alterations+in+Preclinical+Mouse+Muscular+Dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy.</a> The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).</li>
<li>Mercuri, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+magnetic+resonance+imaging+involvement+in+muscular+dystrophies+with+rigidity+of+the+spine%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine.</a> Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).</li>
<li>Tasca, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+molecular+signatures+in+magnetic+resonance+imaging-staged+facioscapulohumeral+muscular+dystrophy+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles.</a> PloS one. 7, e38779(2012).</li>
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<li>Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle-specific+expression+of+insulin-like+growth+factor+1+improves+outcome+in+Lama2Dy-w+mice%2C+a+model+for+congenital+muscular+dystrophy+type+1A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A.</a> Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).</li>
<li>Mehuron, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+matricellular+proteins+is+an+early+signature+of+pathology+in+laminin-deficient+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+muscle%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy.</a> Skeletal muscle. 4, 14(2014).</li>
<li>Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+regeneration+and+tackling+apoptosis%3A+a+combinatorial+approach+to+treating+congenital+muscular+dystrophy+type+1+A%5BTitle%5D)+AND+%22Human+molecular+genetics%22%5BJournal%5D)">Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A.</a> Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).</li>
<li>Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraffin+wax+embedded+muscle+is+suitable+for+the+diagnosis+of+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+clinical+pathology%22%5BJournal%5D)">Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy.</a> Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).</li>
<li>Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formaldehyde+fixation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+%26+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Formaldehyde fixation.</a> Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 33, 845-853 (1985).</li>
<li>Maccarty, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Diagnostic+Reliability+of+Frozen+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+pathology%22%5BJournal%5D)">The Diagnostic Reliability of Frozen Sections.</a> The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).</li>
<li>Shi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+value+of+frozen+tissue+section+used+as+%27gold+standard%27+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Pathol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry.</a> Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).</li>
<li>Turan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+frozen+sections+for+intraoperative+diagnosis+of+complex+atypical+endometrial+hyperplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Pacific+journal+of+cancer+prevention+%3A+APJCP%22%5BJournal%5D)">Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia.</a> Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Histologie et immunohistochimie ont été utilisés comme outils essentiels à la compréhension de la manifestation et l&#39;évolution de la pathologie dans divers troubles neuromusculaires. Classiquement, les biopsies musculaires ont d&#39;abord été fixés dans du formol puis intégrés avec de la cire de paraffine. Le formaldéhyde fixation préserve l&#39;architecture des tissus et permet le stockage de tissus et de transport à température ambiante, il inactive également des enzymes et protéines reticulations nécessitant des ...

L&#39;examen de l&#39;histologie des muscles joue un rôle critique dans la compréhension des différents types de troubles neuromusculaires 4.1. Lorsqu&#39;il est combiné avec d&#39;autres techniques, il permet aux chercheurs d&#39;obtenir une meilleure idée de la manifestation et de la progression de la pathologie et peuvent aussi être essentiel pour évaluer l&#39;efficacité d&#39;une intervention thérapeutique 5-10. Toutefois, pour être précis, les tissus doivent être préservées de la manière appropriée afin de préserver immédiatement l&#39;état physiologique avant l&#39;excision. Cela exige un grand soin lors de l&#39;enlèvement, de la préservation, de sectionnement et coloration. Les tissus peuvent être préparés de deux façons différentes pour étude au microscope optique. La première méthode, fixés au formol (FFPE) paraffine sections, embarqué nécessite tissus à fixer dans les 10% de formaldéhyde tamponnée naturelle avant d&#39;être intégré avec la cire de paraffine 11,12. L&#39;étape de fixation permet de préserver la morphologie mieux, mais aussi des liens croisés pr endogèneoteins nécessitant ainsi des procédures de récupération d&#39;antigène complexe pour un marquage et d&#39;éliminer la possibilité de coloration enzymatique sur ces articles 12. Coupes congelées, d&#39;autre part, ne doivent pas être pré-fixe ou traitées; par conséquent, les protéines sont capables de retenir des conformations natives 13,14 biologiques. En outre, des coupes congelées permettent également un gain de temps, ce qui est parfois nécessaire, par exemple dans le diagnostic peropératoire de sarcomes et autres biopsies chirurgicales 15. Toutefois, si ne pas fait correctement, cette méthode est sujette à des dommages par congélation, qui apporte des modifications à l&#39;architecture musculaire rendant les sections impropres à l&#39;examen histologique. Ce document décrit la méthode la plus efficace pour préparer des biopsies musculaires afin de parvenir à coloration optimale pour examen approprié.

