Name: Les injections intramusculaires le long des plaques motrices de fin: une approche minimalement invasive à la navette Tracers Directement dans motoneurones (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 57 s
Description: Découvrez une technique d'injection intramusculaire le long des plaques motrices pour optimiser le transport rétrograde de traceurs vers les motoneurones spinaux. Cette méthode améliore la visualisation neuronale en neuroanatomie.

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Ce travail a été soutenu par un Centre national de recherche en santé et médecine (NHMRC) subvention de projet à RM

Toutes les procédures expérimentales décrites ici respectées les soins et du Comité d&#39;éthique animale de l&#39;UNSW Australie et ont été effectuées en conformité avec le Medical Research Council de l&#39;Australie règlements pour l&#39;expérimentation animale Santé nationale et du. Toutes les procédures décrites dans ce protocole doivent être effectués en conformité avec l&#39;exigence de la commission de protection des animaux et de l&#39;éthique pertinents. 1. acétylcholinestérase histochimique coloration <ol><li> Préparer le mélange de réaction de l&#39;acétylcholinestérase <ol><li> Ajouter 290 mg de iodure d&#39;acétylthiocholine 200 ml de 0,1 M de tampon de phosphate (PB). Mélanger avec un agitateur magnétique à 900 tours par minute. </li><li> Ajouter 600 mg de glycine sous agitation continue. </li><li> Ajouter lentement 420 mg de sulfate de cuivre au mélange réactionnel sous agitation continue jusqu&#39;à ce que le produit soit complètement dissous. </li></ol></li><li> Retirer la peau sur la carcasse de l&#39;animal (obtenu par le partage de tissu) en faisant des incisionsdans la peau d&#39;un rat ou une souris perfusé, saisir la peau de la région du cou et en la tirant passé ses pieds. Assurez-vous que le fascia couvrant chaque muscle est soit supprimé ou sensiblement perforé pour assurer suffisamment l&#39;exposition des fibres musculaires à la solution de réaction. </li><li> Immerger le corps entier ou d&#39;un membre d&#39;intérêt dans le mélange de réaction et incuber O / N à 4 ° C. </li><li> Laver la carcasse pendant 2 min dans de l&#39;eau distillée. Remarque: A ce stade, les muscles présentent une coloration bleue et les plaques d&#39;extrémité du moteur (MEPs) peuvent être considérés comme des points blancs. </li><li> Exposer la carcasse à une solution à 10% de sulfure d&#39;ammonium à 5/3 sec. Remarque: Les fibres musculaires vont rapidement brunissent et les députés seront observables comme des points noirs tachetés. Si la réaction se produit trop rapidement, et les fibres musculaires sont colorées trop sombre pour distinguer entre les députés européens et les fibres musculaires essayez d&#39;utiliser des concentrations plus faibles de solution de sulfure d&#39;ammonium (par exemple, 5%). Le temps de réaction pour obtenir lecontraste optimal entre les députés européens et les fibres musculaires varie d&#39;un échantillon à l&#39;autre. Il est donc difficile de définir la durée d&#39;exposition exacte de réactif. La réaction doit être étroitement surveillée et arrêtée lorsque le contraste est jugé adéquat. </li><li> Laver la carcasse deux fois, avec une agitation dans de l&#39;eau distillée et tapotez doucement la carcasse sèche. </li><li> Photo à la fois les aspects latéral et médial de la jambe, en assurant que les députés de tous les muscles d&#39;intérêt sont capturées. </li></ol> 2. injections intramusculaires au niveau des plaques motrices de fin <ol><li> Tirez micropipettes de verre avec un extracteur micropipette (l&#39;utilisation de micro-pipettes graduées avec des plongeurs est recommandé). Avec l&#39;aide d&#39;un microscope à dissection, briser les pointes des micropipettes avec une paire de forceps de telle sorte que le diamètre interne de la lumière de la micropipette est d&#39;environ 0,5 mm. </li><li> Veiller à ce que tous les instruments chirurgicaux utilisés sont fraîchement autoclave et eà la zone chirurgicale est stérile. </li><li> Remplissez les micropipettes avec Fluoro-Gold (5% dans de l&#39;eau distillée). </li><li> Induire chez l&#39;animal anesthésier dans une chambre d&#39;induction avec