In Situ détection des bactéries dans les tissus inclus en paraffine Utiliser une sonde ADN de digoxine marqué ciblage ARNr 16S

L’objectif global de cette procédure est de localiser les bactéries dans les tissus inclus dans la paraffine à l’aide de l’ARN 16 s ribosomal, marqué DIG, ciblant les sondes d’ADN. Pour ce faire, la sonde est d’abord préparée à l’aide d’une amplification PCR et d’un marquage DIG. La deuxième étape consiste à préparer les coupes de tissus pour avoir des sites cibles plus accessibles et moins de liaison de fond.

Ensuite, les coupes de tissu préparées sont hybridées avec la sonde marquée Dig Tag. Enfin, la sonde hybridée est détectée avec de la phosphatase alcaline, marquée anti-D dig antibodies. En fin de compte, cette méthode d’hybridation en C deux peut montrer la présence de bactéries avec des tissus inclus dans la paraffine.

L’avantage de cette détection par rapport à une méthode existante comme l’ING est qu’elle peut détecter les bactéries SHS dans le contexte de certaines structures histologiques. Cette méthode peut donner un aperçu de la pathogenèse, mais aussi de divers inflammatoires tels que la parodontite et la planète R. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes de préparation des tissus et de digestion hybride sont difficiles à exécuter car les sections de tissus sont facilement endommagées.

Pour fabriquer la sonde bactérienne U, utilisez une paire de 70 bases, un fragment d’ADN comme matrice et deux amorces de 15 paires de bases pour amplifier la sonde par PCR. Recueillir l’amplicon dans le tampon à une concentration connue. Étiquetez ensuite la sonde avec un kit de marquage et de détection d’ADN dig.

Mélangez d’abord trois microgrammes de la sonde dans 15 microlitres d’eau. Dénaturez la sonde dans le bloc de chaleur pendant 10 minutes à 95 degrés Celsius. Ensuite, mettez la sonde dénaturée sur de la glace.

Ensuite, ajoutez deux microlitres de 10 nucléotides XH, deux microlitres de DN NTP et un microlitre d’enzyme canalaire. Une fois mélangée, laissez la sonde incuber à 37 degrés Celsius pendant 24 à 48 heures plus tard. Arrêtez la réaction en chauffant le mélange à 65 degrés Celsius.

Mesurez ensuite la concentration d’ADN de la sonde marquée à 260 nanomètres et ajustez une concentration à 100 nanogrammes par microlitre. À l’aide du kit, vérifiez d’abord la sensibilité des sondes sur une membrane en nylon chargée d’un microlitre de contrôle positif dilué en série. Sonde et creusement étiqueté sonde.

Laissez sécher la membrane pendant cinq minutes. Une fois sèche, trempez brièvement la membrane dans deux XSSC, puis transférez-la dans un incubateur à 80 degrés Celsius pendant une heure. Pour immobiliser l’ADN après l’incubation, trempez brièvement la membrane dans un tampon d’acide maléique, puis transférez-la dans un tampon de blocage concentré avec des anticorps conjugués AP à une dilution de un à 5 000 après une demi-heure.

Lavez la membrane dans MABT. Mélangez ensuite 40 microlitres de N-B-T-B-C-I-P dans deux millilitres de tampon de détection. Et après le bain, ajoutez ce mélange à la membrane pendant une minute.

Après avoir retiré la paraffine et réhydraté les sections de tissu comme décrit dans le protocole de texte, préparez-les pour l’hybridation en C deux, plongez d’abord les lames dans de l’acide chlorhydrique 0,1 normal pendant 20 minutes. Après le bain d’acide, lavez les lames avec de l’eau traitée au DEPC pendant 30 secondes. Ensuite, à l’aide d’un stylo à cire, tracez le contour des spécimens sur chaque lame.

Ensuite, ajoutez 50 à 400 microlitres de solution de protéinase K aux échantillons, en fonction de leur taille. Laissez l’enzyme agir pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, puis lavez les lames dans un XPBS traité au DEPC pendant une minute. Transférez maintenant les lames à 4 % d’aldéhyde paraforme dans du PBS traité au DEPC pendant 10 minutes.

Lavez le fixateur avec du PBS comme auparavant. Ensuite, baignez les lames dans du chlorhydrate de triéthanolamine à 0,1 molaire à pH huit avec 0,5 % d’acétique et d’hydrure après 20 minutes, lavez les lames à l’eau claire comme auparavant. Commencez maintenant le en C deux en immergeant d’abord les diapositives dans deux XSSC pendant 20 minutes.

