Name: Le traitement des produits plaquettaires avec riboflavine et la lumière UV: Efficacité contre Haute Titer contamination bactérienne (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Découvrez la réduction des agents pathogènes par riboflavine et UV dans les produits plaquettaires humains. Cette méthode élimine efficacement les bactéries à haut titre tout en préservant la qualité des composants sanguins.

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1. Préparation: Les bactéries Suspension <ol><li> D&#39;une plaque de culture strié, inoculer de manière aseptique une seule colonie dans un flacon stérile 250 ml contenant 100 ml de milieu de croissance approprié (Tableau 1) par voie de öse stérile. </li><li> Placer le flacon dans un incubateur agitateur orbital à des conditions appropriées (tableau 1) pendant 1-2 jours, en vérifiant périodiquement croissance. Réglez la vitesse d&#39;agitation à 140 RPM. </li><li> Transférer de façon aseptique la suspension bactérienne en deux stériles tubes de 50 ml conique et centrifuger les tubes à 3000 g pendant 20 min à 23 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre en suspension chaque culot bactérien avec 15 ml d&#39;eau peptonée stérile. Vortex, si nécessaire. Combiner la culture des bactéries en suspension dans un tube / conteneur. </li><li> Titrer la culture du stock en trois exemplaires par l&#39;article 4 pour déterminer le titre boursier de la culture. </li><li> Réfrigérer jusqu&#39;à 2 à 4 semaines77; 2 ° C jusqu&#39;à utilisation. Re-titre de la culture au moment de l&#39;utilisation, voir l&#39;étape 4.8. </li></ol> 2. Préparation des plaquettes produit: <ol><li> Recueillir un produit standard de plaquettes d&#39;aphérèse humaine à une banque de sang accrédité. Le produit des plaquettes doit répondre aux spécifications de collecte suivants: 90-360 ml de volume et 0,8 -3,8 x 10 6 plaquettes / ul concentration. <ol><li> Assurez-vous que le produit plaquettaire a reposé pendant un minimum de 2 heures avant le traitement de réduction des agents pathogènes. Stocker les produits à 22 ± 2 ° C dans un incubateur à plaquettes sans agitation pendant ces 2 heures. Après deux heures que le produit de plaquettes est agité à 22 ± 2 ° C dans un incubateur de plaquettes. Utilisez le produit pour un maximum de 22 après le prélèvement h. </li></ol></li><li> En utilisant une seringue de 3 ml retirer un échantillon de 2 ml pour mesurer le pH 22C du produit plaquettaire. Utilisation d&#39;un analyseur des gaz du sang pour assurer que le produit a un pH&gt; 6,6. Utiliser le même échantillon pour mesurer la concentration de plaquettes du produit plaquettaire en utilisant un analyseur hématologique. Vérifiez que le produit répond aux 0.80-3.8 x 10 6 plaquettes / ul exigence de concentration de collecte. </li><li> Évaluer visuellement le tourbillon du produit plaquettaire. Si le produit a un &quot;0&quot; agiter le produit sera mis au rebut. </li><li> Tenir le sac de plaquettes sous une source de lumière blanche directe et presser le sac de plaquettes brièvement. Visuellement observer le motif de tourbillonnement de l&#39;échantillon de plaquettes. Note du produit en utilisant l&#39;échelle suivante. NOTE: 2 - Positif Swirl: Swirling hétérogénéité visible tout au long du sac avec un fort contraste. 1 - Intermédiaire Swirl: Certains hétérogénéité visible, mais seulement dans quelques endroits et avec un faible contraste. 0 - Swirl Négatif: homogénéité Turbid restant avant et après presser le sac de plaquettes </li></ol> 3. Processus riboflavine et la lumière UV: <ol><li> TranSFER le produit plaquettaire à un sac riboflavine et UV éclairage en lumière et de stockage à l&#39;aide d&#39;un dispositif d&#39;accueil tube stérile. Après le transfert enlever le sac de collecte de l&#39;unité de plaquettes vide à l&#39;aide d&#39;un scellement de tubes et de jeter le sac vide comme déchets biologiques. </li><li> Retirer une poche de 35 ml de 500 um riboflavine solution stock de sa lumière enveloppe extérieure de protection. Quai stérile du kit de riboflavine sur la ligne d&#39;entrée de la poche de traitement et de stockage. Laisser égoutter le contenu dans l&#39;unité de plaquettes. </li><li> Accrochez la riboflavine pochette / traitement et du stockage ensemble de sacs de la poche de riboflavine et d&#39;exprimer doucement l&#39;air résiduel du sac de traitement et de stockage et dans le sac de riboflavine. Assurer une petite quantité de produit plaquettaire est également exprimé dans la poche de riboflavine pour rincer toute la riboflavine résiduelle dans le produit plaquettaire. Laisser la solution de riboflavine et de plaquettes de vidange dans le sac de traitement et du stockage, puis serrer la ligne d&#39;entrée. Retirez la riboflavine sac vide-nousing un scellement de tubes et de jeter le sac vide comme déchets biologiques. </li><li> Quai stérile une ligne de tube 6 &quot;avec connecteur femelle de la seringue sur la ligne d&#39;entrée de la poche d&#39;illumination et de stockage. Joindre un cylindre de seringue de 10 ml (retirer le piston) sur le connecteur femelle de la seringue. </li><li> Ajouter aseptiquement 5 ml de bactéries sous licence dans le cylindre de seringue par l&#39;intermédiaire d&#39;une pipette. Ouvrez la pince sur la ligne d&#39;entrée et permettre aux bactéries de se déversent