isofluorane (4% O 2). Vérifiez réflexe de redressement et d&#39;assurer son absence avant de le retirer de la chambre d&#39;induction. Fixer un cône de nez sur le museau du rat et de livrer isofluorane (2% en O 2) pour l&#39;entretien de l&#39;anesthésie. Pincez les orteils de l&#39;animal et toucher doucement l&#39;œil de l&#39;animal afin d&#39;assurer que les deux le retrait de la pédale et les réflexes cornéens sont absents. Note: Un mélange de kétamine et xylazil peut également être utilisé (80 et 10 mg / kg, respectivement, livré par voie intrapéritonéale). La kétamine est un annexe 8 (&quot;Contrôle&quot;) médicaments et les protocoles nécessaires liés à l&#39;achat, l&#39;utilisation, le stockage et l&#39;élimination de la drogue devront être respectées. </li><li> Appliquer un lubrifiant oculaire pour éviter le dessèchement des yeux au cours de la procédure. </li><li> Raser les tmembre argeted et l&#39;utilisation de la gaze pour essuyer la zone rasée avec trois gommages alternées de chlorhexidine et 70% d&#39;alcool. Transfert à l&#39;animal de la zone chirurgicale. </li><li> Placez l&#39;animal sur un underpad propre et le positionner de manière appropriée pour assurer un bon accès au muscle (s) ciblé. </li><li> Utilisez une paire de pinces avec des poignées de dents pour soulever la peau sur le muscle ciblé loin de la musculature sous-jacente et faire une incision dans la peau avec des ciseaux chirurgicaux. Assurez-vous que l&#39;incision est suffisamment grande pour exposer complètement le muscle (s) d&#39;intérêt. Assurez-vous qu&#39;il ya une perturbation minimale de l&#39;aponévrose. </li><li> Utilisez les photographies MEP de transposer mentalement l&#39;emplacement et la forme de la région MEP sur le muscle (s). Remarque: Un marqueur de feutre amende pourrait aider à reproduire la région député européen de la photographie sur le muscle (s) d&#39;intérêt. </li><li> Effectuer des injections multiples sur toute la longueur de la région, MdPE (pour Fluoro-Gold, 3 à 4 injections de 1-2 ul chaque sHould être suffisant). Essuyez doucement le muscle (s) pour enlever toute infiltration. </li><li> Apportez les deux extrémités de la peau incisée étroite collaboration avec le forceps émoussé et fermer la plaie avec des pinces chirurgicales. Infiltrez 0,1 ml de bupivacaïne (0,5% dans l&#39;eau) (ou d&#39;autres anesthésiques locaux) sur toute la durée de la plaie. </li><li> Mettez la machine hors d&#39;anesthésie et surveiller l&#39;animal jusqu&#39;à ce qu&#39;il a est complètement remis de l&#39;anesthésie. </li><li> Attendre 14 jours entre l&#39;administration d&#39;injections intra-musculaires et la perfusion des animaux. </li></ol> 3. perfusions <ol><li> Administrer une dose létale de solution de pentobarbital de sodium (par exemple Lethabarb; 150 mg / kg) à l&#39;animal par injection intrapéritonéale. <ol><li> Surveiller de près l&#39;animal jusqu&#39;à un niveau profond de l&#39;anesthésie est atteint, comme l&#39;a confirmé l&#39;absence de retrait de la pédale et les réflexes cornéens. </li></ol></li><li> Placez l&#39;animal sur son dos sur une planche de dissection placé sur un perfusion évier. </li><li> Utilisez une paire de pinces avec des poignées de dents pour soulever la peau recouvrant la base du sternum. Faire une petite incision de la peau avec une paire de ciseaux chirurgicaux fortes immédiatement au-dessous du sternum et ensuite utiliser la pince pour saisir le cartilage xiphoïde du sternum. Tout en maintenant le cartilage xiphoïde, agrandir l&#39;incision des deux côtés de la cage thoracique, à partir du sternum au niveau des aisselles. </li><li> Couper la membrane pour exposer le coeur. <ol><li> Injecter de l&#39;héparine 0.ml directement dans l&#39;apex du coeur pour empêcher la coagulation du sang. </li><li> Couper le sommet pour permettre l&#39;insertion d&#39;une canule dans le ventricule gauche, et serrer ensuite rapidement la canule en place à l&#39;aide d&#39;une pince hémostatique. </li><li> Faire une incision dans l&#39;oreillette droite avec une paire de ciseaux fins et commencer immédiatement la pompe péristaltique. Perfuser avec 0,1 M de PB jusqu&#39;à ce que le liquide qui sort de l&#39;oreillette est pratiquement exempt de