Ingénierie 3D cellularisé collagène Gels pour la régénération tissulaire vasculaire

L’objectif global de cette procédure est de concevoir des constructions tubulaires pour la régénération du tissu vasculaire. Ceci est accompli en combinant d’abord le collagène de type un et les cellules musculaires lisses dans une géométrie cylindrique à l’aide d’une technique de moulage. La deuxième étape consiste à faire mûrir la construction dans un bioréacteur statique spécialement conçu.

Ensuite, les constructions matures sont soigneusement récoltées et les cellules endothéliales sont placées sur la lumière de la construction à l’aide d’un acteur de bioréacteur à paroi rotative. En fin de compte, des tests histologiques, métaboliques et mécaniques sont effectués pour évaluer les propriétés de ces constructions tubulaires. L’originalité de cette technique est qu’elle n’utilise qu’une seule étape pour combiner les cellules et le collagène afin d’obtenir une construction d’ingénierie tissulaire aux propriétés mécaniques ciblées sans aucun traitement physique ou chimique supplémentaire.

De plus, la construction peut être facilement manipulée grâce à des poignées spécialement conçues, qui permettent leur manipulation et leurs maillons finaux. Cette méthode peut donner un aperçu de l’interaction entre les cellules et la matrice extracellulaire pendant la croissance et le remodelage pour la régénération du tissu vasculaire. De plus, il peut être appliqué pour un certain nombre de tissus ciblés, tels que les tendons, les greffes de peau, le patch cardiaque et le système nerveux.

Pour commencer, fabriquer et assembler le bioréacteur statique tel que décrit dans le protocole de texte d’accompagnement, des détails sur le réservoir et la gaze, la fabrication de la poignée, le capuchon du mandrin et les techniques d’assemblage et de stérilisation du moule du boîtier. Ensuite, développez les cellules musculaires lisses de l’aorte porcine dans un flacon de culture tissulaire de 175 centimètres carrés jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 90 %. À l’aide de techniques de culture standard, récoltez les cellules, puis mettez-les en suspension à 4 millions de cellules par millilitre dans un milieu de culture complet.

Ensuite, combinez une partie de solution tampon, deux parties de solution de collagène stérile à quatre grammes par litre et une partie de suspension cellulaire. Dans cet ordre, mesurez le pH du mélange et assurez-vous qu’il se situe entre pH 7,0 et 7,4. Versez ensuite doucement le mélange de collagène cellulaire dans le complexe de moules de boîtier assemblé.

Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans le mélange. Laissez le gel de collagène reposer à température ambiante pendant une heure dans un environnement stérile. Au bout d’une heure, retirez le tube du boîtier et transférez soigneusement la construction dans le réservoir contenant 35 millilitres de milieu de culture préchauffé.

Incuber la construction en position verticale pour une ou deux semaines de maturation statique. Changez le milieu de culture tous les deux jours en aspirant l’ancien milieu à partir de l’orifice inférieur du septum et en remplissant le réservoir avec une quantité équivalente de culture fraîche. Douleur moyenne. Si vous le souhaitez, prélever un millilitre de milieu de culture ancien et frais à chaque échange de milieu pour analyse biochimique toutes les heures pendant les 12 premières heures et toutes les 24 heures par la suite.

Retirez la construction du milieu de culture dans des conditions stériles et placez-la orthogonalement sur le chemin d’un interféromètre laser à balayage pour mesurer l’épaisseur de la construction après une à deux semaines de maturation statique. Transférez le bioréacteur dans une hotte de culture cellulaire et retirez délicatement la construction de son mandrin. Une fois libre, placez-le dans une boîte de Pétri de 100 millimètres de diamètre contenant 40 millilitres de milieu de culture frais.

Ensuite, installez un testeur micromécanique équipé d’un capteur de charge de cinq à 10 Newton et de poignées qui se prolongent dans un bain de PBS maintenu à 37 degrés Celsius. Retirez la construction de sa boîte de Pétri et connectez-la à des dispositifs de préhension spécialisés pour les tests longitudinaux et conçus pour se connecter à la partie gaze de la construction sans écraser le gel. Utilisez du ruban téflon pour éviter tout glissement des dispositifs de préhension pendant les essais.

