Name: Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 9 s
Description: Apprenez la différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris en culture monocouche sans sérum. Cette méthode permet de générer des progéniteurs neuronaux pour le criblage de composés.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Work a été financé par une bourse de développement et de promotion de la science et de la technologie du ministère thaïlandais de l’Éducation à W.W. et des subventions de Tenovus et de l’Anonymous Trust à M.P.S.

1. Préparation des médias NOTE: Le protocole repose sur l&#39;utilisation d&#39;un mélange de deux supports séparés: DMEM / F12 additionné de supplément N2 modifié et Neurobasal additionné de supplément B27, typiquement dans un rapport de 1: 1. <ol><li> Préparer le supplément N2 modifié en mélangeant les composants dans un tube de 15 ml. Ne pas vortex ou filtrer cette; mélanger en inversant le tube jusqu&#39;à ce que la solution est claire. <ol><li> Commencez par pipetage 7,2 ml de DMEM / F12, puis ajouter 1 ml de 25 mg / ml d&#39;insuline (constitué dans HCl 0,01 M) et bien mélanger en inversant le tube. Il prend quelques minutes jusqu&#39;à ce que la solution est claire. </li><li> Ajouter 1 ml de 100 mg / ml apo-transferrine (préparés dans l&#39;eau), 33 pi de 0,6 mg / ml progesternone (faites dans de l&#39;éthanol), 100 pi de 160 mg / ml (1 M) putrescine (composé dans l&#39;eau ), 10 pl de sélénite 3 mM de sodium (préparés dans l&#39;eau) et 666 ul de 7,5% d&#39;albumine de sérum bovin et bien mélanger le tube. Aliquote dans 2,5 ml et conserver à -20 °C pendant jusqu&#39;à 2 mois. </li></ol></li><li> Préparer les médias. <ol><li> Pour 250 ml de DMEM / F12 ajouter 2,5 ml de N2. Mélangez bien, mais ne pas secouer ou le filtre. </li><li> Pour 250 ml de Neurobasal médias ajouter 5 ml de supplément de B27. Mélangez bien, mais ne pas secouer ou le filtre. </li><li> Mélanger les médias à partir des étapes 1.2.1 et 1.2.2 dans un rapport de 1: 1. Dans certains cas, un 1: mélange 3 peut être nécessaire (complétée le mélange 1: 1 à l&#39;étape 1.2.4). </li><li> Pour le mélange ajouter 0,5 ml de L-glutamine (concentration finale 0,2 mM) et 3,5 pi de 2-mercaptoéthanol (concentration finale 0,1 mM) et bien mélanger sans agitation. Entreposer le support à 4 ° C pendant jusqu&#39;à trois semaines et ne pas exposer à la lumière. Ce mélange final est appelé N2B27. </li></ol></li><li> Préparer la solution de gélatine. <ol><li> Préparer une solution de gélatine à 1% dans de l&#39;eau ultrapure et autoclave à 121 ° C, 15 psi, pendant 15 minutes. Il est important que la bouteille utilisée pour cela est complètement propre des détergents ou des désinfectants, il est donc recommandé qu&#39;une nouvelle bouteille estutilisé pour cela et est seulement jamais rincé à l&#39;eau ultra pure entre les utilisations. Aliquoter la solution à 1% en portions de 50 ml et de garder à 4 ° C pendant des mois. </li><li> Chauffer une partie aliquote de 1% de gélatine dans un bain d&#39;eau à 37 ° jusqu&#39;à dissolution et ajouter à 500 ml de solution saline tiède tamponnée au phosphate (PBS). Mélangez bien et pipette assez pour couvrir le fond de chaque puits ou d&#39;une plaque. Autoriser la gélatine pour enrober la surface pendant au moins 30 min. </li></ol></li></ol> 2. Placage des cellules NOTE: Ce protocole vaut également pour ESC de souris cultivées dans 10% de sérum avec le facteur inhibiteur de la leucémie (LIF), le remplacement de sérum avec un FRV ou un milieu sans sérum avec LIF et la protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4) ou inhibiteurs de MEK et GSK3 (médias 2i) avec ou sans FRV. Toutefois, le moment et l&#39;efficacité de la différenciation peuvent varier selon les médias et les cellules (voir la discussion). Pour les expériences présentées ici nous avons utilisé la ligne 46C souris ESC (qui a un rapporteur de l&#39;EGFP a frappé en on des allèles SOX1 endogènes), cultivés dans du GMEM avec 10% de sérum et LIF. Pour des résultats optimaux, il est important que les cellules sont dissociées et replaquées dans le milieu N2B27; changeant simplement de médias de GMEM / sérum / FRV à N2B27 aboutit toujours à une efficacité réduite par rapport à la différenciation les plaquant les cellules. <ol><li> Cultiver les cellules dans GMEM avec 10% de sérum, du pyruvate de sodium 1 mM, acides aminés non essentiels 1x, 0,1 M de 2-mercaptoéthanol, et 100 unités / ml de LIF 13. Pour obtenir une culture subconfluente de souris ESC, plaque 1 x 10 6 cellules dans un flacon de culture T25 qui aura 2 - 3 jours. </li><li> Respecter les cellules sous champ lumineux