sang et la couleur du foie devient brun clair. Ensuite, perfuser avec une solution de paraformaldéhyde (4% dans 0,1 M de PB) jusqu&#39;à ce que l&#39;ensemble du corps de l&#39;animal devient rigide. </li></ol></li></ol> 4. col de l&#39;utérus et de la moelle épinière Dissection Préparation pour l&#39;histologie <ol><li> Poser la carcasse de l&#39;animal sur son abdomen. </li><li> Découper la peau à la ligne médiane du corps avec un scalpel et la réfléchir à partir de la base du crâne au niveau de l&#39;os iliaque. </li><li> Couper à travers et refléter les muscles paravertébraux pour exposer la face dorsale de la colonne vertébrale. </li><li> Identifier l&#39;apophyse épineuse osseuse de l&#39;Atlas, le deuxième segment cervical (c.-à-C2), et retirez-la avec une paire de pinces chirurgicales rongeurs ou de localiser la racine dorsale sous-jacents correspondants. <ol><li> Identifier la racine C2 droit par la coloration avec un feutre permanent. </li><li> Retirer la prochaine vertèbres un par un et marquer les racines dorsales droite avec des couleurs alternées (c.-à-C2, C4, C6, C8 et peut être coloré en vert et C3, C5, C7, T1 peut être colORed en bleu). </li></ol></li><li> Utilisez une petite aiguille chirurgicale (par exemple, 30 G d&#39;aiguille de la jauge) pour doucement percer la dure recouvrant l&#39;extrémité inférieure de la moelle épinière. Avec le biseau de l&#39;aiguille vers le haut, soulever la dure-mère loin de la corde tout en déplaçant l&#39;aiguille rostralement de faire une fente longitudinale. <ol><li> Refléter la dure-mère. </li></ol></li><li> Couper le transversalement de la moelle épinière en blocs d&#39;une ou deux segments avec une nouvelle lame de scalpel. <ol><li> Laissez les segments de la moelle épinière in situ et, pour chaque bloc, faire soigneusement une petite marque de repère sur le côté gauche de chaque bloc avec le mi-chemin de la lame de bistouri entre deux racines adjacentes. Assurez-vous que le repère de référence est assez profond à travers le tissu à être visible de la face ventrale des blocs. Faire le repère de référence à un angle d&#39;environ 45 °, pointant soit avant ou en arrière par rapport à l&#39;anatomie animale, pour aider à l&#39;orientation du segment de tissu suivante dissection. </li></ol></li><li> Recueillir les blocs individuels dans de petites bouteilles, clairement étiquetés contenant une solution de paraformaldéhyde (4% dans 0,1 M de PB) et de laisser à la température ambiante O / N. </li><li> Transférez les blocs dans des bouteilles propres, clairement étiquetés contenant une solution de saccharose (30% dans 0,1 M de PB) et de garder à 4 ° C pendant au moins deux jours. </li><li> Placez les segments en cryo-moules et les couverts avec le milieu de congélation de tissu. Pour la préparation histologique longitudinale, orienter les blocs avec la face dorsale vers le haut et d&#39;utiliser la marque de repère pour orienter le bloc dans les cryo-moules. </li><li> Geler les cryo-moules à -20 ° C et couper avec un cryostat dans 50 sections um d&#39;épaisseur. Remarque: Les sections peuvent être montées directement sur des lames de microscope l&#39;adhérence et à sécher O / N. Alternativement, les sections peuvent être flottaient dans des plaques à 48 puits remplis avec 0,1 M de PB et montés par la suite en utilisant le repère de référence pour orienter les coupes de tissus sur les lames. </li></ol> 5. lombaire Coe Dissection et préparation pour l&#39;histologie <ol><li> Poser la carcasse de l&#39;animal sur son dos. </li><li> Effectuer une incision médiane le long de l&#39;abdomen de l&#39;animal et enlever les viscères. On dissèque les muscles de la paroi abdominale postérieure pour exposer la face ventrale de la colonne vertébrale. </li><li> Localisez la nervure caudale plus court et sa attenant T13 vertèbre où le T13 racine ventrale quitte l&#39;os. <ol><li> Consécutivement retirer un par un l&#39;rostrale deux ou trois vertèbres T13 (c.-à-T12, T11 et, si nécessaire, T10) avec rongeurs chirurgicales fines pour suivre le T13 racine ventrale jusqu&#39;à son point d&#39;entrée dans la face ventrale du cordon ventral et la marquer avec un feutre permanent. </li><li> De ce point, répétez la même procédure pour identifier l&#39;emplacement des points d&#39;entrée des racines ventrales pour L1, L2, L3, L4, L5, L6 et S1, les colorer avec des couleurs alternées. </li></ol></li><li> Suivre la même procédure que celle décrite dans la section 4.5 au 4.10 pour lumbar moelle dissection du cordon. </li></ol>

