Conception et construction de la matrice extracellulaire artificielle (AECM) Protéines de Escherichia coli Pour l'ingénierie tissulaire de la peau

L’objectif général de cette procédure est de démontrer les étapes impliquées dans la construction et la production de protéines ECM artificielles ou de répétitions similaires à l’élastine contenant de l’élastine. Ceci est accompli en construisant d’abord des gènes recombinants qui codent pour les protéines A ECM. Ensuite, les gènes recombinants sont insérés dans des hôtes bactériens.

À ce stade, les protéines recombinantes sont exprimées dans les hôtes bactériens, puis récoltées après l’extraction des protéines par lyse cellulaire. La dernière étape consiste à purifier les protéines à l’aide du cycle de transition inverse ou ITC, qui exploite le comportement unique de transition de phase de l’élastine. Comme les polypeptides.

Les cycles de centrifugation sont effectués à quatre degrés Celsius et 37 degrés Celsius. En fin de compte, l’électrophorèse sur gel et les techniques de western blot sont utilisées pour identifier les protéines recombinantes et déterminer leur pureté. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme les colonnes d’affinité, est que nous pouvons extraire une grande quantité de protéines à un coût relativement faible.

Commencez cette procédure avec toute la conception des ligaments comme décrit dans le protocole textuel. Une fois les oligomères obtenus, utilisez les oligomères d’ADN pour obtenir la séquence génétique souhaitée. Dissoudre d’abord les oligonucléotides d’ADN dans un tampon d’oligonucléotides d’ADN jusqu’à une concentration finale d’un microgramme par microlitre.

Ajoutez quatre microlitres de chaque ligament à 32 microlitres d’ADN et de tampon à genoux pour obtenir un mélange total de 40 microlitres. Faites ensuite bouillir un bécher d’eau à l’aide d’une plaque chauffante et plongez le mélange pendant cinq minutes. À 95 degrés Celsius, retirez le bécher et refroidissez progressivement l’ensemble dans une boîte en polystyrène pendant la nuit, les oligomères sont maintenant à genoux et sont prêts pour la digestion.

Ajouter les enzymes de restriction correspondantes pour digérer séparément les oligomères auxiliaires et les vecteurs hôtes, comme décrit dans le texte Digestion du protocole pendant trois à quatre heures à 37 degrés Celsius. Après avoir exécuté les produits de digestion sur un gel d’agarose et purifié l’ADN, combinez séquentiellement le gène d’intérêt en ligaturant l’insert d’ADN digéré dans le vecteur plasmidique avec T quatre ligase. En utilisant la recette trouvée dans le protocole textuel, incubez le mélange de ligature à température ambiante pendant deux heures.

Ensuite, transformez les cellules à l’aide du choc thermique d’Ali. Citation de 50 microlitres de cellules compétentes dans des micro-tubes à centrifuger propres et pré-réfrigérés. Pipetez cinq microlitres du mélange de ligature dans les cellules, en pipetant doucement de haut en bas pour mélanger.

Laissez le mélange sur de la glace pendant 20 minutes. Plongez ensuite le microtube de centrifugation contenant le mélange cellulaire dans un bain-marie à 42 degrés Celsius pendant deux minutes et remettez-le dans la glace pendant deux minutes. Ajoutez 500 microlitres de fluide SOC dans le tube de la micro-centrifugeuse et incubez à 37 degrés Celsius en secouant pendant une heure.

Après l’incubation, étalez 50 à 500 microlitres du mélange de ligature cellulaire sur une plaque de tarière à deux reprises YT contenant de l’ampicilline qui a été préchauffée à la température ambiante. Incuber les assiettes à l’envers à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, prélevez les colonies d’ADN sur la plaque de la tarière à l’aide d’embouts de pipette propres.

Cultivez les colonies en cinq millilitres de deux fois. Milieu YT contenant de l’ampicilline pendant la nuit à 37 degrés Celsius pendant la nuit avec agitation le lendemain. Utilisez un kit d’isolement de plasmides selon le protocole du fabricant pour extraire les plasmides d’ADN de chaque colonie.

Élué choisi, l’ADN avec 50 microlitres d’eau après transformation du plasmide recombinant en hôte d’expression bactérienne comme décrit dans le protocole de texte. Prélever une colonie sur la plaque de tarière transformée avec une pointe de pipette inoculer. 10 millilitres de bouillon stérile et formidable ou de milieu antituberculeux contenant à la fois de l’ampicilline et du chloramphénicol dans un tube à essai.

Incuber cette culture de démarrage à 37 degrés Celsius pendant la nuit en secouant à 225 tr/min. Transférez ensuite 10 millilitres de la culture de démarrage dans un litre de milieu de tuberculose frais et stérile. Complété par les mêmes antibiotiques dans une fiole Meyer de trois litres.