microscope. Lorsque les cellules sont sous-confluente et prêt à passage, rincer deux fois dans du PBS. Ajouter 1 ml de cellules réactif de dissociation et revenir à l&#39;incubateur pendant 2 - 5 min. Bien que la trypsine et d&#39;autres enzymes peuvent également être utilisés pour la dissociation des cellules, elles peuvent avoir un impact négatif sur la fixation des cellules de sorte que les densités de placage devront être ADJUsted. </li><li> Une fois que les cellules commencent à soulever de la plaque, appuyez sur le navire pour les déloger dans une suspension cellulaire unique. Recueillir les cellules dans un total de 10 ml de médias et de dissociation cellulaire réactif et de la pipette dans un tube de 15 ml centrifugeuse. </li><li> Faites tourner les cellules à 300 g pendant 3 min à température ambiante. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant et remettre le culot dans 10 ml de pré-chauffé N2B27 par aspiration et refoulement 3 - 5 fois. Lorsque la suspension pipetage vers le bas, contre le bord pipette du tube pour éviter de créer des bulles. Compter les cellules avec un compteur de cellules automatisé ou un hémocytomètre et enregistrer la concentration. </li><li> Préparer une suspension de cellules contenant le nombre désiré de cellules par unité de volume à être plaqué par puits dans préchauffé N2B27. Une densité de 10 500 cellules par cm 2 dans un plat à 6 puits (par exemple, 1 x 10 5 cellules par puits d&#39;un plat à 6 puits) est optimale. Voir le tableau 1 pour suggéré nombre de cellules par cm 2 et plaTing volumes de médias pour une variété de récipients de culture cellulaire. </li><li> Aspirer la gélatine à partir de la cuve de culture et de la plaque de la suspension cellulaire en fonction de la densité et le volume suggéré dans le Tableau 1. Ne pas agiter les plaques comme cela va concentrer les cellules vers le centre. Placez les cultures dans un incubateur humide à 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Changer de support tous les 1 - 2 jours en remplaçant tous les médias avec N2B27 frais. Pipette doucement rinçage des cellules pourrait affecter la densité et de réduire l&#39;efficacité de la différenciation dans les jours suivants. Où viabilité initiale après l&#39;étalement est pauvre, plaque les cellules dans un 1: 3 mélange des médias N2 et B27-complétées et changer cette N2B27 après les deux premiers jours. Les cellules commencent à se différencier et doivent montrer l&#39;expression de Sox1 (visible par fluorescence verte de la journaliste dans la lignée cellulaire 46C utilisé ici) dans les 4 - 6 jours. </li></ol> 3. Coloration immunofluorescente NONTE: Le protocole peut être appliqué à n&#39;importe quel type de navire. Le volume de chaque réactif est décrite par puits de plaque de 6 puits et peut être adapté à toute surface. Réensemencement est pas recommandé en raison de la faible viabilité après. <ol><li> Retirer le milieu de différenciation et de fixer les cellules par addition de 500 ul de 4% (v / v) de paraformaldehyde, laisser pendant 15 minutes. </li><li> Laver et perméabiliser les cellules avec 2 ml de PBS-T (solution saline tamponnée au phosphate avec 0,5% (v / v) de Tween-20) à deux reprises. Les cellules peuvent être maintenues dans du PBS-T pendant jusqu&#39;à 2 mois à 4 ° C. </li><li> Remplacer PBS-T avec 1 ml de PBS-T contenant 10% (v / v) de sérum (de la même espèce que l&#39;anticorps secondaire). Incuber 1 h sur la bascule de la plaque à la température ambiante pour bloquer toute liaison non spécifique. </li><li> Après 1 h, laver les cellules deux fois avec 2 ml de PBS-T, et incuber dans 500 ul d&#39;IgG de souris contre ßlll-tubuline (dilué à 1: 1000 dans du PBS-T avec 10% de sérum). Mettez sur la bascule de la plaque et laisser O / N à 4 ° C. </li><li> De cette étape, toujours protéger le navirede la lumière. Laver les cellules deux fois avec du PBS-T, puis ajouter 500 ul d&#39;anticorps IgG anti-souris marqué par fluorescence (dilué à 2 pg / ml dans du PBS-T avec 10% de sérum). Mettez-le sur la bascule de la plaque pendant 1 heure à température ambiante. </li><li> Rincer les cellules deux fois avec du PBS-T, puis ajouter 500 ul de DAPI (dilué à 0,5 ug / ml dans du PBS-T) et laisser reposer pendant 5 min. </li><li> Laver les cellules à nouveau et les garder dans PBS-T. Les cellules sont prêts à être photographiés et peuvent être conservés pendant un maximum de 2 semaines à 4 ° C. Notez que le signal de la GFP disparaît au fil du temps il est donc inapproprié de comparer l&#39;intensité de la GFP de cellules fixes et vivants ou des cellules fixées à des moments différents. </li></ol>

