Athymiques Rat Modèle d'évaluation des Engineered ligament croisé antérieur greffes

L'objectif général de la procédure suivante est d'utiliser un modèle rongeur pour évaluer des greffons ingénierisés pour le remplacement du ligament croisé antérieur. Cela est réalisé en fabriquant d'abord une matrice en polymère biodégradable. Dans la deuxième étape, la matrice est implantée dans le genou d'un rat.

Après 16 semaines, les ligaments néoformés à partir de l’échafaudage sont prélevés pour une analyse histologique. Enfin, la résistance biomécanique du collagène est évaluée afin d’apprécier la qualité de ces greffons conçus par génie tissulaire pour une utilisation dans la reconstruction du ligament croisé antérieur. Les principaux avantages de cette technique par rapport à d'autres méthodes d'évaluation des échafaudages sont que ce modèle expose l'échafaudage à un environnement complexe in vivo, tout en restant économique et plus facile à manipuler que les modèles animaux de plus grande taille.

Ce modèle peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du génie tissulaire, comme : comment un échafaudage conçu s'intégrera-t-il à l'environnement in vivo pour former un néo-ligament ? Cette technique peut conduire à de nouveaux traitements et à la reconstruction du ligament croisé antérieur. Étant donné que les modèles animaux de petite taille constituent la première étape vers la traduction clinique, bien que cette méthode puisse être utilisée pour évaluer notre échafaudage particulier.

Elle peut également être appliquée à d'autres substituts tissulaires ingénierisés, comme ceux contenant des cellules et des facteurs de croissance. Nous optimisons la technique chirurgicale en modifiant les méthodes utilisées par le Dr Scott Rodeo et ses collègues à l'hôpital pour chirurgie spécialisée à New York. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes de filage électrostatique et les gestes chirurgicaux peuvent être difficiles à apprendre uniquement à partir d'instructions écrites.

Lors de l'électrofilage de supports en polycaprolactone, une grande boîte en acrylique dotée d'orifices d'entrée pour la solution source de polycaprolactone est nécessaire. Un mandrin collecteur motorisé et un orifice de vide, alimenté par une source de tension placée à l'intérieur d'une hotte chimique, seront requis afin de servir de milieu sous vide isolé pour le processus d'électrofilage. Avant de commencer la procédure, nettoyez soigneusement la boîte avec de l'éthanol à 70 % et recouvrez toutes les surfaces de feuilles de film parafilm afin d'éliminer toute impureté susceptible de compromettre la qualité du produit obtenu par électrofilage.

Ensuite, allumez le ventilateur et chargez trois millilitres de polymère de polycaprolactone fraîchement préparé dans une seringue de 10 millilitres munie d'une aiguille 18G à bout émoussé. Après avoir éliminé toutes les bulles d'air, fixez la seringue sur une pompe à seringue programmable et insérez l'aiguille dans la boîte en acrylique par le port d'entrée, en laissant environ un demi-pouce de l'aiguille à l'extérieur de la boîte. Ensuite, enroulez étroitement une bande fine de papier d'aluminium autour du mandrin rotatif et fixez le mandrin sur le moteur du côté opposé de la boîte, à environ 15 centimètres de l'aiguille de la seringue, afin qu'il serve de collecteur ; insérez un tuyau en plastique dans le port de vide.

Ensuite, raccordez le tuyau à la source de vide de la hotte et mettez-la en marche. Recouvrez maintenant la boîte en acrylique avec son couvercle et réglez le débit d'infusion de la pompe à seringue programmable sur 2,5 millilitres par heure. Puis reliez la borne négative à la masse, allumez le moteur pour faire fonctionner le mandrin à 3 450 tr/min et utilisez une pince crocodile pour fixer la borne positive de la source de tension à l'extrémité de l'aiguille située à l'extérieur de la boîte.

Dès que l'infusion de la solution de polycaprolactone commence, enclenchez la source de tension et réglez-la à une tension de fonctionnement de 20 kilovolts. Après 12 minutes d'infusion, un manchon homogène se sera formé à partir de 0,5 millilitre de la solution de polycaprolactone. Éteignez tous les équipements, y compris la tension, la source, le moteur, le vide et la pompe à seringue.

Retirez le mandrin du moteur, retirez la gaine polymère du mandrin et effectuez une coupe transversale unique afin d'obtenir un tapis électrofilé rectangulaire. Découpez ensuite ce tapis au laser pour former plusieurs petites feuilles, que l'on coupera en bandes assemblées par empilement de quatre couches et suturées ensemble pour former les échafaudages avant le début de la chirurgie. Tout d'abord, vérifiez l'efficacité de l'anesthésie par l'absence de réponse à une pression appliquée sur la patte arrière.