Pendant ce temps, diluez la sonde marquée à un nanogramme par microlitre dans un tampon d’hybridation pour un contrôle négatif. Utilisez 10 fois la concentration de la sonde non marquée. Ensuite, dénaturez les sondes en les chauffant à 90 degrés Celsius pendant 10 minutes, puis en les refroidissant rapidement sur de la glace.

Ensuite, appliquez à chaque lame le même volume de dilution de la sonde que la protéinase K qui avait été appliquée précédemment. Ensuite, couvrez soigneusement les sections de glissement et scellez les sections avec du vernis à ongles. Maintenant, chauffez les lames sur un bloc de machine PCR à 90 degrés Celsius pendant 10 minutes et transférez-les dans un incubateur humidifié à 45 degrés Celsius pendant la nuit le lendemain.

Refroidissez les lames à quatre degrés Celsius pendant une demi-heure, puis retirez délicatement les lamelles. Les tissus sont fragiles. Enfin, passez les lames dans une série de tampons SSC à température ambiante.

Tout d’abord, lavez les deux lames hybrides NC pendant cinq minutes dans MABT. Appliquer ensuite 50 à 400 microlitres de solution de blocage à 1 %tentre20 pendant 20 minutes. Après l’incubation en bloc, appliquez 50 à 400 microlitres d’un à 1000 anticorps anti-D dig phosphatase alcaline et une solution bloquante.

Laissez-le se lier pendant 90 minutes à 37 degrés Celsius après l’application du primaire. Lavez les lames dans MABT pendant 10 minutes. Ensuite, pendant cinq minutes, placez les lames dans le tampon de détection avec 1 %tween 20.

Appliquez maintenant 50 à 400 microlitres d’une huile millimolaire dans une solution tampon de détection sur chaque lame et incuberez-les pendant cinq minutes pour inactiver la phosphatase alcaline endogène. Ensuite, ajoutez 50 à 400 microlitres de N-B-T-B-C-I-P dilué en détection. Tamponnez de un à 100 sur chaque lame et laissez les lames incuber pendant deux à trois heures dans une chambre humidifiée en fonction de l’expérience.

Rincez les lames avec de l’eau DI, puis appliquez du vert de méthyle à 0,05 % en poids par volume et laissez la tache de comptoir agir sur le tissu pendant 10 minutes. À 37 degrés Celsius. Lavez à nouveau les lames avec de l’eau DI, puis déshydratez-les avec de l’éthanol à 100 %, puis trempez-les dans du xylène.

Enfin, appliquez 80 microlitres de support de montage et de lamelle. Les lames après les sondes ont été étiquetées. Leur sensibilité a été comparée à la dilution d’une sonde de contrôle positif.

La sonde spécifique à 3 paires de 43 bases p gingivalis était 25 fois plus sensible que la sonde bactérienne à 70 paires de bases. Les deux sondes ont ensuite été appliquées sur des tissus gingivaux de patients atteints de parodontite chronique à fort grossissement. Les différentes formes de bactéries ont été discernées à l’aide de la sonde bactérienne.

Alors que la sonde spécifique de p gingivalis n’a détecté que des bactéries en forme de bâtonnet, un DSS chimique perturbant les jonctions serrées a été appliqué sur la muqueuse gingivale de souris. Des échantillons de tissus de ces souris ont été utilisés pour comparer les sondes dans un contexte différent. Ici, la sonde bactérienne U a pu détecter les bactéries que l’autre ne pouvait pas détecter.

La sonde bactérienne U a ensuite été testée pour sa capacité à détecter d’autres bactéries dans des sections de tissu pulmonaire contenant des tumeurs. Des bactéries ont été détectées à l’extérieur de la tumeur ainsi qu’à l’intérieur de la tumeur. En examinant des tissus de patients atteints de lichen plan buccal, une maladie d’étiologie inconnue, la sonde bactérienne a détecté des signaux bactériens dans les cellules de l’épithélium et de la lamina propria où une infiltration inflammatoire a été observée.

Depuis son développement, cette technique a aidé le chercheur dans le domaine des maladies infectieuses à explorer l’invasion des bactéries dans les tissus chez les humains et les animaux à la suite de cette procédure. D’autres méthodes, comme la détection immunochimique, la croissance jusqu’au marqueur cellulaire peuvent être ED afin de répondre à des questions supplémentaires telles que le type de cellules qui hébergent les bactéries dans les tissus.