dans le produit plaquettaire. Rincer le cylindre de la seringue en permettant à certains des plaquettes produit de refluer dans le cylindre de la seringue de 10 ml. Retirez la seringue de 10 ml baril. </li><li> Fixer une seringue de manière aseptique de 30 ml et rincer l&#39;orifice d&#39;entrée d&#39;au moins deux fois pour assurer les bactéries sous licence est mélangé dans le produit de plaquettes. Après que le produit est bien mélangé, utilisez un chiffon propre 5-10 ml seringue et retirer un échantillon de 2 ml de pré-traitement. En utilisant une nouvelle seringue assurer l&#39;air introduit à partir de l&#39;étape d&#39;inoculation ou l&#39;étape d&#39;échantillonnage est retiré. <ol><li> Titrer l&#39;échantillon de pré-traitement par l&#39;article 4. </li></ol></li><li> Supprimez la ligne d&#39;entrée du sac de traitement et de stockage et peser le produit. </li><li> Placez le produit dans l&#39;illuminateur et suivez les commandes à l&#39;écran pour commencer un traitement de plaquettes standard. <ol><li> Entrez dans ID opérateur. </li><li> Secure monter le sac sur le plateau de l&#39;illuminateur. </li><li> Saisissez l&#39;ID de l&#39;échantillon dans l&#39;Illuminateur en utilisant soit le lecteur de code à barres ou le clavier de saisie manuelle. </li><li> Numérisation type de produit. </li><li> Fermez le collier de quartz. </li><li> Le dispositif d&#39;éclairage sera automatiquement offrir 6,24 J / ml de l&#39;énergie. Le temps de traitement typique prend de 5 à 10 min. </li></ol></li><li> Après le traitement quai stérile une ligne 6 &quot;des tubes avec connecteur femelle de la seringue sur la ligne de l&#39;ampoule de l&#39;échantillon de traitement et de sac de rangement. Assurez-vous que le produit est bien mélangé et puis fixez une seringue de 5 ml et prélever un échantillon de post-traitement 2 ml. <ol><li> Titrer le post-traitement samPLE par l&#39;article 4. </li></ol></li></ol> 4. bactérienne Titer <ol><li> Estimer le titre des échantillons de pré-traitement et de post-traitement et de préparer le nombre approprié de tubes de 5 ml de dilution nécessaires pour effectuer une dilution en série du point final de chaque échantillon. De remplir de façon aseptique les tubes nécessaires avec 1,8 ml d&#39;eau peptonée. </li><li> Titre chaque échantillon en utilisant un système de dilution en série de 10 fois. Transférer de manière aseptique 0,2 ml de l&#39;échantillon dilué au premier tube de dilution (10 -1). Vortex ce tube de dilution de 0,2 ml et le transfert vers le tube de dilution suivante. Continuer la dilution en série par le nombre requis de dilutions. <ol><li> Transfert de façon aseptique 100 ul de chaque dilution à plaquer à une plaque de gélose appropriée (Tableau 1). </li></ol></li><li> Utiliser un épandeur de cellules stérile, répartir uniformément l&#39;échantillon sur chaque plaque de gélose. </li><li> Inversez et incuber les plaques à des conditions appropriées ( <strong&gt; Tableau 1) pour 1-2 jours de vérification pour la croissance périodiquement. </li><li> Comptez plaques avec 30-300 colonies. Les plaques contenant plus de 300 colonies sont considérées comme trop nombreuses pour être comptées (TNTC). Les plaques contenant moins de 30 colonies sont considérés comme étant au-dessous de la limite de quantification (LOQ). </li><li> Calculer le titre de chaque échantillon de test et enregistrer les résultats en UFC / ml. <ol><li> Utilisez l&#39;équation suivante pour calculer UFC / ml: <img alt="Equation 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li> Si il n&#39;y a pas de colonies sur la plaque de dilution plus faible, utiliser l&#39;équation suivante pour calculer la limite de détection (LOD): <img alt="Equation 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> et <img alt="Équation 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> Où: N = la plus faible nombre de particules (UFC) à produit qui peut être détecté avec certitude. P = probabilité qu&#39;un microorganisme sera inaperçue; pour une fiabilité de 95% de la détection d&#39;un micro-organisme, P = 0,05. V = volume total du produit en ml v = volume plaqué (ml) x niveau de la plaque de dilution </li></ol></li><li> Pour le contrôle négatif, une plaque 0,5 ml de l&#39;eau peptonée qui est utilisé pour les dilutions en série sur chacune des deux plaques de gélose. Utiliser le même type de plaque que les échantillons à tester. Inversez et incuber la plaque à des conditions appropriées pendant 1-2 jours pour la croissance de vérifier périodiquement. <ol><li> Si la croissance est observée de part et plaque de gélose, la bouteille d&#39;eau peptonée usagé doit être jeté; les résultats de l&#39;étude sont également invalidés. </li></ol></li><li> Pour le contrôle positif, re-titre le stock culture de bactéries qui a été utilisé. Et inverser les plaques à incuber les conditions appropriées pendant 1-2 jours pour vérifier périodiquement la croissance. Le titre doit être de ± 1,0 log UFC / ml de l&#39;enregistremented Stock titre (Voir la section 1.5) pour l&#39;étude soit considéré comme valide. </li></ol>

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Tous les auteurs de ce document sont actuellement employés par Terumo BCT, développeur et fabricant du système PRT Mirasol. Publication frais pour cette vidéo-article ont été payés par Terumo BCT.