<ol><li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo-derived+stem+cells%3A+of+mice+and+men%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryo-derived stem cells: of mice and men.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 17, 435-462 (2001).</li>
<li>Bain, G., Kitchens, D., Yao, M., Huettner, J. E., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cells+express+neuronal+properties+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro.</a> Dev. Biol. 168, 342-357 (1995).</li>
<li>Fraichard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro.+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+glial+cells+and+functional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">In vitro. differentiation of embryonic stem cells into glial cells and functional neurons.</a> J. Cell Sci. 108, 3181-3188 (1995).</li>
<li>Strubing, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+into+the+neuronal+lineage+in+vitro+gives+rise+to+mature+inhibitory+and+excitatory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Dev%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent embryonic stem cells into the neuronal lineage in vitro gives rise to mature inhibitory and excitatory neurons.</a> Mech. Dev. 53, 275-287 (1995).</li>
<li>Stavridis, M. P., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Neural differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Biochem Soc Trans. 31, 45-49 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+embryonic+stem+cells+into+neuroectodermal+precursors+in+adherent+monoculture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture.</a> Nat Biotechnol. 21, 183-186 (2003).</li>
<li>Ying, Q. L., Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defined+conditions+for+neural+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Defined conditions for neural commitment and differentiation.</a> Methods Enzymol. 365, 327-341 (2003).</li>
<li>Stavridis, M. P., Lunn, J. S., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+discrete+period+of+FGF-induced+Erk1%2F2+signalling+is+required+for+vertebrate+neural+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A discrete period of FGF-induced Erk1/2 signalling is required for vertebrate neural specification.</a> Development. 134, 2889-2894 (2007).</li>
<li>Stavridis, M. P., Collins, B. J., Storey, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+orchestrates+fibroblast+growth+factor+signalling+to+drive+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid orchestrates fibroblast growth factor signalling to drive embryonic stem cell differentiation.</a> Development. 137, 881-890 (2010).</li>
<li>Speakman, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+O-GlcNAc+Levels+Activate+Epigenetically+Repressed+Genes+and+Delay+Mouse+ESC+Differentiation+Without+Affecting+Naive+to+Primed+Cell+Transition%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Elevated O-GlcNAc Levels Activate Epigenetically Repressed Genes and Delay Mouse ESC Differentiation Without Affecting Naive to Primed Cell Transition.</a> Stem Cells. 32, 2605-2615 (2014).</li>
<li>Kunath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+stimulation+of+the+Erk1%2F2+signalling+cascade+triggers+transition+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+from+self-renewal+to+lineage+commitment%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment.</a> Development. 134, 2895-2902 (2007).</li>
<li>Dani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+induction+of+stem+cell+renewal+by+LIF-deficient+cells%3A+a+new+ES+cell+regulatory+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Paracrine induction of stem cell renewal by LIF-deficient cells: a new ES cell regulatory pathway.</a> Dev Biol. 203, 149-162 (1998).</li>
<li>Smith, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+and+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Culture+Methods%22%5BJournal%5D)">Culture and differentiation of embryonic stem cells.</a> Journal of Tissue Culture Methods. 13, 89-94 (1991).</li>
<li>Aubert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+for+mammalian+neural+genes+via+fluorescence-activated+cell+sorter+purification+of+neural+precursors+from+Sox1-gfp+knock-in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Screening for mammalian neural genes via fluorescence-activated cell sorter purification of neural precursors from Sox1-gfp knock-in mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, Suppl 1. 11836-11841 (2003).</li>
<li>Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+of+pluripotent+embryonic+stem+cells+is+mediated+via+activation+of+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3.</a> Genes Dev. 12, 2048-2060 (1998).</li>
<li>Silva, J., Smith, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capturing+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Capturing pluripotency.</a> Cell. 132, 532-536 (2008).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole de différenciation neurale monocouche a été en usage depuis plus d&#39;une décennie 6. Le protocole est très efficace, composée d&#39;un milieu défini, et fait dans un système de monocouche qui rend le système plus applicable pour préclinique (par exemple, le criblage de médicaments) utilise. Toutefois, il existe certains facteurs critiques qui déterminent l&#39;efficacité de différenciation. Cet article souligne les facteurs et la solution pour chaque obstacle. <p class="jove_conten...