<table><tbody><tr><td>Cryostat</td><td>Leica CM 1850</td><td>Leica Microsystems Inc.</td><td>Buffalo Grove, IL 60089 États-Unis, téléphone bureau 1-800-248-0123 Alternative : Richard Allen Scientific</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon Eclipse 50i</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 États-Unis, Téléphone : 1-631-547-8500 Alternative : Olympus</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse d’images</td><td>Logiciel d’imagerie Nikon Logiciel d’imagerie Recherche fondamentale</td><td>Nikon Instruments Inc.</td><td>1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, États-Unis, Téléphone : 1-631-547-8500 Alternatives : Image J, Metamorph</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>14043-220-05</td><td>JD Medical Dist. Co., Inc.</td><td>1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 États-Unis</td></tr><tr><td>OCT</td><td>4583</td><td>Sakura Inc.</td><td>Torrence, CA 90501 U.S.A. Source alternative : Leica Microsystem</td></tr><tr><td>Freeze It</td><td>23-022524</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Source alternative : VWR</td></tr><tr><td>Scientific Moule en tissu jetable</td><td>22-363-554</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific</td></tr><tr><td>Colorfrost plus slides</td><td>9991001</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>650501-4L</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific</td></tr><tr><td>Alcool éthylique</td><td>HC-1300-1GL</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific</td></tr><tr><td>2-methyl butane</td><td>M 32631-SL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific</td></tr><tr><td>Xylene</td><td>HC-7001GA</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific</td></tr><tr><td>Cytoseal 280</td><td>8311-4</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific</td></tr><tr><td>Hematoxylin Gill #3</td><td>CS402-1D</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific</td></tr><tr><td>Eosin</td><td>6766007</td><td>Thermofisher</td><td>790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Source alternative : VWR Scientific</td></tr></tbody></table>

À faire et à ne pas faire dans la préparation de muscle cryosections pour l&#39;analyse histologique

Do's and Don'ts in the Preparation of Muscle Cryosections for Histological Analysis

Examen histologique des biopsies musculaires a servi comme un outil indispensable dans la compréhension du développement et la progression de la pathologie des troubles neuromusculaires. Toutefois, afin de le faire, des soins appropriés doivent être prises lorsque l&#39;excision et la préservation de tissus pour obtenir une coloration optimale. Une méthode de préservation des tissus consiste à fixer les tissus en formaldéhyde, puis les incorporer à la cire de paraffine. Cette méthode préserve la morphologie bien et permet le stockage à long terme à température ambiante, mais est lourde et nécessite une manipulation de produits chimiques toxiques. En outre, des résultats formaldéhyde de fixation à l&#39;antigène reticulation, ce qui nécessite des protocoles d&#39;extraction d&#39;antigène efficace pour immunocoloration. Au contraire, le sectionnement congelé ne nécessite pas de fixation et conserve ainsi biologique antigène conformation. Cette méthode fournit également un avantage distinct à son tour rapide autour du temps, ce qui rend particulièrement utile dans les situations nécessitant une évaluation histologique rapide comme intraoperative biopsies chirurgicales. Ici, nous décrivons la méthode la plus efficace de préparer des biopsies musculaires pour la visualisation avec différents colorants histologiques et immunologiques.

La mise en place pour la récolte et la congélation des tissus peut être vu sur la figure 1. Tissus excisés doivent être stockés sur une gaze trempée dans du PBS afin d&#39;éviter le séchage (figure 1A). Lorsque les tissus sont sélectionnés pour être utilisé pour l&#39;analyse histologique, ils devraient être trempés dans de l&#39;OCT et disposés sur cryo moule dans le bon sens et que près de la longueur physiologique que possible pour assurer la morphologie précise (figure 1B).<...

Nous démontrons ici les méthodes les plus efficaces pour la congélation, l’intégration, la cryosection et la coloration des biopsies musculaires afin d’éviter la congélation des artefacts.

À faire et à ne pas faire dans la préparation de Muscle cryosections pour l&#39;analyse histologique

Histological evaluation of muscle biopsies has served as an indispensable tool in the understanding of the development and progression of pathology of ...

