Un microbienne aquatique métaprotéomique Workflow: à partir de cellules à tryptique peptides appropriés pour l'analyse comparative-spectrométrie de masse en tandem
15 septembre 2015
Ce protocole permet l’extraction et la concentration de protéines et d’ADN à partir de biomasse microbienne prélevée dans l’eau de mer, suivie de la génération de peptides tryptiques adaptés à l’analyse protéomique basée sur la spectrométrie de masse en tandem.
L'objectif de cette procédure est l'extraction de protéines et d'ADN à partir de la biomasse microbienne présente dans l'eau de mer, suivie de la génération de peptides triptiques pour une analyse protéomique par spectrométrie de masse en tandem. Cette opération s'effectue en deux étapes : premièrement, la lyse des cellules préalablement accumulées sur un filtre en cartouche ; deuxièmement, la concentration du lysat cellulaire à l'aide d'unités de filtration ultracentrifuges.
Ensuite, le lysat est séparé en deux fractions, une pour la précipitation des protéines et une pour la précipitation de l'ADN. La dernière étape consiste à effectuer une digestion intragel par la trypsine des protéines et à extraire les peptides adaptés à une analyse par chromatographie liquide et spectrométrie de masse en tandem. Enfin, une analyse bio-informatique ultérieure peut être utilisée pour identifier les protéines exprimées dans l'échantillon, tandis que l'ADN isolé peut être utilisé pour une analyse métagénomique ou du gène ARN 16 S.
L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes est que les protéines et l'ADN peuvent être isolés simultanément à partir du même échantillon. Pour commencer, expulsez la solution de stabilisation de l'ARN hors de l'unité de filtration à cartouche et dans un tube microcentrifuge de deux millilitres à l’aide d’une seringue de 60 millilitres fixée à l’extrémité à raccord fileté de la centrifugeuse à filtre, puis centrifugez le tube microcentrifuge de deux millilitres pendant 10 minutes à 17 000 × g pour former un culot contenant les débris cellulaires. Après la centrifugation, transférez le surnageant vers une unité de filtration ultracentrifuge de 10 kDa afin de capturer toutes les protéines provenant des cellules qui se sont lysées dans l’échantillon.
Ne jetez pas le culot. Effectuez une centrifugation de l'unité de filtration ultracentrifuge à 3 270 × g pendant 30 minutes ou jusqu'à ce que le volume soit réduit à environ 600 microlitres. Pendant ce temps, faites fondre l'extrémité d'une pipette P 10 et obturez le côté non « lure lock » de l'unité de filtre à cartouche avec l'extrémité ouverte de la pipette.
Cela garantira qu'aucun tampon d'extraction ni aucune biomasse ne s'échappe lors des étapes suivantes. Pour suspendre le culot dans un millilitre de solution d'extraction SDS, pipetez-le dans l'unité de filtration à cartouche d'origine. La méthode la plus simple pour pipeter dans l'unité de filtration à cartouche consiste à empiler une pointe P200 sur une pointe P1000 et à utiliser cette double pointe pour la pipetterie. Ajoutez un millilitre supplémentaire de solution d'extraction SDS dans l'unité de filtration à cartouche afin que le volume total soit d'environ deux millilitres.
Parafilm. Fermer l'extrémité du blocage d'appât de l'unité de filtration à cartouche et placer l'unité de filtration à cartouche dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, placer trois lingettes de laboratoire froissées au fond d'un tube conique de 50 millilitres.
Fermer le couvercle et placer le tube dans l’étuve d’hybridation pour une incubation de 10 minutes à température ambiante sous agitation rotative. Après 10 minutes, placer le filtre sur un flotteur en mousse et le fixer en place à l’aide d’une seringue de cinq millilitres fixée à l’extrémité « lure lock », puis charger et incuber dans un bain-marie à 95 degrés Celsius pendant 15 minutes. Laisser ensuite refroidir l’unité de filtration et poursuivre l’agitation rotative pendant une heure à température ambiante. Une fois refroidi, expulser la solution d’extraction SDS et le lysat cellulaire du filtre à l’aide d’une seringue de 60 millilitres vers la même unité de filtration ultracentrifuge.
