Name: Un microbienne aquatique métaprotéomique Workflow: à partir de cellules à tryptique peptides appropriés pour lanalyse comparative-spectrométrie de masse en tandem (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 9 s
Description: Découvrez un workflow métaprotéomique pour extraire protéines et ADN de biomasses microbiennes marines. Cette méthode génère des peptides tryptiques adaptés à l'analyse par spectrométrie de masse en tandem.

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Les auteurs tiennent à remercier Marcos Di Falco pour son expertise et ses conseils concernant la préparation des échantillons pour la nano-LC MS/MS ainsi que le Dr Zoran Minic de l’Université de Regina pour l’analyse LC MS/MS. Ces travaux ont été financés par le CRSNG (DG402214-2011) et le CRC (950-221184). D.C. a été soutenu par l’Institut Concordia sur l’eau, l’énergie et les systèmes durables et le FQRNT.

1. Préparer Réactifs <ol><li> Préparer la solution de SDS-extraction: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% de glycerol, 10 mM d&#39;EDTA et 1% de SDS. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C. </li><li> Préparer les réactifs sous licence nécessaires au gel de Polyacrylamide. <ol><li> Préparer 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à température ambiante. </li><li> 0,5 M de Tris-HCl pH 6,8. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à température ambiante. </li><li> Préparer 10% de SDS. Stériliser par filtration en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à température ambiante. </li></ol></li><li> Préparer les solutions nécessaires pour en gel digestion à la trypsine et de l&#39;extraction de peptide. <ol><li> Préparer 100 mM de bicarbonate d&#39;ammonium. Filtre-stériliser en utilisant un filtre de 0,22 um et stocker à 4 ° C. </li><li> Préparer 1 Les stocks M TNT. En suspension dans 100 mM bicarbonate d&#39;ammonium et conserver à -80 ° C. </li><li> Préparer 550 mm stocks iodoacétamide. Suspendu dans100 mM de bicarbonate d&#39;ammonium et conserver à -80 ° C. </li><li> Préparer 100 ng / ul stocks de trypsine. Aliquote de 60 ul dans 1,5 ml microtubes et conserver à -80 ° C. </li><li> Préparer la solution d&#39;extraction: l&#39;acide formique à 1%, 2% d&#39;acétonitrile. </li><li> Préparer la solution de remise en suspension: 5% acétonitrile et de l&#39;acide formique à 0,1%. </li></ol></li></ol> 2. Effectuez lyse cellulaire dans la cartouche filtrante Unité avec cellules conservées dans la stabilisation des ARN Solution <ol><li> Expulser la solution de stabilisation de l&#39;ARN à partir de l&#39;unité de filtre à cartouche (1,5 ml) et dans un tube de microcentrifugeuse de 2 ml en utilisant une seringue de 60 ml attaché à l&#39;extrémité du luer-lock du filtre. </li><li> Centrifuger le tube de microcentrifugation de 2 ml pendant 10 min à 17 000 x g pour sédimenter les débris cellulaires. Ceci est fait de telle sorte que le filtre à l&#39;étape 2.3 ne bouche pas. </li><li> Transférer le surnageant dans une unité de filtre ultracentrifugation 10 K pour capturer des protéines provenant de cellules qui ont lysé provenant de la congélation / thaw de l&#39;échantillon. Ne pas jeter le culot. Il sera utilisé dans l&#39;étape 2.5. Effectuer centrifugation de l&#39;unité de filtre ultracentrifugation à 3270 xg pendant 30 min ou jusqu&#39;à ce que le volume soit réduit à 600 ul. </li><li> Faire fondre la pointe d&#39;une pointe de p10 et de bloquer le côté non luer-lock de l&#39;unité de filtration à cartouche avec l&#39;extrémité ouverte de la pointe. Cela permettra d&#39;assurer qu&#39;aucun tampon d&#39;extraction et de la biomasse échappe lors des étapes 2,5-2,7. </li><li> Suspendre le culot dans 1 ml de solution SDS-extraction et la pipette dans l&#39;unité de filtration à cartouche originale. La meilleure façon de pipette dans l&#39;unité de filtration à cartouche est d&#39;empiler une pointe de P200 sur une pointe de p1000 et utiliser cette double pointe pour pipetage. </li><li> Ajouter 1 ml de solution d&#39;extraction SDS à l&#39;unité de filtre à cartouche de sorte que le volume total est d&#39;environ 2 ml et incuber pendant 10 min à la température ambiante tout en tournant dans un four à hybridation. Placer 3 essuie laboratoire froissé au fond d&#39;un tube conique de 50 ml. Parafilm deux extrémités de l&#39;unité de filtre à cartouche ferméeet mettre l&#39;unité de filtre à cartouche dans le tube de 50 ml. Fermer le couvercle et mettre le tube dans le four d&#39;hybridation. </li><li> Après 10 min lieu filtrer le Sterivex sur un flotteur en mousse et fixez-le en place avec une seringue de 5 ml sur la fin de luer-lock. Flotter et incuber dans un bain-marie à 95 ° C pendant 15 min. </li><li> Soit l&#39;unité de filtre à cartouche froide et tourner à la température ambiante pendant une heure (comme à l&#39;étape 2.6). </li><li> Expulser la solution d&#39;extraction / SDS lysat cellulaire sur le filtre avec 60 ml d&#39;une seringue dans la même unité de filtre ultracentrifugation comme précédemment (étape 2.3). Ajouter 1 ml de solution fraîche d&#39;extraction SDS à l&#39;unité de filtration à cartouche et mélanger pendant 30 secondes à la main, puis expulser dans l&#39;unité de filtre ultracentrifuge aide de la seringue de 60 ml. Ceci est pour rincer l&#39;unité de filtre à cartouche pour assurer que toutes les protéines ont été enlevées. </li><li> Effectuer centrifugation sur l&#39;unité de filtre ultracentrifugation pendant 45 min à 3270 x g ou jusqu&#39;à ce que le volume dans l&#39;unité de filtre est inférieur à 600 ul. </li><li> Jeter l&#39;effluent et le haut de l&#39;unité de filtre ultracentrifugation par une solution fraîche SDS-extraction. </li><li> Centrifuger l&#39;unité de filtrage pour un autre 45 min à 3270 x g. </li><li> Répétez les étapes 2.11 et 2.12 fois plus. Assurer le volume final dans l&#39;unité de filtration ultracentrifugation est au plus 600 pi à la fin de l&#39;essorage final. </li><li> À ce stade, le concentré diviser en deux. Une fraction sera utilisé pour la précipitation de l&#39;ADN et l&#39;autre pour la précipitation des protéines. Remarque: Le montant de fractionnement dépend de la quantité de biomasse qui a été filtré et les utilisations prévues des produits. Dans notre cas, nous avons divisé le concentré avec 10% vers des précipitations de l&#39;ADN et à 90% par la précipitation des protéines. </li></ol> 3. précipitation des protéines <ol><li> Ajouter 4 volumes de methanol: acétone (50:50) à un volume de concentré et vortex pendant 10 s. Incuber pendant la nuit à -20 ° C. </li><li> Isoler à 17.000 g pendant 30 min. Décanter le surnageantet laissez le culot (peut être invisible) sec dans un speedvac pendant 1 heure (ou jusqu&#39;à ce que sec). Note: Ne pas trop sécher le culot car cela pourrait rendre difficile pour remettre en suspension. </li><li> Suspendre le culot dans 25 ul de solution SDS-extraction. Laisser reposer pendant une heure, puis remettre en suspension par pipetage de haut en bas. </li><li> Quantifier la protéine en utilisant un kit de dosage de protéine et les instructions du fabricant. </li></ol> 4. ADN Précipitations <ol><li> Ajouter une solution de SDS-extraction de la fraction de concentré pour être utilisé pour l&#39;ADN précipitation jusqu&#39;à la marque de 500 pi. Cette étape consiste simplement à augmenter le volume de la solution, ce qui rend plus facile de travailler avec. </li><li> Ajouter 0.583 volumes d&#39;un réactif de précipitation de protéines (telles que la protéine MPC réactif de précipitation) et vortex pendant 10 s. Vous devriez voir une forme de précipité blanc. Note: Nous avons également utilisé le phénol: méthodes d&#39;extraction d&#39;ADN chloroforme, mais il est plus difficile en raison des faibles volumes. Nous avons obtenu de meilleurs rendements d&#39;ADN en utilisant laMPC précipitation des protéines réactif. </li><li> Centrifuger à 17 000 x g et 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Transférer le surnageant dans un autre tube de 1,5 ml et ajoutez 0,95 volumes d&#39;isopropanol. Inversez 30-40 fois. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 4 ° C à la vitesse maximale. </li><li> Décanter avec soin et jeter le surnageant. </li><li> Rincer deux fois avec 750 pi d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Retirer autant que possible l&#39;éthanol par pipetage, puis laissez sécher à l&#39;air. Note: Ne pas trop sécher l&#39;ADN comme cela peut rendre difficile de remettre en suspension. </li><li> Remettre en suspension dans 25 ul de tampon TE faible, pH 8 (10 mM de Tris-HCl, 0,1 mM d&#39;EDTA). </li><li> Quantification de l&#39;ADN en utilisant un kit de dosage d&#39;ADNdb et les instructions du fabricant. Effectuer gel d&#39;agarose électrophorèse (1%) sur 3 pi de l&#39;ADN pour vérifier sa qualité. </li></ol> 5. Gel SDS-PAGE de protéines <ol><li> Préparer un tampon d&#39;échantillon (950 pi de tampon d&#39;échantillon de Laemmli et 50 pi de β-mercaptoéthanol). &lt;/ li&gt; <li> Ajouter le volume correspondant à 15 pg de protéine, ou un maximum de 20 pi à un volume égal de tampon d&#39;échantillon et faire bouillir pendant 4 min. Les échantillons peuvent maintenant être stockés à -80 ° C jusqu&#39;à SDS-PAGE peut être effectuée. </li><li> Préparer 10% d&#39;acrylamide résoudre gel avec un gel d&#39;empilement acrylamide à 5%. </li><li> Chargez le gel avec des échantillons et 4 ul d&#39;une échelle de protéines. Exécutez le gel à 120 V constante jusqu&#39;à ce que le marqueur de 250 kDa échelle vient d&#39;atteindre le gel de résolution. </li><li> Colorer le gel en utilisant un Coomassie base selon les instructions du fabricant. </li></ol> 6. Dans gel trypsine Digest et Peptide Extraction Remarque: Toutes les étapes d&#39;ici jusqu&#39;à ce que 6.10 sont effectuées dans une enceinte de sécurité biologique pour minimiser la contamination. <ol><li> Coupez l&#39;excédent de gel sous la barre des 10 kDa échelle pour chaque voie. Chaque voie sera analysé sur la MS / MS séparément. Couper chaque piste en 1 mm x 1 mm carrés pour augmenter la surface et de placer tous squares de la voie dans un tube à faible liaison micro-centrifugeuse. Répétez cette opération pour toutes les voies. (Acide acétique à 1% peut être utilisé pour prévenir le gel de se dessécher et de devenir difficile à couper). Remarque: minimiser la contamination est essentiel à ce stade, de sorte gel tranchage est effectué dans une enceinte de sécurité biologique sur le verre SDS-PAGE moule de gel utilisé pour fabriquer le gel. </li><li> De-taches <ol><li> Distribuer 50 pi de bicarbonate d&#39;ammonium 100 mM dans chaque tube à faible liaison, fermer le bouchon et incuber à 37 ° C pendant 10 min. </li><li> Distribuer 50 ul d&#39;acétonitrile, fermer le bouchon et incuber à 37 ° C pendant 5 min. </li><li> Aspirer et jeter 150 pi. </li><li> Répétez les étapes 6.2.1 et 6.2.2. </li><li> Aspirer et jeter 95 pi. </li></ol></li><li> Déshydration <ol><li> Distribuer 50 pi acétonitrile, fermer le bouchon et attendre 5 min. Aspirer et jeter 45 pi et attendre 10 min. </li></ol></li><li> Réduction <ol><li> Distribuer 50 pi de DTT (10 mM, dilué dans amm 100 mMbicarbonate onium), fermer le bouchon et attendre 30 min à 37 ° C. </li></ol></li><li> Alkylation <ol><li> Distribuer 50 ul d&#39;iodoacétamide (55 mM, dilué dans du bicarbonate d&#39;ammonium 100 mM), fermer le bouchon et attendre 20 min à 37 ° C. </li><li> Distribuer 100 ul d&#39;acétonitrile, fermer le bouchon et incuber pendant 5 min à 37 ° C. Aspirer et jeter 195 pi. </li></ol></li><li> lavage <ol><li> Distribuer 50 pi de bicarbonate d&#39;ammonium, fermer le bouchon et incuber pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Distribuer 50 ul d&#39;acétonitrile, fermer le bouchon et incuber à 37 ° C pendant 5 min. Aspirer et jeter 120 pi. </li></ol></li><li> Déshydration <ol><li> Distribuer 50 pi acétonitrile, fermer le bouchon et attendre 5 min. Aspirer et jeter 45 ul. </li><li> Distribuer 50 ul d&#39;acétonitrile, attendez 5 min. </li><li> Aspirer et jeter 75 pi et attendre 5 min. </li></ol></li><li> Digestion <ol><li> Distribuer 25-30 pi de 6 ng / ul trypsine (uusqu&#39;à tous les fragments de gel sont couverts). Fermer bouchon et attendre 30 min à température ambiante. </li><li> Incuber pendant la nuit (4,5 heures minimum) à 37 ° C. </li><li> Laisser reposer à la température ambiante pendant 30 min. </li></ol></li><li> Extraction et transfert Peptide <ol><li> Distribuer 30 pi de solution d&#39;extraction et couvrez avec le couvercle pendant 30 minutes sur la glace. </li><li> Aspirer 30 pi et distribuer le volume aspiré dans un nouveau tube à faible liaison marqué. </li><li> Distribuer 12 ul de la solution d&#39;extraction et de 12 ul d&#39;acétonitrile dans le tube initial (par gel). Fermer capuchon et incuber pendant 30 min sur la glace. </li><li> Aspirer 15 pi et le dépôt dans le nouveau tube. </li><li> Répétez les étapes (6.9.3 et 6.9.4). </li></ol></li><li> Placez nouveaux tubes dans un SpeedVac jusqu&#39;à sec. </li><li> Remettre en suspension dans 50 ul de solution de remise en suspension. Vortex sur milieu pendant 10 min pour remettre en suspension. </li><li> Solution de peptide de la pipette dans des flacons soit des nano LC / ou des plaques à 96 puits appropriés pour la nano / LCTravail MS / MS. </li></ol>