Détection bactérienne est devenu pratique courante dans les établissements bancaires de sang et pour de nombreux endroits, il sert comme la principale méthode pour empêcher transfusion de plaquettes contaminés par des bactéries. Bien que le dépistage bactérienne interdits généralement la majorité de croissance rapide des bactéries Gram-négatives telles que S. marcescens, E. E. coli et cloacae, il a du mal à détecter croissance lente bactéries à Gram positif comme S. aureus, Streptococcus spp. et S. 8 epidermidis. Malheureusement, ces bactéries Gram positives trois sont impliqués dans plus de 50% de toutes les unités de plaquettes contaminées et la transfusion de produits plaquettaires contenant ces trois organismes a conduit à la mortalité des patients 1. Criblage bactérienne repose sur le titre bactérienne dans un produit plaquettaire être assez suffisamment élevée pour que au moins un organisme est contenu dans le criblage typique échantillon de 8.4 ml. Si le titre bactérien est pas suffisamment élevée pour une bactérie à saisir dans le volume d&#39;échantillon de 4-8 ml, l&#39;unité est incorrectement marqué comme négatif et il est libéré pour transfusion. Une approche alternative au dépistage bactérienne pourrait être d&#39;employer un processus proactif qui peut être effectuée sur toutes les unités de plaquettes et qui pourraient rendre les organismes contaminants que la non-fonctionnelle. Dans cette étude, des titres élevés de bactéries ont été ajoutées exprès aux unités de plaquettes de tester la capacité du processus de réduction des agents pathogènes riboflavine lumière UV et réduction totale. Bien que les charges bactériennes testés dans cette étude dépassent de loin ceux qui se trouvent normalement dans les produits sanguins au moment du don, cette étude permet de démontrer que le processus de la riboflavine et la lumière UV est capable de réduire de façon significative le titre de bactéries viables dans une unité de plaquettes contaminées par 2,6 à 5,4 log (réduction de 99,7 à 99,9996% d&#39;bactéries contaminantes) (figure 2). Pour obtenir une accurate valeur de réduction logarithmique, il est essentiel que l&#39;opérateur possède une bonne technique aseptique ainsi que des compétences de pipetage précis lorsque vous effectuez les étapes de titre bactériennes. Pipetage imprécis lors de l&#39;exécution des dilutions en série peut conduire à une accumulation d&#39;erreurs, donc une mesure de titre inexacte. Les données recueillies dans cette étude prend en charge les travaux antérieurs avec la riboflavine et la lumière UV, qui contestait le système contre le faible niveau, la bactériémie cliniquement pertinente (&lt;20 UFC / unité). L&#39;étude précédente a été conçu pour imiter un événement clinique réel de contamination et les résultats ont montré la riboflavine et la lumière UV a été efficace dans la prévention de la croissance bactérienne au cours de la période de stockage des plaquettes de 7 jours. Modélisation basée sur les données de l&#39;étude précédente suggère que les estimations actuelles du risque de contamination bactérienne de produits plaquettaires pourraient être réduits par autant que 98% des niveaux actuels 8. Le processus de riboflavine et la lumière UV se compare favorablement à l&#39;écran bactérienneING, qui ne fait preuve d&#39;une efficacité de 66% pour détecter les contaminants bactériens dans les unités de plaquettes en cas de contestation avec une charge bactérienne cliniquement pertinente 8. Comme avec toutes les technologies, le traitement PRT de produits plaquettaires pour prévenir les complications associées à des unités de plaquettes contaminés par des bactéries a ses limites. Systèmes PRT ne sont pas efficaces contre les spores bactériennes et ne inactivent endotoxine, donc même si un système PRT peut inactiver des titres élevés de bactéries à Gram négatif l&#39;endotoxine restant peut encore provoquer un choc septique chez le receveur. PRT est préférable d&#39;effectuer tôt au cours du stockage avant que les bactéries peuvent se propager à des titres élevés. En conclusion, comme l&#39;a démontré par la combinaison de ces deux études, le processus de la riboflavine et la lumière UV est efficace pour réduire les charges bactériennes des deux organismes Gram positifs et Gram négatif et peut offrir une alternative viable au dépistage bactérienne. Régulièrement treating produits plaquettaires avec la riboflavine et la lumière UV a aussi l&#39;avantage de réduire la transmission potentielle d&#39;autres agents transmissibles par le sang comme les virus et les parasites.