Montez ensuite la construction sur le testeur micromécanique. Ensuite, effectuez un essai de fatigue dans la direction longitudinale en étirant d’abord la construction à sa longueur de référence initiale et en la maintenant à ce niveau pendant 10 minutes. Appliquez ensuite 30 cycles d’une déformation cyclique de 10 % à une vitesse de 5 % par seconde.

Augmentez la déformation par étapes incrémentielles de 10 % de déformation cyclique jusqu’à ce que l’échantillon ne puisse pas effectuer les tests dans la direction circonférentielle. Divisez d’abord l’échantillon en anneaux de 10 millimètres de long. Montez ensuite les anneaux sur des barres en acier inoxydable utilisées à la place des poignées.

Comme pour les tests de direction longitudinale, étirez d’abord la construction à sa longueur de référence initiale et maintenez-la à ce niveau pendant 10 minutes. Ensuite, appliquez 30 cycles d’une déformation cyclique de 10 % à une vitesse de 5 % par seconde. Une fois que la construction a mûri et qu’elle a été retirée de son mandrin, fixez la construction qui se trouve aux deux extrémités du réservoir et placez-la dans l’ensemble du réservoir.

Comme illustré ici. Remplissez l’extérieur du réservoir avec 30 millilitres de culture. Douleur moyenne. Ensuite, remplissez 75 % du volume luminal de la construction avec un mélange de protéines, puis fermez les deux extrémités de la construction.

Pour éviter toute fuite de la solution protéique, placez le bioréacteur à l’intérieur d’un incubateur et faites pivoter le bioréacteur de 4,02 fois 10 puissance moins cinq GForce pendant une heure pour recouvrir la surface luminale de protéines pendant que le luminaire est enduit. Récoltez les cellules de la veine ombilicale humaine et du tial cultivées avec des techniques standard lorsqu’elles sont confluentes à 90 % Resus suspendez les cellules et complétez le milieu de culture M1 99. Ensuite, voyez la veine ombilicale humaine et les cellules urothéliales dans la lumière de la construction.

Avec la densité de 1000 cellules par centimètre carré, fermez les extrémités supérieures de la construction pour éviter toute fuite de la solution cellulaire. Incuber les constructions hébergées dans la culture du bioréacteur à paroi rotative pendant deux jours à une rotation constante de 4,02 fois 10 à la force négative 5G. Au cours de la maturation statique des constructions vasculaires, le diamètre externe des structures d’élévation cellulaire a rapidement diminué.

Comme le montre ici, le diamètre des constructions a diminué de 60 % de sa valeur initiale au premier jour de la culture statique. Au septième jour, les constructions avaient diminué de près de 85 %. Les cycles de déformation longitudinaux et circonférentiels des constructions suivaient les propriétés viscoélastiques typiques des constructions à base de collagène. Dans l’ensemble, les constructions étaient plus fortes dans la direction longitudinale par rapport à la direction circonférentielle dans la même gamme de déformations, la coloration au tricone de Massen effectuée sur les constructions endothéliales a montré un endothélium très homogène.

Les cellules musculaires lisses présentaient une morphologie en forme de fuseau et semblaient dispersées de manière homogène à travers la paroi tandis que les cellules endothéliales semblaient bien réparties du côté luminal. Après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en biomécanique et en médecine régénérative pour explorer le comportement mécanique des tissus modifiés et natifs.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez maintenant avoir une bonne compréhension de la façon dont les constructions vasculaires peuvent être rapidement modifiées et finalement devenir suffisamment fortes pour être manipulées et utilisées pour le conditionnement mécanique dans un ateur dynamique. Nous espérons que nos efforts et nos résultats vous ont convaincus du fort potentiel des cellules dans le modèle de la matrice extracellulaire pour le développement de tissus fonctionnels biologiques.