<ol><li>Kaspar, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+Viral+Delivery+of+IGF-1+Prolongs+Survival+in+a+Mouse+ALS+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Retrograde Viral Delivery of IGF-1 Prolongs Survival in a Mouse ALS Model.</a> Science. 301 (5634), (2003).</li>
<li>Ishiyama, T., Okada, R., Nishibe, H., Mitsumoto, H., Nakayama, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riluzole+slows+the+progression+of+neuromuscular+dysfunction+in+the+wobbler+mouse+motor+neuron+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Riluzole slows the progression of neuromuscular dysfunction in the wobbler mouse motor neuron disease.</a> Brain Res. 1019 (1-2), 226-236 (2004).</li>
<li>Turner, B. J., Parkinson, N. J., Davies, K. E., Talbot, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Survival+motor+neuron+deficiency+enhances+progression+in+an+amyotrophic+lateral+sclerosis+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Survival motor neuron deficiency enhances progression in an amyotrophic lateral sclerosis mouse model.</a> Neurobiol Dis. 34 (3), 511-517 (2009).</li>
<li>Wegorzewska, I., Bell, S., Cairns, N. J., Miller, T. M., Baloh, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TDP-43+mutant+transgenic+mice+develop+features+of+ALS+and+frontotemporal+lobar+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">TDP-43 mutant transgenic mice develop features of ALS and frontotemporal lobar degeneration.</a> P Natl Acad Sci USA. 106 (44), 18809-18814 (2009).</li>
<li>Kimura, E., Li, S., Gregorevic, P., Fall, B. M., Chamberlain, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dystrophin+delivery+to+muscles+of+mdx+mice+using+lentiviral+vectors+leads+to+myogenic+progenitor+targeting+and+stable+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Dystrophin delivery to muscles of mdx mice using lentiviral vectors leads to myogenic progenitor targeting and stable gene expression.</a> Mol Ther. 18 (1), 206-213 (2009).</li>
<li>Van Den Bosch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+rodent+models+of+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Genetic rodent models of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Biomed Biotechnol. 2011 (6), 348765–11(2011).</li>
<li>Pratt, S. J. P., Shah, S. B., Ward, C. W., Inacio, M. P., Stains, J. P., Lovering, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+in+vivo+injury+on+the+neuromuscular+junction+in+healthy+and+dystrophic+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effects of in vivo injury on the neuromuscular junction in healthy and dystrophic muscles.</a> J Physiol. 591 (Pt 2), 559-570 (2013).</li>
<li>Garrett, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DYNC1H1+mutation+alters+transport+kinetics+and+ERK1%2F2-cFos+signalling+in+a+mouse+model+of+distal+spinal+muscular+atrophy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">DYNC1H1 mutation alters transport kinetics and ERK1/2-cFos signalling in a mouse model of distal spinal muscular atrophy).</a> Brain. 137 (Pt 7), 1883-1893 (2014).</li>
<li>Bordet, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+effects+of+cardiotrophin-1+adenoviral+gene+transfer+on+neuromuscular+degeneration+in+transgenic+ALS+mice%29%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Protective effects of cardiotrophin-1 adenoviral gene transfer on neuromuscular degeneration in transgenic ALS mice).</a> Hum Mol Gen. 10 (18), 1925-1933 (2001).</li>
<li>Acsadi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+survival+and+function+of+SOD1+mice+after+glial+cell-derived+neurotrophic+factor+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Increased survival and function of SOD1 mice after glial cell-derived neurotrophic factor gene therapy.</a> Hum Gene Ther. 13 (9), 1047-1059 (2002).</li>