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<li>Huson, D. H., Mitra, S., Ruscheweyh, H. -J., Weber, N., Schuster, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+analysis+of+environmental+sequences+using+MEGAN4%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+research%22%5BJournal%5D)">Integrative analysis of environmental sequences using MEGAN4.</a> Genome research. 21 (9), 1552-1560 (2011).</li>
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<li>Feike, J., Jürgens, K., Hollibaugh, J. T., Krüger, S., Jost, G., Labrenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+unbiased+metatranscriptomics+in+suboxic+waters+of+the+central+Baltic+Sea+using+a+new+in+situ+fixation+system%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+journal%22%5BJournal%5D)">Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system.</a> The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Exemple de préservation est essentielle pour metaproteomic études et des travaux antérieurs ont démontré que la solution de stabilisation de l&#39;ARN est un tampon de stockage pour stocker des cellules utile avant l&#39;extraction des protéines 28. Idéalement, les échantillons seraient conservés in situ pour annuler des changements dans l&#39;expression des protéines pendant la manipulation 33,34. En effet, in situ technologies d&#39;échantillonnage et de fixation ont été dévelop...

Les microorganismes sont omniprésents et jouent des rôles essentiels dans les cycles biogéochimiques de la Terre 1. Actuellement, il existe de nombreuses approches moléculaires disponibles pour caractériser la structure de la communauté microbienne et la fonction. La plus courante est l&#39;analyse du gène ARNr 16S séquences amplifié par PCR de l&#39;ADN de l&#39;environnement 2 - 4. Un inconvénient de l&#39;analyse du gène ARNr 16S est qu&#39;elle ne fournit des informations sur l&#39;identité phylogénétique et structure de la communauté, avec peu d&#39;informations sur la fonction métabolique. En revanche, les approches telles que la métagénomique, metatranscriptomics et métaprotéomique fournissent des informations sur la structure des communautés et le métabolisme. La métagénomique, ou l&#39;analyse de la teneur en gène d&#39;un assemblage d&#39;organismes, fournit des informations sur la structure et le potentiel fonctionnel de la communauté 5-8. Bien que puissant, ce potentiel fonctionnel peut ne pas correspondre à la métaboliqueactivités des organismes. Le génotype d&#39;un organisme est représenté par ses gènes, dont chacun peut être transcrit en ARN et traduit en outre à la protéine, ayant pour résultat un phénotype. Ainsi, pour aider à la compréhension de l&#39;activité fonctionnelle microbienne dans un milieu, l&#39;analyse post-génomique doit être effectué neuf. Metatranscriptomics, ou l&#39;analyse des transcrits d&#39;ARN est utile car elle révèle que gènes sont transcrits dans un environnement donné. Cependant, les taux d&#39;ARNm ne correspondent pas toujours aux niveaux correspondants de protéines due à une régulation de la traduction, la demi-vie d&#39;ARN, et le fait que des copies multiples de la protéine peuvent être générées pour chaque ARNm 10. Pour ces raisons métaprotéomique est maintenant reconnu comme un outil important pour la microbiologie environnementale. Metaproteomic commune analyses utiliser une approche protéomique fusil de chasse où le plein complément près de protéines dans un échantillon complexe sont purifiés et analysés simultanément, généralement par le biais frla digestion zymatic en peptides et des analyses sur un spectromètre de masse. Après la spectrométrie de masse (MS / MS) &quot;empreintes de peptide» est utilisé pour déterminer la séquence des peptides et des protéines potentiel d&#39;origine par la base de données de recherche de protéines (pour une revue voir 11). Travaux protéomique a parcouru un long chemin dans les 25 dernières années grâce à l&#39;augmentation de la disponibilité de données génomiques et l&#39;augmentation de la sensibilité et la précision des spectromètres de masse permettant à haut débit l&#39;identification des protéines et la quantification 11,12. Puisque les protéines sont le produit final de l&#39;expression des gènes, les données metaproteomic peuvent aider à déterminer quels organismes sont actifs dans un environnement donné et ce que les protéines qu&#39;ils expriment. Ceci est avantageux lorsque vous essayez de déterminer comment un ensemble particulier de variables environnementales aura une incidence sur le phénotype d&#39;un organisme ou d&#39;une communauté. Dès le début, les études metaproteomic base-MS / MS dans l&#39;océan ont été utilisés pour identifier des protéines spécifiques dans ciblélignées microbiennes, avec la première étude mettant l&#39;accent sur ​​la lumière axée sur la pompe à protons protéorhodopsine dans SAR11 bactéries marines 13. Plus récemment, des analyses comparatives metaproteomic ont élucidé les profils d&#39;expression différentielle des protéines complexes entre les communautés. Les exemples incluent l&#39;identification des décalages temporels dans le métabolisme du littoral Atlantique Nord-Ouest 14 ou la péninsule antarctique 5. D&#39;autres études