L'isolement et la caractérisation des cellules satellites de Muscles Rat chef Branchiomeric

L’objectif global de cette procédure est d’isoler des cellules satellites de muscles représentatifs provenant des premier, deuxième et quatrième arcs brachiaux pour leur culture sur une matrice extracellulaire. Taches de gel. Ceci est accompli en disséquant d’abord les muscles de massacre, digastric et levada vli palatin d’un jeune rat adulte.

Dans la deuxième étape, les cellules satellites de chaque échantillon musculaire sont isolées par l’enzyme, la digestion et la durée. Les cellules sont ensuite cultivées sur les gels de la matrice extracellulaire. En fin de compte, l’état dynamique de la myogenèse des cultures de cellules satellites peut être suivi par coloration pour les marqueurs musculaires d’intérêt.

La fente labiale et palatine est l’une des malformations craniofaciales les plus courantes chez l’homme. Lorsqu’une fente est présente, une réparation chirurgicale est nécessaire afin de fermer le défaut et de permettre un développement normal de la parole, la fibrose et la régénération musculaire défectueuse peuvent cependant entraver la récupération fonctionnelle des muscles du palais mou. Après la réparation d’une fente palatine, vous pouvez démontrer une méthode innovante pour la culture de cellules satellites fraîchement isolées à l’aide de revêtements de gel à matrice exocellulaire de taille millimétrique seulement.

Cela évite la nécessité d’une expansion. Un jour avant l’isolement, placez huit lames de chambre dans une boîte de Pétri de 100 millimètres et transférez la boîte sur une surface froide. Après 10 minutes, utilisez une micro-pipette préremplie pour distribuer une seule goutte de 10 microlitres de gel de matrice extracellulaire dans chaque puits.

Après avoir refroidi les lames pendant sept minutes supplémentaires, retirez complètement le gel restant et séchez les puits à 37 degrés Celsius pendant la nuit du lendemain. Pour disséquer le muscle du massacre, retirez la peau de la tête d’un rat de neuf semaines et utilisez des aiguilles hypodermiques pour fixer la tête sur son côté. Sur un tampon en silicone, isolez la glande parotide et le nerf facial et retirez la glande.

Ensuite, à l’aide d’une lame de scalpel numéro 15, retirez soigneusement le nerf facial. Identifiez la tête superficielle du muscle masséter. Ensuite, à l’aide d’une pince droite, séparez le tendon de son origine au niveau du processus zygomatique, puis coupez soigneusement le tendon avec des ciseaux de dissection.

À l’aide du scalpel, disséquez la tête superficielle du massacre jusqu’à son insertion à l’angle et la moitié inférieure de la surface latérale de la branche de la mandibule. Pour disséquer le ventre postérieur du muscle digastrique, fixez la tête en position couchée avec des aiguilles et retirez la graisse sous-cutanée recouvrant les glandes sublinguale et sous-mandibulaire. Exposez les muscles gastriques antérieur et postérieur du ventre, puis en tenant le tendon antérieur du ventre postérieur avec une pince droite coupée en soigneusement disséquer le tendon jusqu’à son origine dans le buller tympanique.

Pour disséquer le muscle levada vli palatino, localisez le muscle stylo halloïde. Tirez-le latéralement et retirez délicatement le tissu musculaire. Ensuite, localisez le tendon de la levada vli palatine qui insère ce buller tympanique et disséquez-le soigneusement.

Soulevez ensuite l’œsophage par l’arrière de la trachée. Identifiez la zone du palais mou où le palais levada vli est inséré et coupez le muscle. Ensuite, immergez le muscle dans de l’éthanol à 70 % et transférez-le dans du PBS glacé complété par des antibiotiques.

Pour isoler les cellules satellites, transférez chaque muscle dans des puits individuels d’une plaque à six puits, et coupez les tissus en petits morceaux de deux millimètres. En prenant soin de ne pas trop émincer les muscles. Ensuite, incubez soigneusement les fragments de tissu dans 2,5 millilitres de solution de pronase à 0,1 % par puits à 37 degrés Celsius pendant 60 minutes avec une légère agitation toutes les 20 minutes.

Lorsque les faisceaux de fibres présentent une apparence relâchée à 2,5 millilitres de DMEM complétés par du sérum de cheval et des antibiotiques dans chaque puits et transférez les tissus digérés dans des tubes coniques individuels de 15 millilitres. Faites tourner les boues de tissu et décantez les surnageants. Ajoutez ensuite cinq millilitres de fluide dans chaque tube et homogénéisez le tissu avec une pipette en plastique de 10 millilitres.

Faites tourner à nouveau les tissus et transférez les surnageants dans de nouveaux tubes coniques de 15 millilitres. Ajoutez ensuite cinq millilitres supplémentaires de fluide dans les tubes et tripartissez à nouveau les morceaux de tissu jusqu’à ce que les fragments passent facilement à travers la pipette. Après une autre centrifugation, tirez les surnageants dans les tubes correspondants appropriés et filtrez les suspensions cellulaires à travers des crépines de 40 micromètres dans des tubes individuels de 50 millilitres.

Lavez les passoires avec un millilitre de DMEM pour une récupération cellulaire maximale. Ensuite, faites tourner les cellules, remettez les granulés en suspension dans un milieu frais et comptez les cellules pour cultiver les cellules satellites isolées. Ensuite, diluez les suspensions cellulaires à 1,5 fois 10 pour les trois cellules par 10 microlitres de milieu de culture.

Ajoutez ensuite 10 microlitres de cellules sur chaque point de gel de matrice extracellulaire préalablement préparé, et incubez les gels à 37 degrés Celsius après six heures. Ajoutez délicatement 400 microlitres de milieu de culture à chaque point de gel et remettez les lames dans l’incubateur. Après trois jours, amorcez la différenciation des cellules avec l’ajout du milieu de culture approprié immédiatement après l’isolement.

Plus de 90 % des cellules satellites fraîchement isolées expriment le pack sept Le quatrième jour, le pack sept et MyoD sont exprimés par les cellules satellites de tous les groupes musculaires. Mon OG est fortement exprimé au septième jour dans tous les groupes musculaires. Quatre jours après l’ensemencement sur la matrice extracellulaire, les cellules proliférantes, les cellules proliférantes, commencent à fusionner et à former de petits myotubes multinucléés, qui expriment la chaîne lourde de myosine aux jours sept et dix.

Des myotubes longs et bien organisés sont évidents au jour 10. Des contractions du tube Myo peuvent également être observées. Ce protocole permet d’étudier les cellules satellites provenant des muscles de la tête et offre de nouvelles possibilités pour le traitement de la fente palatine. Patient.