La transfusion de plaquettes, plasma, globules rouges emballés et de produits sanguins entiers jouent un rôle majeur dans la médecine moderne et peut être utilisé pour traiter diverses conditions médicales, remplacer les liquides vitaux et, finalement, sauver des vies. Les plaquettes sont un produit cellulaire qui sont soit isolé à partir de sang total et regroupées dans une dose transfusable ou sont collectées à travers le processus d&#39;aphérèse. Le rôle principal de plaquettes dans le corps est pour arrêter le saignement au niveau des sites de la plaie et pour aider à maintenir l&#39;hémostase. Les patients souffrant d&#39;une faible numération cellulaire plaquettaire (thrombocytopénie) sont sensibles aux événements de saignements spontanés et sont transfuser des plaquettes à apporter leur cellule de numération plaquettaire de nouveau dans une fourchette normale. Les plaquettes collectées sont stockées pour un maximum de 5-7 jours et sont conservés à 22 ± 2 ° C tout sous agitation constante. Malgré le gain de propriétés de transfusions de plaquettes vie, il reste un léger risque pour les receveurs de transfusion en raison de contamination de ces produits par les parasites, les bactéries et les virus 11. La mise en œuvre des tests d&#39;acide nucléique viral (NAT) a diminué de façon significative le risque de transmission virale de diffusion hématogène principaux agents, tels que le virus de l&#39;hépatite C (VHC), virus de l&#39;hépatite B (VHB) et le virus de l&#39;immunodéficience humaine (VIH) 5. Une publication récente de l&#39;Société canadienne du sang estime que le risque résiduel pour ces agents serait de 1 pour 8 millions de dons pour le VIH, 1 par 6,7 millions de dons pour le VHC et 1 par 1,7 million de dons pour le VHB 15. Bien que les bactéries Garner généralement moins d&#39;attention dans le grand public, la fréquence de la contamination bactérienne dans les produits de plaquettes a été estimée à être aussi élevé que 1: 1000 7 et parce que des millions de produits plaquettaires sont transfusées chaque année de nombreux bénéficiaires sont exposés à un danger de mort des complications comme la septicémie 6. La recherche suggère que la charge bactérienne à l&#39;époquede contamination est faible, &lt;100 unités formant colonie (UFC) / produit 2,16, mais le riche environnement et la température ambiante entreposage d&#39;éléments nutritifs permet bactéries contaminantes à proliférer dangereusement élevés des titres avant la transfusion. Actuellement, les méthodes approuvées seulement disponibles pour empêcher les produits contaminés par des bactéries d&#39;atteindre un destinataire de plaquettes est par l&#39;utilisation de systèmes fondés sur la culture et point rapide de tests de soins. En bref, pour les systèmes de culture à base de produits de plaquettes sont stockées sur un agitateur à 22 ° C pendant 12 à 24 h pour permettre aux bactéries de proliférer dans le produit, sur lequel un échantillon de 4-8 ml est éliminé du produit de plaquettes et inoculé dans un flacon contenant des milieux nutritifs. La bouteille est placée dans un instrument qui surveille la bouteille pour la croissance bactérienne. Si l&#39;instrument détecte la croissance bactérienne dans la bouteille, il se trouve en position et l&#39;unité de plaquettes correspondant est éliminé. Bien que ce processus est raisonnablement réussi à détecter gro rapideorganismes de l&#39;aile, la plupart des espèces à croissance lente ne poussent pas à un titre suffisamment élevé pour être détecté, créant ainsi le potentiel d&#39;unités faux négatifs à être libéré pour la transfusion 7,12,14,16,22. Contrairement fondés sur la culture des systèmes de détection, le point rapide de tests de soins est généralement effectuée plus tard dans la période de stockage des plaquettes lorsque la charge bactérienne a augmenté de manière significative. Les titres plus élevés sont nécessaires puisque le point de tests de soins sont moins sensibles que les systèmes fondés sur la culture, et seulement détecter de manière fiable les bactéries une fois qu&#39;ils atteignent un titre ≥1 x 10 3 UFC / ml 17. Cependant, de tels tests peuvent fournir des résultats en 1 heure de l&#39;échantillonnage. La variabilité de la performance de ces tests ont conduit à la libération d&#39;un produit de faux négatifs, ce qui provoque une réaction septique fatale chez le receveur 9. Une autre manière de lutter contre le problème de la contamination bactérienne de produits plaquettaires est grâce à l&#39;utilisation de routine d&#39;un proc de réduction des agents pathogènesESS qui peuvent inactiver les bactéries contaminantes lieu d&#39;essayer de les détecter. Utilisation de la riboflavine comme photosensibilisant, en combinaison avec de la lumière UV, on a démontré à réduire l&#39;infectivité d&#39;un large éventail de contaminants pathogènes à diffusion hématogène, y compris les bactéries 3,4,8,10,19-21 .L&#39;utilisation de riboflavine et UV la lumière pour la réduction des agents pathogènes est non-toxique et non mutagène, et riboflavine et UV composants légers traités ont été montré pour être sans danger pour les transfusés ainsi que pour ceux qui manipulent les produits sanguins 18. En bref, des molécules riboflavine peut associer aux acides nucléiques (ADN et ARN) des bactéries, des parasites, des virus et des cellules nucléées (par exemple les globules blancs). L&#39;exposition à la lumière UV active la riboflavine, ce qui provoque une modification chimique de groupes fonctionnels des acides nucléiques (bases de guanine principalement), empêchant ainsi la réplication et / ou la transcription des acides nucléiques et en laissant l&#39;organisme inactivé 13. Cellules anucléées comme plaqueet permet aux globules rouges ne sont pas affectés par la chimie de la riboflavine en raison de l&#39;absence de l&#39;acide nucléique. Des travaux antérieurs avec la technologie la riboflavine et la lumière UV a évalué un groupe restreint de bactéries en utilisant une conception expérimentale visant à imiter un produit plaquettaire contaminé par une charge bactérienne cliniquement pertinente (&lt;20 UFC / produit) 8. Le but de cette étude était d&#39;évaluer le processus de riboflavine et la lumière UV contre la contamination bactérienne de titre élevé (&gt; 1,0 x 10 5 UFC / ml) dans les produits plaquettaires traités dans le plasma afin de mesurer la capacité de réduction bactérienne totale du système. Basé sur des données recueillies à partir d&#39;études d&#39;hémovigilance 1, un panel d&#39;survenant couramment organismes Gram positifs et négatifs du gramme a été sélectionné pour l&#39;évaluation dans cette étude et inclus les espèces suivantes: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica ,Brucella neotomae, Bacillus cereus (forme végétative), Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa et Klebsiella pneumoniae. Tous les organismes, à l&#39;exception B. cereus, on a obtenu auprès de l&#39;ATCC et la priorité a été placée obtention de souches bactériennes qui ont été identifiés comme étant isolé à partir de composants sanguins. Le B. cereus testée dans cette étude est une souche clinique isolée à l&#39;intérieur d&#39;un produit plaquettaire contaminé.