ont décrit des variations dans les modes d&#39;expression de protéines à travers les échelles spatiales, par exemple, le long d&#39;un transect géographique d&#39;un gyre océanique faible en éléments nutritifs à un système d&#39;upwelling côtier très productif 15. Pour de plus amples commentaires de métaprotéomique nous recommandons Schneider et al. (2010) 9 et Williams et al. (2014) 16. Protéomique ciblée a également été employés au cours des dernières années pour quantifier l&#39;expression des voies métaboliques spécifiques dans l&#39;environnement 17,18. There sont trois phases principales dans l&#39;analyse metaproteomic. La première phase est la préparation des échantillons, qui comprend la collecte de l&#39;échantillon, la lyse des cellules et la concentration de protéine. Prélèvement de l&#39;échantillon en microbiologie marine entraîne souvent la filtration de l&#39;eau de mer à travers un pré-filtre pour éliminer les cellules eucaryotes plus grandes particules et les bactéries de particules associé, suivie d&#39;une filtration pour la capture de cellules microbiennes vivant libres, communément avec l&#39;utilisation d&#39;une cartouche de 0,22 pm unité de filtre 19,20. Ces filtres sont incased dans un cylindre en plastique et une lyse cellulaire et la protéine protocole d&#39;extraction qui peut être effectuée à l&#39;intérieur de l&#39;unité de filtration, il est un outil précieux. Une fois la biomasse est obtenue, les cellules doivent être lysées pour permettre l&#39;extraction de la protéine. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées, y compris la guanidine-HCl sulfate lyse 21 et le sodium dodécyl (SDS) méthodes de lyse à base. Bien que des détergents comme SDS sont très efficaces à perturber les membranes et solubilisation de nombreux types de protéines, concentrations dons aussi faible que 0,1% peut interférer avec la digestion des protéines en aval et l&#39;analyse MS 22. De préoccupation majeure est les effets négatifs de SDS sur l&#39;efficacité de la digestion de la trypsine, la puissance de la chromatographie inverse en phase liquide et la suppression d&#39;ions ou de l&#39;accumulation à l&#39;intérieur de la source d&#39;ions 23 résoudre. La deuxième phase est le fractionnement et d&#39;analyse, où les protéines sont soumises à une digestion enzymatique suivie d&#39;une analyse LC MS / MS, entraînant schéma de fragmentation am / z qui peut être utilisé pour déterminer la séquence d&#39;acides aminés primaire du peptide tryptique initial. Divers procédés de digestion peut être effectuée en fonction des types de détergents utilisés, ainsi que la spectrométrie de masse en aval flux de travail. Dans notre protocole, une électrophorèse PAGE-D suivie de l&#39;élimination du SDS à partir du gel est utilisé pour enlever toute contamination de détergent. L&#39;analyse de protéines qui sont difficiles à solubiliser, tels que des protéines membranaires, nécessite l&#39;utilisation de haute concentrations de SDS ou d&#39;autres détergents. Cela conduit à des problèmes de compatibilité avec l&#39;électrophorèse SDS-gel. Si l&#39;objectif d&#39;une étude nécessite la solubilisation de ces durs pour solubiliser les protéines, le système de tube de gel peut être utilisé 22,24. Procédé tube gel comprend moins de protéines de la matrice de gel sans l&#39;utilisation d&#39;électrophorèse. Par la suite des détergents utilisés pour la solubilisation sont retirés avant la digestion des protéines. La troisième phase est l&#39;analyse bioinformatique. Dans cette phase, les données de peptide MS / MS sont recherchées contre une base de données de séquences nucléotidiques traduites de déterminer quels sont les peptides et les protéines présentes dans l&#39;échantillon. L&#39;identification des peptides dépend de la base de données contre il est recherché. Metaproteomic données marines sont généralement recherchées contre les bases de données comprenant des génomes de référence, les données métagénomiques tels que le jeu de données mondial océan échantillonnage 25, ainsi que des génomes de cellules amplifié simples de li incultesneages 26,27. Identification des protéines peut également être augmentée par l&#39;inclusion de séquences metagénomiques partir du même échantillon que les données metaproteomic 5 a été dérivée. Ici, nous fournissons un protocole pour la production de peptides appropriés pour l&#39;analyse comparative MS / MS à partir de biomasse microbienne recueilli par filtration et stockées dans une solution de stabilisation de l&#39;ARN. Le protocole décrit ici permet d&#39;ADN et de protéines pour être isolés à partir du même échantillon de sorte que toutes les étapes menant à la protéine et les précipitations ADN sont identiques. D&#39;un point de vue pratique, moins filtration est nécessaire, car un seul filtre est nécessaire à la fois pour les protéines et l&#39;extraction d&#39;ADN. Nous tenons également à souligner que ce protocole a été créé grâce à la combinaison, l&#39;adaptation et la modification des deux protocoles précédemment publiés. Les étapes de lyse des cellules sont adaptées de Saito et al. (2011) 28 et la trypsine dans le gel digérer composant est conçu à partir de Shevchenko et al. (2007) 29.

