Suivi des modifications induites par la drogue dans des récepteurs post-internalisation traite par Analyse Colocalizational

L’objectif global de l’expérience suivante est d’évaluer quantitativement la colocalisation spatiale des paires cibles, dans ce cas, en examinant le trafic de récepteurs induit par la drogue. Ceci est réalisé en traitant des cellules vivantes cultivées avec un médicament pour induire un trafic de récepteurs modifié. Dans un deuxième temps, le double immunomarquage des récepteurs cibles et des compartiments de trafic intracellulaire permet la localisation spatiale des paires cibles par microscopie confocale multicanaux.

L’analyse quantitative de colocalisation est utilisée pour mesurer la tendance des récepteurs et des compartiments cibles à se trouver au même endroit. Les résultats montrent des changements dans le trafic des récepteurs après un traitement médicamenteux basés sur la colocalisation des récepteurs et des compartiments de trafic intracellulaire. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la colocalisation par superposition, est qu’elle fournit des mesures quantifiées de la colocalisation, ce qui permet ensuite des analyses beaucoup plus puissantes et des plans expérimentaux complexes.

Bien que cette méthode puisse donner un aperçu du trafic des récepteurs, elle peut également être appliquée aux changements dans la colocalisation spatiale d’à peu près n’importe quelle protéine dans des cellules en culture. Pour commencer cette procédure, retirez le milieu de croissance d’origine et remplacez-le par un milieu contenant le médicament d’intérêt à la concentration choisie. Ensuite, incubez les cellules dans les conditions de croissance d’origine pendant la durée de traitement choisie.

Après l’incubation, lavez doucement les cellules avec un millilitre de tampon de lavage à chaque fois pendant trois fois. Fixez les cellules avec 300 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans 0,1 molaire PBS pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Ensuite, lavez à nouveau les cellules avec un millilitre de tampon de lavage à chaque fois trois fois.

Par la suite, incubez les cellules dans 300 microlitres de tampon de blocage pendant deux heures à température ambiante. Ensuite, incubez les cellules avec l’anticorps primaire dans 300 microlitres de diluant d’anticorps pendant 48 heures à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez doucement les cellules avec un millilitre de tampon de lavage à chaque fois trois fois.

Ensuite, incubez les cellules avec l’anticorps secondaire conjugué au fluor dans 300 microlitres de diluant d’anticorps pendant une heure à température ambiante et protégez les cellules de la lumière. Au bout d’une heure, lavez doucement les cellules avec un millilitre de tampon de lavage à chaque fois trois fois. Pour retirer la lamelle de couverture de la plaque à 24 puits, tenez la plaque à 45 degrés.

Placez la pointe d’une paire de pinces fines sur le bord supérieur de la lamelle de recouvrement à l’endroit où elle rencontre le sol du puits. Inclinez ensuite doucement la lamelle dans le tampon de lavage pour l’éloigner du sol du puits. La lamelle de recouvrement s’appuiera contre la paroi du puits où elle pourra être facilement retirée à l’aide d’une pince.

Montez ensuite les lamelles de recouvrement avec les cellules vers le bas sur des lames de microscope avec un milieu de montage anti-décoloration à l’aide d’un objectif à fort grossissement 100 x. Tout d’abord, localisez une cellule représentative à imager à l’aide de l’épifluorescence. Ensuite, configurez les paramètres de capture d’image Enregistrez des images tiff non compressées de huit bits de chaque canal étiqueté pour imager chaque canal de manière séquentielle et pour faire la moyenne de quatre à six balayages pour l’image finale.

Passez ensuite à la trajectoire d’imagerie confocale et faites la mise au point sur un plan Z passant par le centre de la cellule. Optimisez la puissance du laser à sténopé et la tension et le décalage du tube photomultiplicateur pour chaque voie. Enregistrez ces paramètres et utilisez les mêmes paramètres pour imager toutes les cellules étiquetées pour une paire cible donnée.

Dans le même Répliquez les cellules du localisateur suivant à imager avec un objectif de grossissement élevé. À l’aide de l’épifluorescence, passez au chemin d’imagerie confocal et faites la mise au point sur un plan Z passant par le centre de la cellule si disponible. Utilisez la fonction de recadrage du zoom logiciel pour limiter la zone de balayage à la cellule d’intérêt. Après.

Capturez des images pour chaque canal étiqueté à l’aide des paramètres précédemment définis et répétez les procédures pour imager 15 cellules ou plus par condition et par répétition. Pour assurer un prélèvement suffisant d’échantillons. Dans cette procédure, ouvrez la paire d’images d’une cellule dans l’image J.Utilisez la commande de fusion des couleurs de l’image pour générer une image RVB.

Dessinez ensuite autour de la cellule qui vous intéresse. Utilisez le plugin image j la colocalisation SC pour quantifier la colocalisation des cibles dans la cellule sélectionnée. Enregistrez la mesure de colocalisation souhaitée et répétez la procédure pour chaque cellule d’image.

Ensuite, calculez la moyenne des valeurs de colocalisation enregistrées des conditions de contrôle communes de chaque répétition de chaque condition de marquage. Multipliez les moyennes par moins un pour obtenir le décalage pour chaque répétition dans chaque condition d’étiquetage. Ajoutez ensuite le décalage de chaque réplique dans chaque condition d’étiquetage à chaque valeur de colocalisation dans cette réplique.

Cela normalisera les données de sorte que la mesure de colocalisation moyenne pour la condition de contrôle commune soit nulle dans chaque répétition de chaque condition d’étiquetage. Après cela, toutes les données de toutes les répétitions de chaque condition de marquage permettront l’analyse des changements de colocalisation entre les réplicats Voici les cultures primaires de neurones sensoriels des ganglions de la racine dorsale qui ont été exposés à des traitements médicamenteux prolongés et aigus. Les cellules ont ensuite été immunomarquées pour les récepteurs opioïdes delta et un marqueur de recyclage des endosomes avec des paires d’anticorps primaires secondaires distinctes et ont été imagées par microscopie confocale séquentielle à deux canaux.

En plus de la colocalisation et de l’analyse quantitatives ultérieures, ces images représentatives ont été traitées pour générer des cartes de colocalisation en fausses couleurs présentées ici. Les scores moyens de colocalisation des récepteurs opioïdes delta et des marqueurs de la colocalisation précoce des endosomes de recyclage des endosomes et des récepteurs des lysosomes avec chaque compartiment sont comparés entre les groupes recevant différents traitements médicamenteux aigus et des changements induits par la drogue dans le trafic des récepteurs sont observés. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’acquérir des micrographies cohérentes de haute qualité pour permettre une analyse quantitative valide.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer une analyse quantitative de colocalisation.