<table><tbody><tr><td>Mirasol Illuminator</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Mirasol Sac de traitement/stockage</td><td>Terumo BCT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur d’hématologie</td><td>Beckman-Coulter</td><td>Ac&bull ; T diff&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Analyseur de gaz du sang</td><td>Siemens</td><td>RapidLab 1265&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Dispositif d’amarrage stérile</td><td>Terumo BCT</td><td>TSCD</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur de plaquettes</td><td>Helmer</td><td>PC2200</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur orbital Shaker</td><td>Lab-Line</td><td>4628</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur sec</td><td>Fisher</td><td>Iso-temp</td><td></td></tr><tr><td>Classe II A/B3 Biosafety Cabinet</td><td>Thermo-forma</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>Tubing</td><td>Sealer Sebra</td><td>Smart Sealer II</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de table</td><td>IEC</td><td>Centra GP8R</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Seringue</td><td>BD</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>30 ml Seringue</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>Tube de dilution 5 ml</td><td>VWR</td><td>211-0058</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Tube conique</td><td>Corning</td><td>430290</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Gilson</td><td>P-200</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>Rainin</td><td>R-200</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Repeat</td><td>Eppendorf</td><td>4780</td><td></td></tr><tr><td>1-200 & micro ; l Pointe filtre</td><td>Costar</td><td>4810</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Pipette sérologique jetable</td><td>Costar</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Pipette sérologique jetable</td><td>Costar</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>35 ml 500 &micro ; M Riboflavine</td><td>Terumo BCT</td><td>35 mL 500 &micro ; M&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Gélose Brucella avec 5 % de sang de cheval</td><td>BBL</td><td>221547</td><td></td></tr><tr><td>infusion de cerveau et de cœur</td><td>Teknova</td><td>B9993</td><td></td></tr><tr><td>Eau peptone</td><td>BD</td><td>257087</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon de soja trypticase</td><td>BD</td><td>299113</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Agar</td><td>Remel</td><td>R01917</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de cheval inactivé par la chaleur</td><td>Gibco</td><td>26050</td><td></td></tr></tbody></table>

le traitement des produits plaquettaires avec riboflavine et la lumière uv: efficacité contre haute titer contamination bactérienne

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

La contamination des unités de plaquettes par les bactéries est reconnu depuis longtemps comme un risque de transfusion en raison de leur importante des conditions de stockage après le don. Les produits sont stockés en routine à 22 ° C dans un agitateur sous agitation, une condition qui peut promouvoir la croissance bactérienne. Bien que le nombre total de bactéries censées être introduits dans un produit de plaquettes est extrêmement faible, ces bactéries peuvent se multiplier à un titre très élevé avant la transfusion, ce qui pourrait entraîner des effets indésirables graves. Le but de cette étude était d&#39;évaluer un processus de réduction des agents pathogènes de la riboflavine base sur un panel de bactéries qui ont été identifiés comme des contaminants courants de produits plaquettaires. Ce groupe comprenait les organismes suivants: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa et K. pneumoniae. Chaque unité plaquettaire a été inoculé avec une charge bactérienne élevée et ont été retirés des échantillons both avant et après traitement. Une colonie essai de formation, en utilisant un schéma point de dilution final, a été utilisé pour déterminer les titres bactériennes pré-traitement et de post-traitement. Connexion réduction a été calculé en soustrayant le titre du titre de pré-traitement de post-traitement. Les réductions de journaux suivants ont été observés: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4.0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B. neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5.4 journal (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) et K . pneumoniae 2,8 log (99,8%). Les résultats de cette étude suggèrent que le processus pourrait aider à réduire le risque de graves incidents transfusionnels indésirables associés à la contamination bactérienne.

