Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche
14 mai 2015
Ce protocole décrit en détail la méthode de génération de progéniteurs neuronaux à partir de cellules souches embryonnaires à l’aide d’une méthode monocouche sans sérum. Ces progéniteurs peuvent être utilisés pour dériver des types de cellules neurales matures ou pour étudier le processus de spécification neuronale et se prêtent à la mise à l’échelle de formats multipuits pour le criblage de composés.
L'objectif général de cette procédure est de différencier des cellules souches embryonnaires de souris vers une lignée neuronale dans une culture cellulaire en monocouche sans sérum. Cela est réalisé en premier lieu en recouvrant le récipient de culture avec de la gélatine. Dans la deuxième étape, les cellules souches embryonnaires sont dissociées en une suspension monocellulaire dans un milieu de différenciation et diluées aux densités d'ensemencement appropriées.
À l'étape finale, les cellules sont semées sur la plaque revêtue de gel ENC. En fin de compte, la microscopie en immunofluorescence est utilisée pour confirmer la réussite de la différenciation par la visualisation des marqueurs neuronaux d'intérêt. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car le semis à une densité appropriée est essentiel pour obtenir une bonne différenciation.
Et plusieurs facteurs influencent directement et indirectement la densité de mise en culture. Avant de semer les cellules, réchauffez un aliquot de gélatine à 1 % dans un bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu'à dissolution. Mélangez ensuite la gélatine avec 500 millilitres de PBS tiède et recouvrez le fond du récipient de culture cellulaire d'une quantité suffisante de solution pour en tapisser la surface, pendant que la gélatine s'adsorbe.
Rincez deux fois la culture subconfluente de cellules souches embryonnaires de souris dans du PBS. Ajoutez ensuite un millilitre de réactif de dissociation à la culture. Après deux à cinq minutes, tapez légèrement sur le récipient pour détacher la monocouche en une suspension de cellules uniques et récupérez la culture dans un volume total de 10 millilitres de milieu et de réactif de dissociation cellulaire.
Transférez les cellules dans un tube conique de 50 millilitres et faites-les précipiter dans une centrifugeuse. Après avoir soigneusement aspiré le surnageant, resuspendez le culot dans 10 millilitres de N deux B 27 préalablement réchauffé en tapotant contre la paroi du tube. Pour éviter la formation de bulles, comptez ensuite les cellules en notant la concentration et resuspendez-les au nombre approprié de cellules par unité de volume par puits dans le milieu N deux B 27 préalablement réchauffé, conformément au tableau.
Ensuite, aspirez la gélatine du récipient de culture et ensemencez les cellules sans agiter le contenant. Placez les cultures dans un incubateur humide à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Remplacez le milieu tous les un à deux jours.
Avec du N deux B 27 frais, les cellules commenceront à se différencier et à exprimer des socks, une expression détectable en quatre à six jours pour la coloration des cellules en vue d'une imagerie par immunofluorescence. Retirer le milieu de différenciation des cultures et fixer les cellules dans 500 microlitres de paraformaldéhyde à 4 %. Après 15 minutes, laver et permeabiliser les cellules deux fois avec deux millilitres de PBS contenant du tween. Bloquer ensuite toute liaison non spécifique par une incubation d'une heure des cellules.
Dans un millilitre de PBS Tween complété par du sérum sur un agitateur de plaque après avoir lavé les cellules comme vient d'être démontré. Ajouter 500 microlitres d'IgG de souris dirigée contre la tubuline bêta trois aux cultures pour une incubation nocturne sur l'agitateur de plaque à quatre degrés Celsius. Le lendemain.
Après avoir lavé les cellules, incuber les échantillons dans un anticorps secondaire anti-IgG-US marqué avec un fluorochrome, à température ambiante et à l’abri de la lumière, avec agitation, pendant une heure. Rincer à nouveau les cellules et les colorer dans 500 microlitres de DPI pendant cinq minutes. Enfin, après un dernier lavage des cellules, les conserver dans du PBS tween jusqu’à deux semaines à quatre degrés Celsius.