<table><tbody><tr><td>Sterivex -GP 0.22 &mu ; m unité de filtration</td><td>Millipore</td><td>SVGP01050</td><td>Sampling</td></tr><tr><td>RNAlater Stabilization Solution</td><td>Ambion</td><td>AM7021</td><td>Sampling Tris</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Bio Basic</td><td>77-86-1 ou TB0196-500G</td><td>Extraction de protéines/ SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>Extraction</td></tr><tr><td>de protéines SDS</td><td>Bio Basic</td><td>15-21-3</td><td>Extraction de protéines/ SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio Basic</td><td>6381-92-6</td><td>Extraction de protéines</td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Fisher Scientific</td><td>56-81-5</td><td>Extraction</td></tr> <tr><td>de protéines10K Amicon Filter</td><td>Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Extraction de protéines</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179337-4L</td><td>Précipitation de protéines</td></tr><tr><td>Acétone</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-64-1</td><td>Précipitation de protéines</td></tr><tr><td>MPC Réactif de précipitation de protéines Epicenter</td><td></td><td>mmP03750</td><td>Précipitation d’ADN</td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>67-63-0</td><td>Précipitation de l’ADN</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Kit de dosage</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>Quantification de l’ADN</td></tr><tr><td>Kit de dosage des protéines Qubit</td><td>Life Technologies</td><td>Q33211</td><td>Quantification des protéines</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Bio Basic</td><td>57-50-1</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Bio Rad</td><td>161-0800</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>APS</td><td>Bio Rad</td><td>161-0700</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>30 % Acrylamide</td><td>Bio Rad</td><td>161-0158</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>SimplyBlue SafeStain</td><td>Invitrogen</td><td>LC6060</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Bio Rad</td><td>161-0718</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>B-mercaptoethanol</td><td>Bio Basic</td><td>60-24-2</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Laemmli Tampon d’échantillon</td><td>Bio Rad</td><td>161-0737</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Kaléidoscope Echelle</td><td>Bio Rad</td><td>161-0375EDU</td><td>SDS PAGE gel</td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>VWR</td><td>CABDH6044-4</td><td>In-gel Trypsine digest</td></tr><tr><td>NH4HCO3</td><td>Bio Basic</td><td>1066-33-7</td><td>In-gel Trypsine digest</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632-1G</td><td>In-gel Trypsine digest</td></tr><tr><td>Acide Formique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F0507-500ML</td><td>In-gel Trypsine digest</td></tr><tr><td>Qualité HPLC H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>270733-4L</td><td>In-gel Trypsine digest</td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>Bio Basic</td><td>144-48-9</td><td>In-gel Trypsin digest</td></tr><tr><td>Trypsine</td><td></td><td>Promega V5111</td><td>In-gel Trypsin digest</td></tr><tr><td>Protein LoBind Tube 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431081</td><td>In-gel Trypsin digest</td></tr><tr><td>2 ml ROBO flacon 9 mm</td><td>Candian Life Science</td><td>VT009/C395SB</td><td>Digestion de trypsine dans le gel</td></tr><tr><td>Insert PP BM, sans ressort</td><td>Candian Life Science</td><td>4025P-631</td><td>Digestion de trypsine en gel</td></tr></tbody></table>