Ensuite, réalisez une incision verticale de deux centimètres de long, médiale au genou, centrée au niveau de la rotule, en rétractant latéralement la peau selon les besoins. Puis, à l’aide d’un scalpel, pratiquez une arthrotomie médiale para-rotulienne juste au-dessus de la rotule, en étendant la coupure proximalement jusqu’au niveau de la jonction musculo-tendineuse du quadriceps et distalement jusqu’au niveau de l’insertion du tendon rotulien sur la tubérosité tibiale. Maintenant, effectuez une incision verticale d’un centimètre à travers la capsule du genou, juste latérale au tendon rotulien, afin de libérer la rotule vers l’extérieur.

Ensuite, veiller à ce que le genou soit en extension, puis passer une paire de ciseaux fins sous la rotule de la face latérale vers la face médiale, et écarter les ciseaux à deux ou trois reprises afin que le mécanisme extenseur puisse être déplacé vers l'un ou l'autre côté pendant la flexion du genou. Déplacer la rotule vers le côté latéral pour exposer l'intérieur de l'articulation du genou, en confirmant une visualisation claire de l'incisure intercondylaire et des condyles fémoraux. Puis sectionner le LCA et le LCP au niveau de l'incisure.

Placez maintenant l'extrémité d'un fil K de 1,6 millimètre fixé à une perceuse électrique sur l'origine du LCA dans l'entonnoir intercondylaire et percez en direction supéro-latérale, tandis qu'un assistant stabilise le genou. Passez ensuite le fil K à plusieurs reprises à l'intérieur et à l'extérieur pour garantir un passage dégagé pour la greffe. Visualisez le point de sortie sur l'aspect latéral du fémur, en retirant tout tissu mou si nécessaire à l'aide d'un scalpel.

Lorsque le tunnel est dégagé, placer le fil-guide sur l'empreinte du LCA au niveau du plateau tibial et percer latéralement tandis qu'un assistant stabilise le genou. Puis visualiser le point de sortie sur la partie proximale antérolatérale du tibia en utilisant le scalpel pour dégager les tissus mous si nécessaire, de sorte que le point où le fil-guide sort du tibia soit parfaitement visible, et faire passer une aiguille de Keith raccourcie, d'une longueur n'excédant pas deux pouces, à travers le tunnel osseux fémoral. Ensuite, passer les deux extrémités de suture provenant d'une des extrémités du greffon à travers l'œil d'une aiguille et utiliser cette aiguille pour tirer une extrémité du greffon à travers le tunnel fémoral.

Ensuite, utilisez l'aiguille pour faire passer l'autre extrémité du greffon à travers le tunnel tibial à l'aide d'un fil de suture Vicryl quatre zéro. Fixez ensuite l'extrémité fémorale du greffon aux tissus mous environnants à l'aide d'un point en huit, tout en maintenant le genou en extension afin de créer une tension manuelle dans le greffon. Utilisez un autre point en huit pour fixer l'extrémité tibiale du greffon aux tissus mous environnants, coupez l'excès de greffon aux deux extrémités avec une paire de ciseaux et laissez un à deux millimètres de greffon au-delà du point à chaque extrémité.

Enfin, étendre le genou et réduire la rotule. Puis, à l’aide d’un fil de Vicryl 4-0, poser un seul point en huit pour fermer la capsule articulaire médiale, empêchant ainsi une subluxation latérale de la rotule, et fermer la peau par un point continu sous-cuticulaire au Monocryl 5-0 ou au Vicryl 5-0. À 16 semaines après la reconstruction, l’analyse histologique du genou sectionné montre que la matrice du support est largement infiltrée par des fibroblastes sécrétant un collagène éosinophile, avec une bonne intégration dans les tunnels osseux.

Dans cette expérience, les propriétés biomécaniques de l'articulation ont été évaluées immédiatement après l'euthanasie. Tous les échantillons testés ont cédé au niveau de la substance médiane, à l'aide de courbes de faible déplacement obtenues par essai de traction. La charge de rupture et la rigidité ont été calculées pour chaque groupe.

À 16 semaines post-implantation, le greffon en polymère électro-spongieux avait environ doublé la charge maximale et la rigidité du greffon testé immédiatement après l'implantation. Bien que ces valeurs soient encore inférieures à celles du LCA natif, une fois la technique maîtrisée, la chirurgie animale peut être réalisée en environ 15 minutes. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien effectuer une fermeture dans laquelle aucun point de suture n'est visible de l'extérieur.

Après cette procédure, d'autres analyses finales, telles que des colorations supplémentaires et des tests biochimiques, peuvent être réalisées. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du génie tissulaire pour évaluer plusieurs options de greffe dans le cadre de la reconstruction du ligament croisé antérieur. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment fabriquer un échafaudage polymère destiné à être implanté dans un modèle rongeur de reconstruction du LCA.

N'oubliez pas que le travail avec des animaux vivants peut présenter des risques, et que des précautions telles que le respect des recommandations vétérinaires et le port d'équipements de protection individuelle doivent être prises en tout temps lors de la réalisation de cette procédure.