<li>Azzouz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+delivery+with+retrogradely+transported+lentivector+prolongs+survival+in+a+mouse+ALS+model%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">VEGF delivery with retrogradely transported lentivector prolongs survival in a mouse ALS model.</a> Nature. 429 (6990), 413-417 (2004).</li>
<li>Suzuki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+muscle+delivery+of+GDNF+with+human+mesenchymal+stem+cells+improves+motor+neuron+survival+and+function+in+a+rat+model+of+familial+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Direct muscle delivery of GDNF with human mesenchymal stem cells improves motor neuron survival and function in a rat model of familial ALS.</a> Mol Ther. 16 (12), 2002-2010 (2008).</li>
<li>Benkhelifa-Ziyyat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+scAAV9-SMN+Injection+Mediates+Widespread+Gene+Delivery+to+the+Spinal+Cord+and+Decreases+Disease+Severity+in+SMA+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Intramuscular scAAV9-SMN Injection Mediates Widespread Gene Delivery to the Spinal Cord and Decreases Disease Severity in SMA Mice.</a> Mol Ther. 21 (2), 282-290 (2013).</li>
<li>Azzouz, M., Hottinger, A., Paterna, J. C., Zurn, A. D., Aebischer, P., Büeler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+motoneuron+survival+and+improved+neuromuscular+function+in+transgenic+ALS+mice+after+intraspinal+injection+of+an+adeno-associated+virus+encoding+Bcl-2%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Gen%22%5BJournal%5D)">Increased motoneuron survival and improved neuromuscular function in transgenic ALS mice after intraspinal injection of an adeno-associated virus encoding Bcl-2.</a> Hum Mol Gen. 9 (5), (2000).</li>
<li>Lepore, A. C., Haenggeli, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraparenchymal+spinal+cord+delivery+of+adeno-associated+virus+IGF-1+is+protective+in+the+SOD1G93A+model+of+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Intraparenchymal spinal cord delivery of adeno-associated virus IGF-1 is protective in the SOD1G93A model of ALS.</a> Brain Res. 1185, 256-265 (2007).</li>
<li>Schnapp, B. J., Reese, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynein+is+the+motor+for+retrograde+axonal+transport+of+organelles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dynein is the motor for retrograde axonal transport of organelles.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 86 (5), 1548-1552 (1989).</li>
<li>Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Molecular+Motor+Toolbox+for+Intracellular+Transport%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The Molecular Motor Toolbox for Intracellular Transport.</a> Cell. 112 (4), 467-480 (2003).</li>
<li>Schiavo, G., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+biology%3A+Alternative+energy+for+neuronal+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cell biology: Alternative energy for neuronal motors.</a> Nature. 495 (7440), 178-180 (2013).</li>
<li>Gracies, J. -M., Lugassy, M., Weisz, D. J., Vecchio, M., Flanagan, S., Simpson, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Botulinum+Toxin+Dilution+and+Endplate+Targeting+in+Spasticity.+A+Double-Blind+Controlled+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Phys+Med+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Botulinum Toxin Dilution and Endplate Targeting in Spasticity. A Double-Blind Controlled Study.</a> Arch Phys Med Rehabil. 90 (1), 9-16 (2009).</li>
<li>Van Campenhout, A., Molenaers, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+the+motor+endplate+zone+in+human+skeletal+muscles+of+the+lower+limb%3A+anatomical+guidelines+for+injection+with+botulinum+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Med+Child+Neurol%22%5BJournal%5D)">Localization of the motor endplate zone in human skeletal muscles of the lower limb: anatomical guidelines for injection with botulinum toxin.</a> Dev Med Child Neurol. 53 (2), 108-119 (2011).</li>
<li>Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+characterization+of+the+motor+neuron+columns+supplying+the+rat+forelimb%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial characterization of the motor neuron columns supplying the rat forelimb.</a> Neuroscience. 200, 19-30 (2012).</li>