Jusqu'à l'acquisition des images. Dans cette expérience, des cellules souches embryonnaires de souris portant un rapporteur GFP intégré pour SOX1 ont été utilisées afin de suivre la différenciation neuronale. Au jour six, les cellules ont été fixées et marquées pour le marqueur neuronal bêta-tubuline 3.
À la densité optimale, les cellules se différenciaient en progéniteurs neuronaux et en neurones, tandis qu'une densité plus élevée entraînait une diminution du nombre de cellules positives pour SOX1 GFP et la tubuline bêta 3. Le volume du récipient de culture cellulaire influence également la densité d'ensemencement optimale. Par exemple, les cellules cultivées dans une plaque de 96 puits nécessitent une densité cellulaire environ 10 fois plus élevée.
Les cellules sont ensemencées dans une plaque de culture à six puits afin d'atteindre deux densités cellulaires optimales. Pendant la différenciation, les cellules souches embryonnaires modifient progressivement leur morphologie. Par exemple, sur ces images, la morphologie des cellules et des colonies peut être observée entre le jour un et le jour six suivant l'ensemencement à la densité cellulaire optimale.
Le quatrième jour, les cellules commencent à devenir des progéniteurs neuronaux, comme en témoigne l'apparition d'un signal fluorescent vert provenant du rapporteur SOX1-GFP. Au sixième jour, la majorité des cellules sont positives pour SOX1. Bien que la présence de certaines cellules non neuronales soit attendue, après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'initier la différenciation neuronale de cellules souches embryonnaires murines en culture cellulaire en monocouche.
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Aperçu
Ce protocole décrit la différenciation de cellules souches embryonnaires murines en progéniteurs neuronaux à l'aide d'une méthode en monocouche sans sérum. Cette approche permet la génération de types cellulaires neuronaux matures et convient à un dimensionnement en format multi-puits pour le criblage de composés.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie cellulaire
- Recherche sur les cellules souches
Contexte
- Les cellules souches embryonnaires peuvent se différencier en divers types cellulaires.
- Les progéniteurs neuronaux sont essentiels à l'étude du développement neural.
- Les méthodes de culture sans sérum peuvent améliorer la reproductibilité.
- Une densité d'ensemencement adéquate est cruciale pour une différenciation réussie.
Objectif de l'étude
- Établir une méthode fiable pour générer des progéniteurs neuronaux.
- Faciliter l'étude des processus de spécification neuronale.
- Permettre le criblage à haut débit de composés affectant la différenciation neuronale.
Méthodes utilisées
- Revêtement des récipients de culture avec de la gélatine.
- Création d'une suspension monocellulaire de cellules souches embryonnaires.
- Ensemencement des cellules sur les plaques revêtues de gélatine.
- Utilisation de la microscopie par immunofluorescence pour confirmer la réussite de la différenciation.
Résultats principaux
- Différenciation réussie des cellules souches embryonnaires en progéniteurs neuronaux.
- La visualisation des marqueurs neuronaux confirme la différenciation.
- Mise en place de densités de semis optimales pour une différenciation efficace.
- La méthode est reproductible à plus grande échelle pour des applications de criblage de composés.
Conclusions
- La méthode en couche unique sans sérum est efficace pour la génération de progéniteurs neuronaux.
- L'immunofluorescence est une technique fiable pour évaluer la différenciation.
- Ce protocole peut être adapté à diverses applications de recherche en neurosciences.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet une production échelonnée de progéniteurs neuronaux à partir de cellules souches embryonnaires murines dans un système monocouche défini et sans sérum, soutenant la validation précoce des cibles et la réduction des risques mécanistiques dans la découverte de médicaments en neurosciences. La méthode offre une plateforme reproductible et quantitative pour évaluer les effets des composés sur la différenciation neuronale, facilitant l'identification de candidats prometteurs et renforçant la fiabilité prédictive des pipelines précliniques. Sa compatibilité avec des lignées rapporteuses et des formats de culture en haute densité permet son intégration dans des procédures de criblage destinées à des études de modulation des voies de signalisation et d'engagement des cibles.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Découverte précoce et validation de cibles
- Valeur scientifique : Permet d'étudier les mécanismes de spécification neuronale et de valider fonctionnellement les cibles du développement neuronal par différenciation dirigée.