La réduction de onze espèces bactériennes différentes a été évaluée en utilisant le procédé EPR de riboflavine et la lumière UV. Ces agents représentent certains des contaminants les plus courants de produits plaquettaires et comprennent cinq Gram positif et Gram six organismes négatifs. Au moins six produits ont été évalués par des plaquettes organisme et chaque produit a été inoculées avec suffisamment de bactéries pour donner&gt; 1,0 x 10 5 CFU / ml titre final de bactéries dans le produit de plaquettes. Avant le traitement d&#39;un échantillon a été prélevé pour déterminer le titre de pré-traitement, après quoi le produit a été rapidement des plaquettes traitée avec la riboflavine et procédé UV. Après le traitement des produits plaquettaires les réductions de journaux suivants ont été observés: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4.0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3,3 log (99,95%), B.neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥ 5,4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) et K. pneumoniae 2,8 log (99,8%) (figure 2). Toutes les unités ont rencontré les spécifications du système comme indiqué ci-dessus pour la riboflavine et le processus UV. Les tests de réduction supplémentaire a été réalisée avec S. pyogenes utilisant Buffy coat plaquettes dérivées. Aucune différence significative n&#39;a été observée dans la réduction de S. pyogenes dans couenne plaquettes dérivées par rapport aux plaquettes d&#39;aphérèse (données non présentées). <img alt="Tableau 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> Tableau 1: conditions de croissance pour les espèces bactériennes évaluées à l&#39;aide de la riboflavine et la lumière UV. Un panel de deux bactéries à Gram positif et Gram négatif qui ont été montrés à contaminer les produits plaquettaires ont été sélectionnés pour cette étude. Les conditions de croissance (température et les médias de type) utilisés pour propager et titer les organismes sont présentés. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> Figure 1: La riboflavine et UV processus de réduction de la lumière de l&#39;agent pathogène. La riboflavine est dissous dans 0,9% de solution saline à une concentration nominale de 500 uM. La solution était stérile connecté et drainé dans chaque produit plaquettaire. Les bactéries ont été ajoutés de manière aseptique dans chaque unité de plaquettes et ensuite traités avec 6,2 J / ml de l&#39;énergie UV (environ 6-10 minutes). Dans cette étude in vitro de l&#39;unité de traitement post-plaquettaire a été échantillonné pour déterminer le titre bactérienne finale. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> Figure 2: Réduction de différentes espèces bactériennes lorsqu&#39;ils sont traités avec la riboflavine et la lumière UV riboflavine et la lumière UV a été utilisé pour réduire la charge bactérienne de contaminants bactériens courants de produits plaquettaires.. La réduction log 10 est la différenceentre le titre de pré-traitement moyen et la moyenne titre post-traitement. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Les conditions de stockage des produits plaquettaires créent un environnement idéal pour que les contaminants bactériens se multiplient à des niveaux dangereux. Le but de cette étude était d’utiliser un test de formation de colonies pour évaluer un processus de réduction des agents pathogènes à base de riboflavine contre une contamination bactérienne à titre élevé dans les produits plaquettaires humains.

Le traitement des produits plaquettaires avec riboflavine et la lumière UV: Efficacité contre Haute Titer contamination bactérienne