<li>Tosolini, A. P., Mohan, R., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+full+length+of+the+motor+end+plate+regions+in+the+mouse+forelimb+increases+the+uptake+of+fluoro-gold+into+corresponding+spinal+cord+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurol%22%5BJournal%5D)">Targeting the full length of the motor end plate regions in the mouse forelimb increases the uptake of fluoro-gold into corresponding spinal cord motor neurons.</a> Front Neurol. 4, 58(2013).</li>
<li>Mohan, R., Tosolini, A. P., Morris, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+motor+end+plates+in+the+mouse+hindlimb+gives+access+to+a+greater+number+of+spinal+cord+motor+neurons%3A+an+approach+to+maximize+retrograde+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Targeting the motor end plates in the mouse hindlimb gives access to a greater number of spinal cord motor neurons: an approach to maximize retrograde transport.</a> Neuroscience. 274, 318-330 (2014).</li>
<li>Baumgartner, B. J., Shine, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotection+of+spinal+motoneurons+following+targeted+transduction+with+an+adenoviral+vector+carrying+the+gene+for+glial+cell+line-derived+neurotrophic+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Neuroprotection of spinal motoneurons following targeted transduction with an adenoviral vector carrying the gene for glial cell line-derived neurotrophic factor.</a> Exp Neurol. 153 (1), 102-112 (1998).</li>
<li>Gransee, H. M., Zhan, W. -Z., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+delivery+of+TrkB+receptor+to+phrenic+motoneurons+enhances+functional+recovery+of+rhythmic+phrenic+activity+after+cervical+spinal+hemisection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Targeted delivery of TrkB receptor to phrenic motoneurons enhances functional recovery of rhythmic phrenic activity after cervical spinal hemisection.</a> PLoS ONE. 8 (5), e64755(2013).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Ciblage intramusculaire et le transfert rétrograde ultérieure de transgènes thérapeutiques pour les motoneurones α correspondant pour le traitement expérimental de l&#39;état neuromusculaire est pas une nouvelle stratégie. Par exemple, ce mode de livraison a été utilisée pour retarder la dégénérescence neuromusculaire à différents stades de la progression de la SLA chez les souris et les rats SOD1 1,9-12 ainsi que chez les souris avec 13 SMA. Bien que prometteur, l&#39;efficacité de ces scénarios d...

La perte de contrôle du mouvement volontaire qui résulte de troubles neurologiques comme la maladie du motoneurone et spinal- ainsi que l&#39;atrophie musculaire de Duchenne est une maladie débilitante qui a un impact élevée et durable sur la vie quotidienne des personnes touchées. Au cours de la dernière décennie, les efforts de recherche visant à arrêter ou au moins retarder les effets délétères de ces maladies neuromusculaires a été une priorité pour de nombreux cliniciens et les scientifiques du monde entier. À cet égard, la dernière génération de modèles animaux qui imitent ces maladies neuromusculaires a joué un rôle dans l&#39;obtention de connaissances fondamentales sur les mécanismes physiologiques qui sous-tendent le développement et la progression de ces conditions de 1 à 13. Le traitement de ces maladies neuromusculaires exige un accès direct à la moelle épinière et peut être obtenu par des injections de la moelle épinière 14,15. Les progrès récents dans la thérapie génique ont également ciblé les muscles striés de la partie supérieure etmembres inférieurs à gènes thérapeutiques de navette vers les motoneurones α correspondants qui sont situés dans la corne ventrale de la moelle épinière 1,9-13. Cependant, cette stratégie une fois prometteuse n&#39;a pas réussi à améliorer le résultat de ces conditions neurologiques. Alors qu&#39;il est juste de conclure que ces piètres résultats pourraient être, au moins en partie, être attribuable à la faible efficacité de ces gènes protecteurs, on ne peut exclure la faible efficacité de ces méthodes de transfert de gènes. plaques d&#39;extrémité du moteur (MEPs) sont des régions spécialisées des fibres musculaires squelettiques qui sont en retrait par les terminaisons axonales des grandes fibres motrices périphériques