L'objectif général de cette procédure est d'éviter les écueils lors de la préparation de coupes congelées à partir de biopsies musculaires, tels que la formation d'artéfacts de congélation. Cela est réalisé en congélant d'abord rapidement le muscle dans du méthylbutane refroidi à l'azote liquide. Après que les biopsies musculaires aient atteint l'équilibre dans le cryostat, elles sont incluses dans un milieu de température optimale pour la coupe, à température ambiante, par petites étapes, avec une congélation rapide à l'aide d'un refroidissement par aérosol et d'une extraction de chaleur.Ensuite, des sections de sept micromètres sont découpées et transférées sur des lames en verre chargées positivement et tièdes. La dernière étape consiste à colorer les sections tissulaires selon les besoins afin d'évaluer l'histologie du tissu. En définitive, des biopsies musculaires correctement préparées permettent d'obtenir une histologie tissulaire bien préservée, sans artefacts de congélation.Ainsi, le principal avantage de cette technique par rapport aux autres méthodes existantes, comme la sectionnement de tissus inclus en paraffine, est qu'elle est très rapide et qu'elle n'altère ni la structure ni la fonction des antigènes endogènes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie musculaire liées à la santé et à la maladie, telles que la croissance, la régénération, l'inflammation, la fibrose et la nécrose. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie ou au diagnostic des troubles musculaires, car elle permet de déterminer l'état du muscle sain et pathologique.Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur différentes formes de dystrophie musculaire, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, comme la cachexie associée aux stades terminaux du cancer et du sida, ou à la perte musculaire chez les populations âgées. Commencez par euthanasier une souris à l'aide d'une surdose d'isoflurane sous une hotte et dans un dispositif de confinement de niveau secondaire, tel qu'un cloche en verre. Confirmez le décès de l'animal en serrant fermement sa plante plantaire.Maintenant, humidifiez le pelage avec de l’alcool à 70 %. Cela empêche les poils détachés de s’attacher aux muscles. Procédez ensuite en retirant la peau du membre à l’aide d’une pince fine de taille 5.Séparez soigneusement le muscle d'intérêt de l'os en partant du tendon. Dans ce cas, le tibial antérieur est isolé. Après avoir excisé le muscle, recouvrez-le de OCT et déposez-le à plat sur un moule de congélation jetable étiqueté.Plus de OCT sera ajouté ultérieurement avant la découpe. Veillez à ce que le muscle soit dans son orientation physiologique normale selon l'axe tête à queue et qu'il ne soit pas étiré. Refroidissez maintenant.De l'isopentane dans un bécher en acier à l'aide d'azote liquide. Remuez de façon intermittente pendant trois à cinq minutes à l'aide d'une spatule en plastique. Lorsqu'un précipité blanc se forme, l'isopentane est à sa température optimale ; à ce stade, plongez les moules chargés dans la solution.Les petits muscles, comme le diaphragme et l'extenseur long des doigts, nécessitent de six à douze secondes. Les muscles plus gros nécessitent de 15 à 20 secondes, car un temps de congélation trop long peut entraîner des fissures. L'étape suivante consiste à placer les tissus congelés sur de la glace sèche afin de laisser s'évaporer l'isopentane résiduel, ce qui prend environ 15 à 20 minutes.Une fois le tissu sec, enveloppez-le rapidement dans de la feuille d’aluminium et conservez-le dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’il puisse être sectionné. Avant la section, transportez les tissus congelés sur de la glace sèche jusqu’au cryostat.Transférez le tissu dans une chambre de cryostat réglée entre moins 24 et moins 20 degrés Celsius, et laissez-les équilibrer pendant 30 minutes. Les tissus ne décongèleront pas complètement à cette température. Ensuite, incluez d'abord le tissu.Si disponible, activez le refroidissement de la chambre Peltier. Deuxièmement, appliquez une couche mince et uniforme d’OCT sur le disque d'échantillon et laissez refroidir. Troisièmement, une fois que l’OCT est gelé en dessous mais encore liquide en surface, insérez le tissu, en orientant le tissu perpendiculairement à l’OCT pour des sections transversales et parallèlement à l’OCT pour des sections longitudinales.Utilisez maintenant un spray de refroidissement par aérosol pour congeler rapidement