Comme précédemment, ajoutez un millilitre de solution fraîche d'extraction au SDS dans l'unité de filtre à cartouche et mélangez manuellement pendant 30 secondes. Ensuite, expulsez le contenu du filtre dans l'unité de filtration ultracentrifuge à l’aide de la seringue de 60 millilitres afin de rincer et de garantir que toutes les protéines ont été retirées et récupérées. Effectuez une centrifugation de l’unité de filtration ultracentrifuge pendant 45 minutes à 3 270 ×g, ou jusqu’à ce que le volume dans l’unité de filtration soit inférieur à 600 µL.
Jetez le flux et complétez le filtre ultracentrifuge avec une solution fraîche d'extraction de SDS. Faites centrifuger le filtre pendant encore 45 minutes à 3 270 fois la gravité, puis répétez cette étape deux fois de plus. Veillez à ce que le volume final dans le filtre ultracentrifuge ne dépasse pas 600 microlitres à la fin de la dernière centrifugation.
À ce stade, mesurez le volume du concentrat et divisez-le en deux fractions. Une fraction sera utilisée pour la précipitation de l'ADN et l'autre pour la précipitation des protéines. Pour la précipitation des protéines, ajoutez quatre volumes de méthanol et d'acétone dans un rapport 50 à 50 à un volume de concentrat, puis vortexez pendant 10 secondes et incubez toute la nuit à moins 20 degrés Celsius.
Le lendemain, centrifuger une fois le mélange à 17 000 ×g pendant 30 minutes, puis verser le surnageant. Laisser le culot sécher dans un appareil de lyophilisation accélérée (speed vac) pendant une heure. Ne pas trop dessécher le culot, car cela pourrait rendre sa resuspension difficile.
Suspendez le culot dans 25 microlitres de solution d'extraction SDS. Laissez reposer pendant une heure, puis resuspendez en pipetant plusieurs fois vers le haut et vers le bas. Réalisez une électrophorèse SDS-PAGE sur les protéines comme décrit dans le protocole écrit, en travaillant dans une cabine de sécurité biologique afin de minimiser la contamination, et découpez l'excès de gel sous le repère de 10 kilodaltons pour chaque puits.
Chaque bande sera analysée sur un spectromètre de masse en tandem. Indépendamment, découper chaque bande en carrés d’un millimètre sur un millimètre afin d’augmenter la surface disponible, puis placer tous les carrés provenant de la bande dans un tube micro-centrifuge à faible rétention. Répéter cette opération pour toutes les bandes ; de l’acide acétique à 1 % peut être utilisé pour éviter que le gel ne s’assèche et ne devienne difficile à découper.
Procédez à la digestion trypsique en gel et à l'extraction des peptides comme décrit dans le protocole écrit, ou à la précipitation de l'ADN dans la solution d'extraction de SDS jusqu'à la fraction concentrée devant être utilisée pour la précipitation de l'ADN, en complétant jusqu'au trait de 500 microlitres. Cette étape a simplement pour but d'augmenter le volume de la solution, facilitant ainsi la manipulation. Ensuite, ajoutez 0,583 volume d'un réactif de précipitation des protéines, tel que le réactif MPC de précipitation des protéines, et vortexez.
Pendant 10 secondes, une forme de précipité blanc est centrifugée à 17 000 ×g et à 4 °C pendant 10 minutes. Après la centrifugation, transférez le surnageant dans un autre tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre et ajoutez 0,95 volume d'isopropanol ; inversez le tube 30 à 40 fois, puis centrifugez pendant 10 minutes à 4 °C à vitesse maximale. Versez soigneusement et jetez le surnageant. Rincez ensuite le culot deux fois avec 750 microlitres d'éthanol à 70 %.