un microbienne aquatique métaprotéomique workflow: à partir de cellules à tryptique peptides appropriés pour l&#39;analyse comparative-spectrométrie de masse en tandem

An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

Les technologies méta-omiques telles que la métagénomique, la métatranscriptomique et la métaprotéomique peuvent aider à la compréhension de la structure et du métabolisme des communautés microbiennes. Bien que puissante, la métagénomique ne peut à elle seule qu’élucider le potentiel fonctionnel. D’autre part, la métaprotéomique permet de décrire le métabolisme et la fonction exprimés in situ d’une communauté. Nous décrivons ici un protocole pour la lyse cellulaire, l’isolement des protéines et de l’ADN, ainsi que la digestion et l’extraction des peptides à partir de cellules microbiennes marines collectées sur une unité de filtre à cartouche (comme l’unité de filtre Sterivex) et conservées dans une solution de stabilisation d’ARN (comme RNAlater). Dans les études de protéomique basées sur la spectrométrie de masse, l’identification des peptides et des protéines est réalisée en comparant les spectres de masse en tandem peptidiques à une base de données de séquences nucléotidiques traduites. L’inclusion du métagénome d’un échantillon dans la base de données de recherche augmente le nombre de peptides et de protéines qui peuvent être identifiés à partir des spectres de masse. Par conséquent, dans ce protocole, l’ADN est isolé à partir du même filtre, qui peut être utilisé par la suite pour l’analyse métagénomique.

Comme une démonstration, nous avons effectué le protocole sur deux échantillons d&#39;eau de mer prélevés dans la surface et le maximum de la chlorophylle de l&#39;océan côtier dans le Nord canadien. En mer, l&#39;eau de mer 7/6 L a été passé à travers un 3 um GF / D préfiltre, puis les cellules microbiennes ont été recueillis sur un filtre à cartouche de 0,22 pm en suivant le protocole de Walsh et al. 20. Les cellules ont été immédiatement stockés dans une solution de stabilisation de l&#39;ARN jusq...

Ce protocole permet l’extraction et la concentration de protéines et d’ADN à partir de biomasse microbienne prélevée dans l’eau de mer, suivie de la génération de peptides tryptiques adaptés à l’analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse en tandem.

Un microbienne aquatique métaprotéomique Workflow: à partir de cellules à tryptique peptides appropriés pour l&#39;analyse comparative-spectrométrie de masse en tandem