- Valeur opérationnelle : Fournit un système défini et sans sérum qui réduit la variabilité et améliore la reproductibilité entre les expériences et les lignées cellulaires.
- Valeur prédictive : Permet d'évaluer les modifications induites par des composés sur le rendement des progéniteurs neuronaux et sur l'expression des marqueurs, fournissant ainsi des informations sur l'engagement des cibles et la modulation des voies.
Développement de tests et criblage
- Valeur scientifique : Génère une population homogène de progéniteurs neuronaux adaptée au criblage de composés et à l'évaluation phénotypique de la différenciation neuronale.
- Valeur opérationnelle : Adaptable à des formats multi-puits (par exemple, 96 puits) avec une optimisation de la densité de semis évolutive, permettant des applications allant du débit moyen au haut débit.
- Préparation des tests : Compatible avec l'immunofluorescence, la cytométrie en flux et les détections moléculaires pour une analyse multiparamétrique de l'efficacité de la différenciation et de l'expression des marqueurs.
Recherche translationnelle et préclinique
- Continuité translationnelle : Permet la progression de la génération de progéniteurs neuronaux jusqu'à la maturation fonctionnelle des neurones et des cellules gliales, soutenant la modélisation pertinente des maladies.
- Dérisquage mécanistique : Facilite l'étude de l'engagement lignagique et des dynamiques de différenciation à l'aide de lignées rapporteuses (par exemple, SOX1-GFP) pour surveiller en temps réel la spécification neuronale.
- Utilité préclinique : Permet d'évaluer les effets de composés sur la maturation neuronale et la différenciation gliale, soutenant ainsi les études de pharmacologie de sécurité et de mécanisme d'action.
Intégration des pipelines et des flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, soutenant la validation de cibles grâce à l'analyse mécanistique de la différenciation neuronale et permettant le développement de tests pour le criblage de composés dans les portefeuilles de neurosciences.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses sur les voies du développement neuronal et la validation de cibles grâce à une différenciation dirigée et des lectures basées sur des marqueurs.
- Écranage : Permet la standardisation et la reproductibilité des tests en culture en monocouche, la densité de semis étant un paramètre critique pour une génération reproductible de progéniteurs neuronaux.
- Analytique : Fournit des données quantitatives par immunofluorescence (par exemple, SOX1-GFP, βIII-tubuline) et cytométrie en flux afin de mesurer l'efficacité de la différenciation et la réponse aux composés.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la génération précoce de progéniteurs neuronaux et leur maturation ultérieure en neurones et cellules gliales fonctionnels, assurant ainsi une continuité préclinique.
- Réutilisation en milieu professionnel : Un protocole défini et évolutif permet une réutilisation fiable sur plusieurs lignées de cellules souches embryonnaires, types de récipients de culture et campagnes d'écranage, réduisant ainsi les efforts de redéveloppement.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Renforce la confiance prédictive dans la validation des cibles en réduisant l'ambiguïté mécanistique des voies de différenciation neuronale.
- Valeur opérationnelle : Des conditions standardisées et sans sérum améliorent la reproductibilité et la reproductibilité à grande échelle entre laboratoires et lignées cellulaires.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'avancement ou d'abandon en permettant une évaluation précoce des effets des composés sur l'engagement dans la lignée neuronale et l'efficacité de la différenciation.
- Impact sur le portefeuille : Favorise la priorisation ajustée au risque des cibles en neurosciences grâce à la réduction des incertitudes mécanistiques et à la validation des voies.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches, en techniques de différenciation et en microscopie par immunofluorescence.
- Dépend de l'accès à des incubateurs à CO2, à des centrifugeuses, à des microscopes et à des réactifs tels que la gélatine, le N2B27, les réactifs de dissociation et les anticorps.
- Exige une standardisation de la densité de semis et des procédures d'encollage à la gélatine entre les utilisateurs et les sites afin d'assurer la reproductibilité.
- L'adaptation à différentes lignées de CSE ou à des constructions rapporteuses peut nécessiter une optimisation de la densité d'ensemencement et du moment de la différenciation.
- Les limites pratiques incluent la sensibilité à la densité de semis et la nécessité d'une dissociation soigneuse de la monocouche afin d'éviter les agrégats ou une suspension incomplète en cellules isolées.