Les cellules souches embryonnaires sont des cellules pluripotentes dérivées de l&#39;embryon précoce ayant la capacité de proliférer indéfiniment in vitro, tout en conservant la capacité de se différencier en tous les types cellulaires adulte suivantes réintroduction dans un embryon au stade approprié (par formation d&#39;une chimère), l&#39;injection dans syngéniques ou immunodéprimés hôtes (en formant un tératome) ou in vitro soumis à des indices appropriés 1. La différenciation in vitro de souris des cellules souches embryonnaires dans des lignées neurales a été décrite la première fois en 1995 et a impliqué la formation d&#39;agrégats multicellulaires de suspension (corps embryoïdes, EB) dans des milieux contenant du sérum supplémenté avec de l&#39;acide rétinoïque morphogène 2-4. Depuis lors, un grand nombre de protocoles ont été développés pour permettre la différenciation de neurones 5. Beaucoup utilisent encore l&#39;agrégation, d&#39;autres co-culture avec induisant types de cellules et plusieurs impliquent l&#39;utilisation de milieux sans sérum. Tous les protocoles ont des avantages d&#39;une inconvénients et la nature précise des neurones ou des cellules neuronales produites varie également selon le protocole utilisé. Le protocole idéal serait robuste, évolutive et faire usage des médias et des substrats entièrement définis, se prêter à la surveillance non invasive du processus de différenciation et entraîner la génération de populations pures de progéniteurs neuronaux pouvant être modelée par des indices externes et de différencier dans tous les sous-types neuronales et gliales avec une grande efficacité et le rendement dans un temps relativement court. Dans les douze dernières années, nous avons utilisé une méthode pour générer des progéniteurs neuronaux et les neurones de souris ESC dans une faible densité, la culture de monocouche adhérente sans sérum 6-10. Ce protocole répond à la plupart des critères énoncés ci-dessus: dans nos mains l&#39;efficacité de la différenciation a été assez constante au cours de nombreuses années et une variété de lignées cellulaires, il peut être agrandie ou réduite (nous utilisons avec succès les navires des plaques à 96 puits à 15 cm de diamètre dishes) et les supports utilisés sont bien définis. Le procédé se prête à la microscopie Timelapse pour le contrôle de la différenciation et une variété de structuration indices peuvent être ajoutés pour induire la production de différents types de sous-types de neurones (par exemple, Shh et Fgf8 pour les neurones dopaminergiques 6). Néanmoins, il ya des défis à l&#39;application réussie de ce protocole. Un des aspects clés est une préparation minutieuse des médias. Nous préparons toujours les médias en interne malgré la disponibilité d&#39;alternatives commerciales. Un des suppléments utilisés (N2; voir le protocole) a plus de modifications à la norme de versions disponibles dans le commerce. Enfin, l&#39;une des étapes les plus importantes pour l&#39;application réussie de cette méthode est la densité cellulaire optimale au placage. Ceci est principalement parce que tandis que la nature autocrine de l&#39;un des signaux induisant (FGF4 11) exige que suffisamment de cellules sont présents pour permettre VIABIL optimalelité et la différenciation, à la différenciation trop élevées des densités de dépréciation (éventuellement en partie due à la production autocrine de FRV 12). Il est donc important que la préparation des deux médias et le placage de cellules sont réalisées avec soin et de manière cohérente afin de garantir des résultats optimaux.