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

L'objectif de cette procédure est l'extraction de protéines et d'ADN à partir de la biomasse microbienne présente dans l'eau de mer, suivie de la génération de peptides triptiques pour une analyse protéomique par spectrométrie de masse en tandem. Cette opération s'effectue en deux étapes : premièrement, la lyse des cellules préalablement accumulées sur un filtre en cartouche ; deuxièmement, la concentration du lysat cellulaire à l'aide d'unités de filtration ultracentrifuges.Ensuite, le lysat est séparé en deux fractions, une pour la précipitation des protéines et une pour la précipitation de l'ADN. La dernière étape consiste à effectuer une digestion intragel par la trypsine des protéines et à extraire les peptides adaptés à une analyse par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem. Enfin, une analyse bio-informatique ultérieure peut être utilisée pour identifier les protéines exprimées dans l'échantillon, tandis que l'ADN isolé peut être utilisé pour une analyse métagénomique ou du gène ARN 16 S.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que les protéines et l'ADN peuvent être isolés simultanément à partir du même échantillon. Pour commencer, expulsez la solution de stabilisation de l'ARN hors de l'unité de filtration à cartouche et dans un tube microcentrifuge de deux millilitres à l’aide d’une seringue de 60 millilitres fixée à l’extrémité à raccord fileté de la centrifugeuse à filtre, puis centrifugez le tube microcentrifuge de deux millilitres pendant 10 minutes à 17 000 × g pour former un culot contenant les débris cellulaires. Après la centrifugation, transférez le surnageant vers une unité de filtration ultracentrifuge de 10 kDa afin de capturer toutes les protéines provenant des cellules qui se sont lysées dans l’échantillon.Ne jetez pas le culot. Effectuez une centrifugation de l'unité de filtration ultracentrifuge à 3 270 × g pendant 30 minutes ou jusqu'à ce que le volume soit réduit à environ 600 microlitres. Pendant ce temps, faites fondre l'extrémité d'une pipette P 10 et obturez le côté non « lure lock » de l'unité de filtre à cartouche avec l'extrémité ouverte de la pipette.Cela garantira qu'aucun tampon d'extraction ni aucune biomasse ne s'échappe lors des étapes suivantes. Pour suspendre le culot dans un millilitre de solution d'extraction SDS, pipetez-le dans l'unité de filtration à cartouche d'origine. La méthode la plus simple pour pipeter dans l'unité de filtration à cartouche consiste à empiler une pointe P200 sur une pointe P1000 et à utiliser cette double pointe pour la pipetterie. Ajoutez un millilitre supplémentaire de solution d'extraction SDS dans l'unité de filtration à cartouche afin que le volume total soit d'environ deux millilitres.Parafilm. Fermer l'extrémité du blocage d'appât de l'unité de filtration à cartouche et placer l'unité de filtration à cartouche dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, placer trois lingettes de laboratoire froissées au fond d'un tube conique de 50 millilitres.Fermer le couvercle et placer le tube dans l’étuve d’hybridation pour une incubation de 10 minutes à température ambiante sous agitation rotative. Après 10 minutes, placer le filtre sur un flotteur en mousse et le fixer en place à l’aide d’une seringue de cinq millilitres fixée à l’extrémité « lure lock », puis charger et incuber dans un bain-marie à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes. Laisser ensuite refroidir l’unité de filtration et poursuivre l’agitation rotative pendant une heure à température ambiante. Une fois refroidi, expulser la solution d’extraction SDS et le lysat cellulaire du filtre à l’aide d’une seringue de 60 millilitres vers la même unité de filtration ultracentrifuge.Comme précédemment, ajoutez un millilitre de solution fraîche d'extraction au SDS dans l'unité de filtre à cartouche et mélangez manuellement pendant 30 secondes. Ensuite, expulsez le contenu du filtre dans l'unité de filtration ultracentrifuge à l’aide de la seringue de 60 millilitres afin de rincer et de garantir que toutes les protéines ont été retirées et récupérées. Effectuez une centrifugation de l’unité de filtration ultracentrifuge pendant 45 minutes à 3 270 ×g, ou jusqu’à ce que le volume dans l’unité de filtration soit inférieur à 600 µL.Jetez le flux et complétez le filtre ultracentrifuge avec une solution fraîche d'extraction de SDS. Faites centrifuger le filtre pendant encore 45 minutes à 3 270 fois la gravité, puis répétez cette étape deux fois de plus. Veillez à ce que le volume final dans le filtre ultracentrifuge ne dépasse pas 600 microlitres à la fin de la dernière centrifugation.À ce stade, mesurez le volume du concentrat et divisez-le en deux fractions. Une fraction sera utilisée pour la précipitation de l'ADN et l'autre pour la précipitation des protéines. Pour la précipitation des protéines, ajoutez quatre volumes de méthanol et d'acétone dans un rapport 50 à 50 à un volume de concentrat, puis vortexez pendant 10 secondes et incubez toute la nuit à moins 20 degrés Celsius.Le lendemain, centrifuger une fois le mélange à 17 000 ×g pendant 30 minutes, puis verser le surnageant. Laisser le culot sécher dans un appareil de lyophilisation accélérée (speed vac) pendant une heure. Ne pas trop dessécher le culot, car cela pourrait rendre sa resuspension difficile.Suspendez le culot dans 25 microlitres de solution d'extraction SDS. Laissez reposer pendant une heure, puis resuspendez en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Réalisez une électrophorèse SDS-PAGE sur les protéines comme décrit dans le protocole écrit, en travaillant dans une cabine de sécurité biologique afin de minimiser la contamination, et découpez l'excès de gel sous le repère de 10 kilodaltons pour chaque puits.Chaque bande sera analysée sur un spectromètre de masse en tandem. Indépendamment, découper chaque bande en carrés d’un millimètre sur un millimètre afin d’augmenter la surface disponible, puis placer tous les carrés provenant de la bande dans un tube micro-centrifuge à faible rétention. Répéter cette opération pour toutes les bandes ; de l’acide acétique à 1 % peut être utilisé pour éviter que le gel ne s’assèche et ne devienne difficile à découper.Procédez à la digestion trypsique en gel et à l'extraction des peptides comme décrit dans le protocole écrit, ou à la précipitation de l'ADN dans la solution d'extraction de SDS jusqu'à la fraction concentrée devant être utilisée pour la précipitation de l'ADN, en complétant jusqu'au trait de 500 microlitres. Cette étape a simplement pour but d'augmenter le volume de la solution, facilitant ainsi la manipulation. Ensuite, ajoutez 0,583 volume d'un réactif de précipitation des protéines, tel que le réactif MPC de précipitation des protéines, et vortexez.Pendant 10 secondes, une forme de précipité blanc est centrifugée à 17 000 ×g et à 4 °C pendant 10 minutes. Après la centrifugation, transférez le surnageant dans un autre tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et ajoutez 0,95 volume d'isopropanol ; inversez le tube 30 à 40 fois, puis centrifugez pendant 10 minutes à 4 °C à vitesse maximale. Versez soigneusement et jetez le surnageant. Rincez ensuite le culot deux fois avec 750 microlitres d'éthanol à 70 %.Éliminer autant d'éthanol que possible à l'aide d'une pipette, puis laisser sécher le culot à l'air libre. Ne pas trop dessécher l'ADN, car cela pourrait rendre sa resuspension difficile une fois sec. Resuspendre le culot dans 25 microlitres de tampon LT à pH 8.Quantifiez l'ADN à l'aide d'un kit de dosage de l'ADN double brin et conformément aux instructions du fabricant. Réalisez également une électrophorèse sur gel d'agarose à partir de trois microlitres de l'ADN afin de vérifier sa qualité. Les peptides ont été soumis à une analyse en spectrométrie de masse en tandem. Plus de 23 000 spectres ont été générés par échantillon, permettant l'identification de peptides et de protéines.La composition taxonomique et fonctionnelle des méta-protéomes a été analysée à l'aide d'une combinaison de blast P et de l'analyseur de métagénome. Les protéines attribuées aux alpha-protéobactéries, fournies par le logiciel, étaient les plus représentées dans le jeu de données. La grande majorité d'entre elles a été attribuée au clade SAR R 11.Le clade Roter des Alpha-protéobactéries a également été fortement représenté et identifié, le plus souvent dans les eaux de surface. Les protéines attribuées aux bactéries pathogènes étaient également réparties entre la surface et le maximum de chlorophylle, mais les protéines des bactéries en flèche étaient identifiées dans une plus grande mesure au niveau du maximum de chlorophylle.Les protéines des bactéries gamma protéobactéries étaient uniformément réparties dans toute la colonne d'eau, tandis que les protéines des bactéries bêta protéobactéries se trouvaient principalement en surface. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours si elle est exécutée correctement.