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la réduction des contaminants bactériens courants dans les produits plaquettaires à l'aide d'un procédé de réduction des agents pathogènes basé sur la riboflavine et les UV. Cela est réalisé en préparant d'abord un stock de bactéries à forte concentration. La deuxième étape consiste à obtenir un produit plaquettaire humain et à évaluer la qualité cellulaire de l'unité.Ensuite, l'unité de plaquettes est dosée avec du riboflavine et inoculée avec une concentration connue de bactéries. L'étape finale consiste à traiter l'unité avec une lumière UV. En fin de compte, la réduction bactérienne est mesurée en comparant des échantillons prélevés avant et après le traitement, afin de quantifier les bactéries viables par un essai de culture par dilution en série jusqu'au point final.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que le dépistage bactérien, réside dans le fait que la riboflavine et la lumière UV peuvent inactiver d'autres agents pathogènes comme le VIH, le VHC, le paludisme et la Babésie. Les implications de cette technologie vont au-delà des agents pathogènes transmissibles par le sang, car elle est également capable d'inactiver les globules blancs et les produits sanguins donnés. Ces derniers ont été associés à des événements indésirables liés aux transfusions, tels que la maladie du greffon contre l'hôte associée à la transfusion.J'ai d'abord eu l'idée d'utiliser cette méthode pour inactiver les agents pathogènes dans le sang à travers des études que je menais sur l'interaction de composés, des composés photochimiques avec les acides nucléiques. La technique exploite le fait que les agents pathogènes, contrairement aux globules rouges, aux plaquettes et aux protéines plasmatiques, contiennent des acides nucléiques génomiques essentiels à la réplication et à la transmission des maladies. Ainsi, en ciblant la chimie des acides nucléiques dans le milieu des produits sanguins présents, nous pouvons inactiver de manière plus sélective les agents pathogènes tout en préservant la qualité des constituants des globules rouges, des plaquettes et des protéines plasmatiques. Démonstration de la procédure.Aujourd'hui, ce seront Nick HOA, scientifique en laboratoire, et Denise Gilmore, technicienne de laboratoire. Préparez tout d'abord un flacon stérile de 250 millilitres contenant 100 millilitres de milieu de croissance spécifique pour la bactérie d'intérêt. À l'aide d'une anse de prélèvement stérile, ensemencez une colonie bactérienne unique provenant d'une boîte de culture en strie dans le milieu.Ensuite, placez le flacon dans un incubateur agitateur orbital. Réglez la vitesse de l'agitation à 140 tr/min et incubez la culture pendant un à deux jours. Vérifiez périodiquement la culture pour observer la croissance bactérienne.Après l'incubation, transférez la suspension bactérienne dans deux tubes coniques stériles de 15 millilitres. Centrifugez les tubes à 3000 ×g pendant 20 minutes à 23 °C. Ensuite, aspirez le surnageant et resuspendez le culot bactérien avec 15 millilitres d'eau stérile pour peptides.Vortexez les tubes pour faciliter la suspension, puis rassemblez les cultures bactériennes remises en suspension afin de concentrer la culture stock. Remplissez cinq tubes de dilution avec 1,8 millilitre d’eau peptoneuse chacun. Transférez 200 microlitres d’échantillon non dilué dans le premier tube, vortexez le tube, puis transférez 200 microlitres dans le tube suivant.Répéter jusqu'à ce que la dilution appropriée soit atteinte. Transférer 100 microlitres de chaque dilution dans une plaque agrée appropriée. À l'aide d'un répartiteur de cellules stérile, répartir uniformément. Distribuer l'échantillon sur l'AER pour une plaque témoin négative.500 microlitres de l'eau peptidique sur deux plaques d'agar. À l'aide d'un étaleur cellulaire stérile, répartir uniformément l'échantillon sur la surface de l'agar, retourner toutes les plaques et les incuber à la température appropriée pendant un à deux jours après l'incubation. Si une croissance est observée sur l'une des plaques témoins négatives, l'eau peptidique est contaminée et le titre est invalide.Si les plaques du témoin négatif sont négatives, compter les colonies sur toutes les plaques présentant entre 30 et 300 colonies. Ensuite, calculer le titre de chaque échantillon testé et enregistrer les résultats en quelques unités par millilitre. Réfrigérer les cultures bactériennes jusqu'à deux semaines à quatre degrés Celsius.Pour assurer une précision optimale, refaire le titrage de la culture avant utilisation. Obtenir un produit standard de plaquettes humaines par aphérèse, d'un volume de 90 à 360 millilitres, avec une concentration de 0,80 à 3,8 millions de plaquettes par microlitre. Laisser le sac reposer pendant au moins deux heures dans un incubateur à plaquettes à 22 degrés Celsius, puis agiter doucement à 60 tr/min jusqu'à utilisation.Prélèvez un échantillon de deux millilitres du produit plaquettaire et utilisez un analyseur de gaz sanguins à 22 degrés Celsius pour vous assurer que le pH est supérieur à 6,6. À l’aide du même échantillon, mesurez la concentration en plaquettes à l’aide d’un analyseur hématologique afin de vérifier qu’elle se situe dans la plage souhaitée. Ensuite, inspectez visuellement le sac de plaquettes en le tenant sous une source de lumière blanche directe.Comprimez brièvement le sac et observez le motif tourbillonnant de l'échantillon. Si une homogénéité trouble persiste avant et après la compression du sac, n'utilisez pas les plaquettes avec un dispositif d'assemblage de tubulure. Transférez les plaquettes dans un sac de stockage soumis à une illumination par riboflavine et lumière UV.Retirer le sac à plaquettes vide à l'aide d'un scelleur de tubulure et le jeter comme déchet biologique dangereux. Ensuite, retirer l'emballage extérieur protecteur contre la lumière de la solution mère stérile de riboflavine à 500 micromolaire. Connecter le pochon de riboflavine sur la tubulure d'entrée du sac de traitement et de conservation, puis vidanger son contenu dans l'unité de plaquettes.Ensuite, suspendez le pochon et le jeu de poche de traitement au pochon de riboflavine. Appuyez doucement pour chasser l'air résiduel du sac de traitement vers le sac de riboflavine. Rincez tout résidu de riboflavine dans le pochon de plaquettes à l'aide d'une petite quantité de produit plaquettaire.Laisser le riboflavine et la solution plaquettaire s'écouler à nouveau dans le sac de traitement. Puis pincer la ligne d'entrée. Retirer le sac vide de riboflavine à l’aide du scelleur de tubulure et jeter le sac vide de manière appropriée, en respectant les règles d’asepsie.Connectez une tubulure de six pouces munie d'un raccord femelle pour seringue à la tubulure d'entrée du sac d'illumination et de stockage. Fixez un cylindre de seringue de 10 millilitres à la tubulure. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de la suspension bactérienne munie de tige dans le cylindre de la seringue.Ouvrir ensuite la pince de la ligne d'entrée et laisser s'écouler les bactéries dans le produit plaquettaire. Rincer le corps de la seringue en laissant un peu de produit plaquettaire revenir en arrière. Après le rinçage, retirer le corps de la seringue.Fixez une seringue de 30 millilitres et rincez l’orifice d’entrée au moins deux fois une fois le produit bien mélangé. À l’aide d’une seringue propre de cinq millilitres, prélève un échantillon de deux millilitres avant le traitement. Utilisez une seringue neuve pour éliminer tout air introduit dans le sac.Ensuite, retirez la ligne d'entrée du sac de traitement et pesez la solution de plaquettes. Commencez le traitement des plaquettes en saisissant d'abord l'identifiant de l'opérateur, puis fixez le sac sur l'illuminateur pla. Saisissez ensuite l'identifiant de l'échantillon à l'aide d'un lecteur de codes-barres.Saisissez le type de produit et son poids dans le logiciel. Ensuite, fermez la pince en quartz pour délivrer automatiquement 6,24 joules par millilitre d'énergie ultraviolette. Le traitement typique dure de cinq à dix minutes.Entre-temps, dressez le titre de l'échantillon prétraitement après traitement UV, dressez le titre d'un échantillon post-traitement afin d'évaluer la survie bactérienne, puis dressez le titre de la culture bactérienne témoin comme contrôle positif. Le titre de la culture témoin devrait se situer à moins d'une unité logarithmique (CFU par millilitre) par rapport à son titre enregistré. La réduction de 11 espèces bactériennes différentes a été évaluée à l'aide de la riboflavine et d'un procédé de réduction des agents pathogènes fondé sur la lumière UV.Au moins six produits plaquettaires ont été évalués par organisme et chacun a été inoculé. Avec une quantité suffisante de bactéries, une concentration finale supérieure à 10 000 UFC par millilitre, des échantillons ont été prélevés avant le traitement, ainsi qu'immédiatement après le traitement au riboflavin et aux UV, par rapport aux solutions prétraitées. Toutes les charges bactériennes ont été réduites d'au moins 2,6 unités logarithmiques, soit environ 400 fois, par le traitement au riboflavin et à la lumière UV.À la suite de ces études réalisées avec des bactéries à titre élevé, des études supplémentaires peuvent être menées en utilisant des titres d'inoculum plus cliniquement pertinents. Ceux-ci reflètent en réalité les niveaux de bactéries susceptibles d'être présents dans les produits au moment du don. L'objectif de ces études avec un inoculum à faible titre est d'évaluer la capacité de la méthode à empêcher la croissance bactérienne et à maintenir les produits négatifs en culture pendant la période de stockage, y compris des durées prolongées de stockage à température ambiante.Depuis l'introduction de cette technologie, les chercheurs et les professionnels de la santé peuvent évaluer la capacité d'inactiver un large spectre de pathogènes et utiliser cette technologie pour prévenir la transmission de maladies par transfusion. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment mesurer la réduction logarithmique des bactéries dans un produit plaquettaire hautement contaminé traité au riboflavine et à la lumière UV.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