l'OCT. Ensuite, touchez la partie non congelée du tissu avec un extracteur de chaleur et maintenez-le en contact avec le tissu pendant 45 secondes. N' laissez jamais le muscle dégeler à aucune étape de ce processus.Si le cryostat ne dispose pas d'un refroidissement par cellule Peltier, utilisez un refroidissement par aérosol pour congeler rapidement l'OCT autour du tissu. Appliquez ensuite une autre fine couche d'OCT autour du muscle en pulvérisant de l'aérosol réfrigérant et extrayez la chaleur comme à l'étape précédente. Continuez à ajouter de l'OCT par petites quantités et à congeler rapidement l'OCT à l'aide d'un mélange de spray de refroidissement par aérosol et d'extracteur de chaleur jusqu'à ce que l'ensemble du muscle soit recouvert.Ensuite, placez l'extracteur thermique sur le dessus du bloc de tissu et attendez cinq minutes avant de procéder à la coupe. L'échantillon est maintenant prêt à être monté sur la tête du porte-échantillon. Tout d'abord, serrez le bouton pour fixer le disque.Veillez à ce que le disque d'échantillon soit en bon contact avec la tête de l'échantillon pendant que la chambre atteint une température comprise entre moins 24 et moins 20 degrés Celsius. Réglez l'épaisseur de coupe à sept micromètres lorsque la chambre est à température, puis commencez à paraffiner le bloc. Utilisez les réglages grossier et fin pour déplacer le bloc.Lorsque les sections sont prêtes à être collectées, appuyez leurs côtés supérieurs sur des lames positives préalablement réchauffées à la lampe. Si le tissu a été congelé correctement, la face tissulaire doit apparaître blanche et mate. En revanche, un tissu qui a été mal congelé ou qui a dégelé pendant le montage apparaîtra rouge à rose.Les lames peuvent être conservées dans l'ultracongélateur pour des analyses ultérieures. La section médiane du ventre du tissu peut être identifiée en mesurant la surface de la coupe transversale sur des images en contraste de phase, à l’aide de la fonction de tracé d’un logiciel d’imagerie. Cette analyse fournit à la fois la mesure de la surface et celle du diamètre de Feret minimal.Lorsque ces mesures commencent à se stabiliser, le milieu du ventre a été atteint. Bien que les fabricants fournissent des instructions étape par étape pour la plupart des protocoles de coloration, une optimisation personnelle peut être nécessaire pour obtenir des intensités de coloration optimales. L'OCT n'a pas besoin d'être retiré.Pour la coloration, afin d'obtenir une immunocoloration optimale, veillez à utiliser une chambre humidifiée. Celle-ci doit être recouverte de profil et posée sur une serviette en papier humide, puis scellée dans une petite boîte afin d'éviter le dessèchement des coupes. Pendant le processus de coloration des lames montées de façon permanente non immunocolorées, selon le protocole de coloration, déshydratez les lames par des alcools de concentration croissante.Étant donné que le milieu de montage n’est pas compatible avec l’eau, déshydratez les lames en les plongeant pendant cinq minutes dans du xylène à 100 %. Cette étape garantit que les lames ne deviennent pas opaques avec le temps. Ensuite, procédez au montage et à l’imagerie des sections de la région médiane du ventre des tibiaux antérieurs qui ont été colorées.À l'aide d'hématine et d'éosine. Les coupes correctement traitées présenteront une morphologie homogène et une coloration uniforme dans l'ensemble. Les muscles incorrectement traités, endommagés par le gel ou décongelés prématurément, présentent de multiples ruptures de la morphologie et une apparence comparable à celle du son d'avoine écrasé.L'immunohistochimie a également été réalisée sur ces coupes. Les colorations étaient satisfaisantes. La fibronectine est colorée en vert et le DAPI apparaît en bleu.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une compréhension approfondie de la préparation d'une bonne coupe congelée à partir de biopsies musculaires afin d'évaluer l'architecture musculaire. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ quatre à cinq heures si toutes ces étapes sont correctement effectuées. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de veiller à prévenir la fonte des muscles après cette procédure.D'autres méthodes, telles que la coloration immunohistochimique et l'hybridation in situ, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires concernant la croissance et la régénération.

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