<table><tbody><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Life Technologies</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>11320-074</td><td></td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplément, sans sérum</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma</td><td>I6634</td><td>Reconstituer avec de l’eau stérile 0,01 M HCl</td></tr><tr><td>Apo-transferrine</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td>Reconstituer avec de l’eau stérile</td></tr><tr><td>Progestérone</td><td>Sigma</td><td>P8783</td><td>Reconstituer avec de l’éthanol</td></tr><tr><td>Putrescine</td><td>Sigma</td><td>P5780</td><td>Reconstituer avec de l’eau stérile</td></tr><tr><td>Sélénite de sodium</td><td>Sigma</td><td>S5261</td><td>Reconstituer avec de l’eau stérile</td></tr><tr><td>Albumine bovine fraction V</td><td>Life Technologies</td><td>15260-037</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Life Technologies</td><td>25030-081</td><td>Assurez-vous qu’il est complètement dissous avant utilisation car la glutamine est généralement sédimentée Gélatine</td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire à 6 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire à 24 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>142475</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire à 96 puits</td><td>Thermo Scientific</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>GMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11710-035</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium</td><td>Life Technologies</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoéthanol</td><td>Sigma</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>Facteur inhibiteur de la leucémie</td><td>préparé en interne comme dans Smith 1991 Journal of Tissue Culture Methods</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>4&prime ;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>Protéger de la lumière</td></tr><tr><td>Souris anti &beta ; III tubuline Anticorps IgG</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps IgG anti-souris marqué par fluorescence</td><td>Life Technologies</td><td>A31571</td><td>Protéger de</td></tr><tr><td>la lumière 25 cm2 flacon de culture tissulaire</td><td>Thermo Scientific</td><td>156367</td><td></td></tr></tbody></table>

différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche

Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Serum-free Monolayer Culture