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Fast Processing Enzymatic des protéines pour MS de détection avec un microréacteur Flow-through

Ici, nous présentons des protocoles pour la purification par affinité des complexes de protéines et leur séparation par PAGE native bleu, suivie par le profilage de corrélation de la protéine en utilisant le marqueur libre spectrométrie de masse quantitative. Cette méthode est utile pour résoudre interactomes dans des complexes protéiques distincts.

Résoudre les complexes protéiques purifiés par affinité de Blue native PAGE et le profilage de corrélation des protéines

Nous présentons un protocole visant à quantifier avec précision les protéines avec étiquetage isobare, vaste fractionnement, outils bioinformatiques et mesures de contrôle de la qualité en combinaison avec la chromatographie liquide couplée à un spectromètre de masse à haute résolution.

Profilage de Proteome profonde en étiquetage isobare, vaste chromatographie en phase liquide, spectrométrie de masse et Quantification assistée par logiciel

Ce protocole décrit un débit unique pour les techniques analytiques et omiques complémentaires aboutissant à une caractérisation entièrement appariés de la matière organique naturelle et de la protéomique microbienne dans les écosystèmes différents. Cette approche permet des comparaisons robustes pour l’identification des voies métaboliques et les transformations importantes pour décrire la production de gaz à effet de serre et de prédire les réponses aux changements environnementaux.

Single-débit haute résolution analytique des Techniques complémentaires pour caractériser les mélanges complexes de matière organique naturelle

Le protocole décrit fournit une analyse protéomique quantitative optimisée des échantillons de tissus à l’aide de deux approches : la quantification basée sur l’étiquette et la quantification sans étiquette. Les approches basées sur l’étiquette ont l’avantage d’une quantification plus précise des protéines, tandis qu’une approche sans étiquette est plus rentable et utilisée pour analyser des centaines d’échantillons d’une cohorte.

Flux de travail complet de protéomique des échantillons de tissus basée sur la spectrométrie de masse

Nous décrivons ici une caractérisation protéomique basée sur la spectrométrie de masse de lignées cellulaires avec des destins tissulaires connus chez l’embryon vertébré Xenopus laevis .

Protéomique de spectrométrie de masse guidée par lignée cellulaire dans l’embryon (grenouille) en développement

La métaprotéomique clinique offre un aperçu du microbiome humain et de ses contributions à la maladie. Nous avons exploité la puissance de calcul de la plateforme Galaxy pour développer un flux de travail bioinformatique modulaire qui facilite l’analyse métaprotéomique complexe basée sur la spectrométrie de masse et la caractérisation de divers types d’échantillons cliniques pertinents pour les études de maladies.

Un flux de travail de métaprotéomique clinique mis en œuvre au sein de la plateforme bioinformatique Galaxy pour analyser les interactions hôte-microbiome sous-jacentes aux maladies humaines

Ici, nous établissons une méthode protéomique basée sur la spectrométrie de masse en utilisant des régions d’intérêt isolées dans des coupes de tissus fixées au formol et incluses dans la paraffine. Ce protocole est utilisé pour analyser le protéome de zones tissulaires spécifiques dans des coupes de tissus archivées fixées au formol et incluses dans la paraffine.

Une approche simplifiée pour la protéomique basée sur la spectrométrie de masse à l’aide de régions tissulaires sélectionnées

Découvrez un workflow métaprotéomique pour extraire protéines et ADN de biomasses microbiennes marines. Cette méthode génère des peptides tryptiques adaptés à l'analyse par spectrométrie de masse en tandem.

Un microbienne aquatique métaprotéomique Workflow: à partir de cellules à tryptique peptides appropriés pour lanalyse comparative-spectrométrie de masse en tandem (Vidéo) | JoVE Journal

Un microbienne aquatique métaprotéomique Workflow: à partir de cellules à tryptique peptides appropriés pour l'analyse comparative-spectrométrie de masse en tandem

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