Modèle murin de rejet vasculaire allo-induite et Transplant artériosclérose

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une greffe interposée aortique complète chez la souris afin d'étudier le rejet vasculaire et l'artériosclérose du greffon. Cette opération consiste d'abord à prélever un segment de l'aorte abdominale de la souris donneuse. Ce segment est ensuite greffé de manière orthotopique dans l'aorte intrarénale d'un receveur allogénique génétiquement différent du donneur.

Dans la dernière étape, le segment vasculaire transplanté est excisé et analysé pour évaluer le développement de l'artériosclérose du greffon. En fin de compte, l'importance de l'artériosclérose du greffon et du rejet vasculaire médié par le système immunitaire peut être évaluée par la mesure de l'épaississement intimal et du rétrécissement luminal, ainsi que par l'analyse immunohistochimique du tissu afin de détecter l'accumulation de cellules immunitaires.

En général, les personnes novices dans cette procédure ont besoin de temps pour se familiariser avec la technique microchirurgicale, car elle exige un haut niveau de dextérité et une pratique assidue pour être maîtrisée. Toutefois, cette méthode devrait être accessible à la plupart des chercheurs avec une pratique rigoureuse chez les patients. Ainsi, la démonstration de la procédure avec Mme Winnie, une neurochirurgienne talentueuse, et Adam Roso, un étudiant en doctorat talentueux de mon laboratoire, commence par placer la souris donneur en position décubitus dorsal sur une fine planche en plexiglas propre, enveloppée dans un champ stérile, sous le microscope opératoire à un grossissement de 30 x.

Après avoir confirmé une anesthésie chirurgicale adéquate par une pincée du orteil, utilisez des ciseaux stériles pour pratiquer une incision médiane unique allant du pubis au processus xiphoïde. Ensuite, utilisez un petit rétracteur pour écarter les parois abdominales et exposer la cavité abdominale. Puis, utilisez des applicateurs stériles munis de cotons-tiges pour rétracter doucement les intestins vers la partie supérieure, à gauche de l'animal.

Couvrez le tissu avec un pansement imbibé de sérum physiologique, puis déplacez les organes reproducteurs vers le bas afin de localiser l'aorte infrarénale et la veine cave inférieure ou VCI. Utilisez ensuite une pince chirurgicale n°5 pour séparer l'aorte de la VCI au niveau de l'artère rénale gauche, près de la bifurcation. Puis, utilisez des sutures en polyamide monofilament 10-0 pour ligaturer les petites branches situées près de l'aorte.

Lorsque l'aorte du donneur et la VCI ont été séparées, saturez le vaisseau avec du sérum physiologique, recouvrez la cavité exposée avec un pansement humide et mettez le donneur de côté dans un endroit stérile. Placez maintenant la souris receveuse sous le microscope et séparez l'aorte receveuse de la VCI comme vient de l'être démontré. Placez ensuite deux pinces microvasculaires de quatre millimètres, proximale et distale par rapport au segment d'intérêt, espacées d'environ cinq millimètres.

Ensuite, à l’aide de ciseaux micro-chirurgicaux pour tube vasculaire, pratiquer une seule incision horizontale de l’aorte et résecter au maximum 0,5 millimètre de l’aorte abdominale afin de loger la greffe aortique du donneur. Revenir au microscope avec le donneur et sectionner un segment greffon de trois à quatre millimètres comme vient d’être démontré. Puis utiliser une aiguille 25 gauge cinq huitièmes pour rincer l’aorte excisée avec une solution saline héparinée.

Veiller à ce que la pointe de l'aiguille ne touche pas le vaisseau et placer le vaisseau dans un récipient contenant une solution saline héparinée sur de la glace. Dans les 30 minutes suivant l'excision, placer la greffe aortique du donneur en position orthotopique chez le receveur, en alignant l'orientation anatomique respective de la greffe avec celle du receveur. Ensuite, saisir délicatement la tunique externe du vaisseau et utiliser la pince n°5 pour la dévier légèrement.

Utilisez maintenant la pince pour introduire une aiguille fixée à un fil de suture monofilament en polyamide de calibre 10-0 à travers toute l'épaisseur de la paroi vasculaire afin de fixer la greffe aortique du donneur au vaisseau récipient en prévision de la pose de points continus. Positionnez les fils de fixation à neuf heures aux deux extrémités, supérieure et inférieure, de la greffe. Puis, à partir de l'extrémité supérieure de la greffe, commencez l'anastomose à trois heures.

Relevez les extrémités résectionnées avec deux points continus et fixez le fil au point de fixation. Ensuite, retournez la greffe et poursuivez le point continu vers la partie dorsale du vaisseau, en rejoignant l'origine.

Point de suture d'attache. Fixer la suture sans appliquer une pression excessive sur le vaisseau, puis répéter la suture pour l'anastomose inférieure. Une fois l'anastomose terminée.

Relâchez la pince microvasculaire distale pour permettre un flux sanguin rétrograde à travers le vaisseau. Si aucun saignement n'est observé, relâchez la pince proximale. Si aucune obstruction sanguine n'est observée, utilisez une paire de forceps pour saisir délicatement une extrémité des fils de fixation et dévier légèrement le vaisseau afin d'inspecter sa paroi postérieure.

Aucun plissement ne doit être observé si un motif de pouls vigoureux est visible dans les vaisseaux donneur et receveur ; utilisez des applicateurs à extrémité de coton pour replacer les intestins dans la cavité abdominale. Enfin, utilisez un porte-aiguille et des pinces grof pour fermer la paroi abdominale avec des sutures continues en polypropylène 5-0. Fermez la couche cutanée à l’aide d’une suture sous-cuticulaire en utilisant les mêmes fils de suture.

La fonction motrice des membres postérieurs peut être observée afin d'évaluer la réussite de la chirurgie. La quantité de lésions vasculaires allogreffe induites par le système immunitaire est examinée, en quantifiant l'épaississement intimal et le rétrécissement luminal dans les segments aortiques greffés au jour 30 suivant la transplantation.

En effet, comme observé, les segments artériels allogreffés développent un épaississement intimal important et une occlusion luminaire, tandis qu'aucun changement n'est observé dans les segments artériels témoins de la greffe ISO. De plus, le recrutement des leucocytes dans l'artère allogreffée peut être évalué en examinant l'accumulation de cellules T positives pour CD four et CD huit ainsi que des macrophages par immunohistochimie. Comme prévu, les trois types de cellules immunitaires ont été détectés au sein de l'intima des tissus artériels du donneur après développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du transport pour explorer la réduction vasculaire médiée par l'alloimmunité et la sclérose artérielle du greffon.