La capacité à différencier les cellules souches embryonnaires de souris (ESC) pour progéniteurs neuronaux, permet l&#39;étude des mécanismes de contrôle de la spécification de neurones ainsi que la génération de types de cellules neurales matures pour complément d&#39;étude. Dans ce protocole, nous décrivons un procédé pour la différenciation de cellules progénitrices neurales ESC à l&#39;aide de la culture en monocouche sans sérum. Le procédé est évolutive, efficace et aboutit à la production de ~ 70% de cellules progénitrices neurales à l&#39;intérieur de 4-6 jours. Il peut être appliqué à l&#39;ESC de diverses souches cultivées dans une variété de conditions. Progéniteurs neuronaux peuvent être autorisés à différencier en neurones fonctionnels et cellules gliales ou analysés par microscopie, cytométrie en flux ou moléculaires techniques. Le processus de différenciation est prête à la microscopie time-lapse et peut être combiné avec l&#39;utilisation de lignes de rapporteurs pour surveiller le processus de spécification de neurones. Nous fournissons des instructions détaillées sur la préparation des milieux et de l&#39;optimisation de la densité des cellules pour permettre au processus à be appliquée à la plupart des lignées de CSE et une variété de récipients de culture cellulaire.

Dans cette expérience, nous avons utilisé la lignée cellulaire 46C 14, les cellules souches embryonnaires de souris avec une endogène Sox1-GFP journaliste, pour suivre la différenciation neuronale. En utilisant cette lignée cellulaire, l&#39;expression de Sox1, un marqueur pour les progéniteurs neuronaux, peut être détectée par la fluorescence verte. Placage densité est un facteur critique pour atteindre la différenciation neuronale. Souris des cellules souches embryonnaires ont été étalées dans plaque de 6 p...

Ce protocole décrit en détail la méthode de génération de progéniteurs neuronaux à partir de cellules souches embryonnaires à l’aide d’une méthode monocouche sans sérum. Ces progéniteurs peuvent être utilisés pour dériver des types de cellules neurales matures ou pour étudier le processus de spécification neuronale et se prêtent à la mise à l’échelle de formats multipuits pour le criblage de composés.

Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche

The ability to differentiate mouse embryonic stem cells (ESC) to neural progenitors allows the study of the mechanisms controlling neural specification as ...

L'objectif général de cette procédure est de différencier des cellules souches embryonnaires de souris vers une lignée neuronale dans une culture cellulaire en monocouche sans sérum. Cela est réalisé en premier lieu en recouvrant le récipient de culture avec de la gélatine. Dans la deuxième étape, les cellules souches embryonnaires sont dissociées en une suspension monocellulaire dans un milieu de différenciation et diluées aux densités d'ensemencement appropriées.À l'étape finale, les cellules sont semées sur la plaque revêtue de gel ENC. En fin de compte, la microscopie en immunofluorescence est utilisée pour confirmer la réussite de la différenciation par la visualisation des marqueurs neuronaux d'intérêt. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés, car le semis à une densité appropriée est essentiel pour obtenir une bonne différenciation.Et plusieurs facteurs influencent directement et indirectement la densité de mise en culture. Avant de semer les cellules, réchauffez un aliquot de gélatine à 1 % dans un bain-marie à 37 degrés Celsius jusqu'à dissolution. Mélangez ensuite la gélatine avec 500 millilitres de PBS tiède et recouvrez le fond du

neural-differentiation-mouse-embryonic-stem-cells-serum-free

Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Nous avons développé un nouveau protocole pour améliorer l'efficacité de la différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris en neurones moteurs. Les cellules ES différenciées acquis motoneurones dispose comme en témoigne l'expression de marqueurs neuronaux et des neurones moteurs en utilisant des techniques d'immunohistochimie.

Différenciation efficace des cellules souches embryonnaires de souris dans les neurones moteurs

La vidéo présente un protocole qui utilise des milieux sans sérum pour générer des progéniteurs neuronaux à partir de cellules souches embryonnaires de souris. La concentration souhaitée de cellules souches embryonnaires, en suspension dans un milieu sans sérum, est plaquée sur des lamelles enrobées de gélatine. À une densité cellulaire optimale, les cellules produisent des facteurs de signalisation autocrines qui, avec les facteurs induisant la différenciation neurale dans le milieu sans...