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Source : Cheng, C., et al. Inactivation des agents pathogènes par photolyse en lumière visible de la riboflavine-5'-phosphate. J. Vis. Exp. (2022).Dans cette vidéo, un mélange réactionnel tamponné contenant de la L-méthionine, du nitro-bleu tétrazolium (NBT) et du mononucléotide de flavine (FMN) est irradié avec une lumière violette pour induire la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS). Cela conduit à l’inactivation bactérienne et à la formation de formazan détectable par...

Quantification de l’inactivation bactérienne induite par la lumière par génération d’espèces réactives de l’oxygène

Source : Zhao, K., et al. Un modèle in vitro pour étudier l’effet de la thérapie photodynamique médiée par l’acide 5-aminolevulinic sur le biofilm de Staphylococcus aureus . J. Vis. Exp. (2018)La vidéo présente un protocole de thérapie photodynamique pour évaluer les effets antibactériens sur les biofilms bactériens Gram-positifs. Les biofilms sont divisés en quatre groupes : deux reçoivent un précurseur photosensible, et deux reçoivent un tampon. Tous sont incubés dans l’obscurité, suivis...

Traitement activé par la lumière des biofilms bactériens à l’aide d’un précurseur photosensible

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Ce protocole décrit une méthode simple et économique pour évaluer l’efficacité des photosensibilisants potentiels dans l’inactivation photodynamique antibactérienne (aPDI), en utilisant un format de plaque à 96 puits combiné à une source lumineuse de panneau LED. Cette approche permet de tester simultanément plusieurs conditions expérimentales, y compris différentes concentrations, composés et souches bactériennes.

Criblage in vitro à base de LED pour l’évaluation de molécules photoactivables dans l’inactivation photodynamique bactérienne

Découvrez la réduction des agents pathogènes par riboflavine et UV dans les produits plaquettaires humains. Cette méthode élimine efficacement les bactéries à haut titre tout en préservant la qualité des composants sanguins.

Le traitement des produits plaquettaires avec riboflavine et la lumière UV: Efficacité contre Haute Titer contamination bactérienne (Vidéo) | JoVE Journal

Le traitement des produits plaquettaires avec riboflavine et la lumière UV: Efficacité contre Haute Titer contamination bactérienne

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