Éliminer autant d'éthanol que possible à l'aide d'une pipette, puis laisser sécher le culot à l'air libre. Ne pas trop dessécher l'ADN, car cela pourrait rendre sa resuspension difficile une fois sec. Resuspendre le culot dans 25 microlitres de tampon LT à pH 8.
Quantifiez l'ADN à l'aide d'un kit de dosage de l'ADN double brin et conformément aux instructions du fabricant. Réalisez également une électrophorèse sur gel d'agarose à partir de trois microlitres de l'ADN afin de vérifier sa qualité. Les peptides ont été soumis à une analyse en spectrométrie de masse en tandem. Plus de 23 000 spectres ont été générés par échantillon, permettant l'identification de peptides et de protéines.
La composition taxonomique et fonctionnelle des méta-protéomes a été analysée à l'aide d'une combinaison de blast P et de l'analyseur de métagénome. Les protéines attribuées aux alpha-protéobactéries, fournies par le logiciel, étaient les plus représentées dans le jeu de données. La grande majorité d'entre elles a été attribuée au clade SAR R 11.
Le clade Roter des Alpha-protéobactéries a également été fortement représenté et identifié, le plus souvent dans les eaux de surface. Les protéines attribuées aux bactéries pathogènes étaient également réparties entre la surface et le maximum de chlorophylle, mais les protéines des bactéries en flèche étaient identifiées dans une plus grande mesure au niveau du maximum de chlorophylle.
Les protéines des bactéries gamma protéobactéries étaient uniformément réparties dans toute la colonne d'eau, tandis que les protéines des bactéries bêta protéobactéries se trouvaient principalement en surface. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois jours si elle est exécutée correctement.
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Aperçu
Ce protocole décrit l'extraction et la concentration des protéines et de l'ADN à partir de la biomasse microbienne prélevée sur de l'eau de mer. Il inclut la génération de peptides tryptiques adaptés à une analyse protéomique par spectrométrie de masse en tandem.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Écologie microbienne
- Protéomique
- Métagnénomique
Contexte
- La biomasse microbienne provenant de l'eau de mer est une source précieuse pour l'étude des écosystèmes marins.
- L'analyse protéomique permet de comprendre l'expression des protéines au sein des communautés microbiennes.
- L'extraction d'ADN permet des études métagénomiques et l'identification d'espèces microbiennes.
- La spectrométrie de masse en tandem est un outil puissant pour analyser des mélanges complexes de protéines.
Objectif de l'étude
- Extraire des protéines et de l'ADN à partir d'échantillons microbiens d'eau de mer.
- Préparer des peptides tryptiques pour une analyse par spectrométrie de masse.
- Faciliter l'analyse bioinformatique pour l'identification des protéines.
Méthodes utilisées
- Lysis des cellules accumulées sur un filtre en cartouche.
- Concentration du lysat cellulaire à l'aide d'unités de filtration ultracentrifuges.
- Séparation du lysat en fractions pour la précipitation des protéines et de l'ADN.
- Digestion enzymatique des protéines par la trypsine en gel pour extraire les peptides.
Résultats principaux
- Extraction réussie de protéines et d'ADN à partir de la biomasse microbienne.
- Génération de peptides tryptiques adaptés à l'analyse par LC-MS/MS.
- Identification des protéines exprimées par analyse bioinformatique.
- Isolation de l'ADN pour l'analyse métagénomique et du gène ARNr 16S.
Conclusions
- Le protocole permet une analyse complète des communautés microbiennes dans l'eau de mer.
- Il fournit un cadre pour les études futures sur l'écologie microbienne marine.
- L'intégration des données protéomiques et génomiques améliore la compréhension des fonctions microbiennes.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
Ce protocole permet l'extraction simultanée de protéines et d'ADN à partir de communautés microbiennes complexes, soutenant ainsi des approches intégrées d'omique pour la réduction des risques liés aux cibles en phase de découverte précoce. En générant des peptides tryptiques adaptés à la spectrométrie de masse en tandem, il fournit des données protéomiques quantitatives pouvant éclairer la compréhension mécanistique du métabolisme microbien et des interactions hôte-microbe pertinentes pour la validation de cibles thérapeutiques. La méthode renforce la confiance prédictive dans le choix des cibles en reliant les profils protéiques exprimés aux données de génomique fonctionnelle provenant du même échantillon.