Génération de progéniteurs neuraux à partir de cellules souches embryonnaires dans des cultures monocouches sans sérum

Cette vidéo présente une méthode de génération in vitro de cellules progénitrices neurales (NPC) à partir de cellules souches embryonnaires de souris (mESC). Les CSEm sont cultivées en suspension pour former des corps embryoïdes (EB), qui sont ensuite guidés pour se différencier en NPC via un traitement à l’acide rétinoïque dans une culture adhérente.

Technique de génération de cellules progénitrices neurales à partir de cellules souches embryonnaires de souris

La vidéo présentait une méthode de culture cellulaire pour différencier les cellules progénitrices neurales en neurones. En incubant des cellules dans un milieu riche en nutriments complété par des facteurs de croissance, les cellules progénitrices ont mûri en neurones avec des axones et des dendrites développés. Un agent stabilisant assurait la viabilité cellulaire et protégeait contre les dommages oxydatifs tout au long du processus de différenciation.

Différenciation des cellules progénitrices neurales en neurones

Cette vidéo démontre une technique de différenciation des cellules souches embryonnaires en une population en réseau de neurones avec des synapses fonctionnelles. Il décrit les étapes impliquées dans la différenciation des cellules souches embryonnaires en neurones, l’induction de la formation du réseau neuronal et l’enrichissement de la culture avec des neurones en réseau.

Différenciation des cellules souches embryonnaires de souris en une population de neurones en réseau

Sérum utilisé dans les cultures d'embryons contient des composants inconnus qui peuvent affecter le résultat d'expériences en particulier dans les études portant sur les interactions de signalisation. Ici nous avons utilisé un système de culture oxygéné sans sérum et montrons que les embryons mi-gestation souris en culture pour 16-40 h présentent développement morphologique comparable à des embryons en développement in utero.

Souris développement embryonnaire dans tout un système de culture d&#39;embryons sans sérum

Nous décrivons une technique pour l'utilisation de cellules souches embryonnaires de souris pour générer deux ou trois dimensions des corps embryoïdes. Nous expliquons alors comment induire la différenciation neuronale des cellules du corps embryoïdes par l'acide rétinoïque, et comment analyser leur état de différenciation par immunofluorescence marqueur de cellules progénitrices et immunoblotting.

L&#39;analyse des rétinoïque induite par l&#39;acide Neuro-Différenciation de cellules souches embryonnaires de souris en deux et trois dimensions corps embryoïdes

Ici, nous présentons une nouvelle technique microchirurgicale pour isoler des cellules souches neurales de l’éminence E13 souris embryon ganglionnaire.

Isolement et Culture des embryons de souris des cellules souches neurales

Présenté ici est un protocole pour la génération d'une culture unicellulaire des cellules souches embryonnaires humaines et leur différenciation ultérieure en cellules progénitrices neurales. Le protocole est simple, robuste, évolutif et adapté aux applications de dépistage des médicaments et de médecine régénérative.

Différenciation neuronale efficace à l'aide de la culture monocellulaire des cellules souches embryonnaires humaines

Ici, nous avons établi une méthode peu coûteux et facile à utiliser qui dirige la différenciation rapide et efficace des cellules souches embryonnaires en neurones. Cette méthode convient à la vulgarisation entre les laboratoires et peut être un outil utile pour la recherche neurologique.

Différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris in vitro

Nous décrivons la procédure de différenciation in vitro des cellules souches embryonnaires de souris en cellules neuronales en utilisant la méthode de la goutte suspendue. De plus, nous effectuons une analyse phénotypique complète par RT-qPCR, immunofluorescence, séquençage de l’ARN et cytométrie en flux.

Différenciation et caractérisation des progéniteurs neuronaux et des neurones à partir de cellules souches embryonnaires de souris

Apprenez la différenciation neuronale des cellules souches embryonnaires de souris en culture monocouche sans sérum. Cette méthode permet de générer des progéniteurs neuronaux pour le criblage de composés.

Différenciation neurale des souris de cellules souches embryonnaires dans le sérum sans culture monocouche

Explorer plus de vidéos