Incuber la culture à 37 degrés Celsius en secouant à 225 RRP M pendant deux à trois heures. Observez la densité optique de la culture à 600 nanomètres ou OD 600 pour confirmer qu’elle a atteint 0,6 à 0,8 en pipetant un millilitre de culture dans un Q vétérinaire vide pour la lecture. Ensuite, induisez la culture avec IPTG à une concentration finale d’un millimolaire et incubez à 37 degrés Celsius avec agitation à 225 RPM pendant quatre heures supplémentaires.

Récoltez les cellules en transférant la culture dans une centrifugeuse d’un litre, des bouteilles et en centrifugeant à 12 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Après avoir jeté le surnageant, pesez les pastilles de cellules et mettez-les en suspension dans 10 tampons à raison de 0,5 gramme par millilitre. Congelez la culture cellulaire remise en suspension à moins 80 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, décongelez la culture cellulaire congelée dans un bain-marie à température ambiante ou sur de la glace. À L, les cellules ajoutent de la ribonucléase désoxy, une ribonucléase a et du fluorure de phénylméthylsue. Lors de la décongélation de la solution, homogénéisez la solution en agitant lentement.

Une fois que toutes les cellules remises en suspension sont décongelées, ajustez la solution à pH 9,0 pour augmenter la solubilité des protéines dans l’eau avec beaucoup de soin. Ajouter six hydroxyde de sodium N goutte à goutte en agitant sur de la glace pour obtenir une consistance homogène. Ensuite, les cellules sont pouxées par une perturbation ultrasonique pendant 20 minutes sur de la glace, à l’aide d’une pointe plate de deux millimètres de diamètre et d’une impulsion de cinq secondes.

Centrifuger la solution cellulaire à 12 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez le supernat dans une bouteille propre et vide et conservez-le à quatre degrés Celsius pour le purifier plus tard. Pendant ce temps, remettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire avec 10 tampons et économisez 20 microlitres de lysat cellulaire.

Pour la caractérisation de la page FDS, recongelez la pastille cellulaire remise en suspension à moins 80 degrés Celsius pour terminer la lyse cellulaire. Répétez le processus de congélation, de décongélation et de sonication jusqu’à trois fois. Rassemblez le lysat cellulaire antérieur et procédez à la purification des protéines A ECM à l’aide de l’ITC dans lequel les cycles de centrifugation sont effectués à différentes températures dans des conditions de salinité élevée.

Divisez le lysat cellulaire en centrifugeuse de 50 millilitres, en bouteilles et centrifugez à 40 000 G pendant deux heures à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant par pipetage pour obtenir une séparation nette de la pastille. Recueillir le surnageant dans des flacons de centrifugation propres et ajouter du chlorure de sodium à une concentration finale d’une molaire.

Réchauffez la solution à 37 degrés Celsius pendant deux heures en l’agitant à 225 tr/min. Centrifugeuse suivante. Le surnageant à 40 000 G pendant deux heures à 37 degrés Celsius.

Après la décantation, le surnageant écrase le granulé à l’aide d’une spatule métallique et remet les morceaux de granulés en suspension dans de la glace. Eau distillée froide en autoclave avec une agitation vigoureuse pendant la nuit à quatre degrés Celsius à l’aide d’une barre d’agitation magnétique et d’une plaque jusqu’à ce que la pastille soit complètement dissoute. Répétez ces cycles jusqu’à ce que la pastille à 37 degrés Celsius soit blanche, après quoi elle peut être dissoute dans l’eau pendant la nuit et centrifugée.

Pour obtenir la solution protéique, dessalez la solution protéique en la dialysant contre de l’eau distillée à quatre degrés Celsius, en changeant l’eau toutes les quatre heures ou huit heures pendant la nuit pendant deux à trois jours après avoir économisé 20 microlitres de protéine purifiée pour la page SDS Lyophilisez le reste de la protéine purifiée comme indiqué ici. Une bande protéique intense se trouve à la masse moléculaire prédite dans l’échantillon induit. On voit également le gel de page SDS contenant un échantillon de protéine purifiée d’un poids moléculaire de 22 kilodaltons correspondant à la laminine cinq A ECM.

La pureté estimée des protéines A ECM est d’environ 90 à 95 %Cette valeur a été dérivée en comparant les rapports des intensités de bande de la protéine cible et d’autres bandes protéiques présentes sur le gel SDS. Enfin, pour déterminer si la protéine purifiée était bien les protéines A ECM, le Western blot a été effectué ici. La pureté protéique des trois protéines A ECM est montrée à l’aide d’un gel SDS et comparée à une image de la membrane nitrocellulosique pour le western blot.

L’analyse révèle la présence des protéines cibles, le collagène quatre A ECM et le laminé cinq A ECM marqués à l’aide d’anticorps anti-hexa histidine conjugués à la peroxydase de raifort. Les rendements finaux des protéines A ECM variaient entre 60 milligrammes par litre et 120 milligrammes par litre. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de contracter et de purifier les protéines contenant des domaines légers d’élastine pour votre application spécifique.