Applications stratégiques en R-D biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet l'analyse des voies métaboliques exprimées dans les communautés microbiennes, soutenant l'identification ciblée d'hypothèses et la validation fonctionnelle.
- Valeur opérationnelle : Fournit un protocole normalisé pour l'isolement simultané de matériel protéomique et génomique à partir de la même biomasse, réduisant la variabilité des échantillons et améliorant la concordance des données.
Développement de criblages et de tests
- Valeur scientifique : Génère des mélanges de peptides adaptés à l'analyse par LC-MS/MS, permettant une identification et une quantification fiables des protéines dans le cadre de la découverte de biomarqueurs.
- Valeur opérationnelle : Produit des extraits peptidiques reproductibles compatibles avec les plateformes de spectrométrie de masse en aval, favorisant la standardisation des dosages entre laboratoires.
Recherche translationnelle et préclinique
- Valeur scientifique : Facilite la continuité entre la découverte et la validation préclinique en associant des signatures métaprotéomiques au contexte métagénomique, soutenant ainsi une dé-risquisation mécanistique des interventions ciblant le microbiome.
- Valeur opérationnelle : Permet l'analyse parallèle des fonctions microbiennes pertinentes pour l'hôte et de leur potentiel génétique, orientant les stratégies de biomarqueurs translationnels.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans la phase précoce de la découverte, soutenant la vérification d'hypothèses dans les systèmes microbiens et permettant l'intégration de données pour l'identification de candidats prometteurs dans les domaines thérapeutiques modulant le microbiome.
- Biologie de la découverte : Soutient la validation fonctionnelle des cibles en identifiant les protéines exprimées et leurs origines taxonomiques, précisant les voies métaboliques impliquées dans l'interaction avec l'hôte.
- Criblage : Génère des extraits peptidiques normalisés adaptés à un profilage reproductible par spectrométrie de masse, permettant des analyses comparatives entre différentes conditions ou traitements.
- Analytique : Fournit des mesures quantitatives des peptides et des protéines qui permettent des comparaisons statistiques et l'intégration des données avec des jeux de données métagénomiques.
- Recherche translationnelle : Relie les résultats protéomiques au contexte génomique du même échantillon, facilitant l'alignement des biomarqueurs et l'élucidation des mécanismes d'action.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme réutilisable pour l'échantillonnage multi-omique d'environnements complexes, réduisant les traitements redondants des échantillons et améliorant la cohérence entre projets.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive dans la validation des cibles en fournissant des preuves directes de l'expression des protéines et de leur contexte fonctionnel.
- Valeur opérationnelle : Améliore la reproductibilité et l'évolutivité grâce à des étapes standardisées de lyse, de concentration et de fractionnement compatibles avec un traitement à haut débit.
- Valeur stratégique : Permet de prendre des décisions éclairées d'aller/arrêt en réduisant l'ambiguïté biologique dans le choix des cibles par la concordance multi-omique.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles associées au microbiome en intégrant des données protéomiques fonctionnelles avec le potentiel génomique.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise dans la manipulation des échantillons microbiens, la précipitation des protéines et les techniques de digestion en gel.
- Dépend de l'accès à des unités de filtration par ultracentrifugation, à des instruments de spectrométrie de masse et à des pipelines de bioinformatique pour l'analyse métaprotéomique.
- Exige des protocoles standardisés pour la préservation et la lyse des échantillons afin d'assurer la reproductibilité entre les sites et les types d'échantillons.
- Implique des adaptations selon les différentes sources de biomasse microbienne et les conditions de préservation.
- Est limité par l'efficacité de la récupération des protéines à partir de matrices environnementales complexes et par les interférences potentielles dues aux contaminants présents dans les échantillons d'eau de mer.