provenant α neurones moteurs. Ensemble, les terminaisons de fibres nerveuses périphériques et les députés forment la jonction neuromusculaire, à savoir, le site où l&#39;influx synaptique sont déclenchées par la libération du neurotransmetteur antérograde, l&#39;acétylcholine. Surtout, la relation entre les fibres nerveuses périphériques et les députés est bi-directional, bien que différents moteurs sont responsables pour le transport des molécules et des organites vers ainsi que l&#39;écart du neurone Somata 16-18. À la lumière de ces considérations anatomiques, les députés semblent être des cibles de choix pour la livraison et le transport rétrograde ultérieure de matériel génétique pour les neurones moteurs correspondants. Dans ce contexte, il est peu surprenant que le succès de neurone moteur transduction dépend fortement de la distance entre l&#39;injection intramusculaire de vecteurs viraux et les députés de la musculaires 19-20. Curieusement, cependant, l&#39;emplacement exact des zones de MEP sur les fibres musculaires du rat de laboratoire et de la souris, les deux espèces de choix pour modéliser les maladies neuromusculaires, ne étaient pas disponibles jusqu&#39;à récemment. Nous avons produit des cartes détaillées de la région MEP pour plusieurs muscles des membres antérieurs chez le rat et la souris 21-22. Plus récemment, nous avons montré les détails de l&#39;organisation de la MEP région pour plusieurs muscles de la patte arrière de la souris 23 et nous sommes en train d&#39;analyser les caractéristiques des députés de la patte arrière de rat. Dans nos mains, des injections intramusculaires de traceurs rétrogrades dirigés vers les zones MEP entières dans ces muscles ont donné lieu à des neurones moteurs plus marqués qui sont Spanning segments de la moelle épinière plus que rapporté précédemment. Ici, nous présentons le protocole qui a été développé au cours des dernières années pour révéler l&#39;emplacement des députés sur la surface externe ainsi que toute la profondeur de la patte arrière et patte avant muscles de la souris et le rat.

<table><tbody><tr><td>Fluorochrome</td><td>fluoro-or, LLC</td><td>Aucun</td><td>dilué à 5 %</td></tr><tr><td>Micropipets PCR Drummond 1-10 & micro ; l</td><td>Drummond Scientific</td><td>5-000-1001-X10</td><td>accompagné de pistons</td></tr><tr><td>Acétylthiocholine Iodure</td><td>Sigma Life Science</td><td>A5751-25G</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de cuivre(II) Anhydre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61230-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T Compound</td><td>Sakura Finetek</td><td>25608-930</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Ajax Finechem</td><td>1083-500G</td><td></td></tr><tr><td>Dextran, tétraméthylrhodamine et biotine</td><td>Life Technologies</td><td>D-3312</td><td>Diliuté dans de l’eau distillée</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Provet</td><td>ISOF00</td><td>1000 mg/g Isoflurane inhalation vapeur</td></tr><tr><td>Autoclip 9 mm Wound Clips</td><td>Texas Scientific Instruments, LLC</td><td>205016</td><td></td></tr><tr><td>Lethabarb Enthanasia Injection</td><td>Virbac (Australia) Pty Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LETHA450 Solution de formaldéhyde</td><td>Ajax Finechem</td><td>A809-2.5L PL</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus lames de verre</td><td>Menzel-Glaser</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Sulfure d’ammonium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1952</td><td>Dilué à 10</td></tr><tr><td> %Marcain Spinal 0,5 % (chlorhydrate de bupivacaïne)</td><td>Astrazenca</td><td></td><td>Dilué à 0,25 %</td></tr></tbody></table>

les injections intramusculaires le long des plaques motrices de fin: une approche minimalement invasive à la navette tracers directement dans motoneurones

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Les maladies affectant l&#39;intégrité des neurones moteurs de la moelle épinière sont parmi les troubles neurologiques les plus débilitantes. Au cours des dernières décennies, le développement de plusieurs modèles animaux de ces maladies neuromusculaires a fourni à la communauté scientifique avec différents scénarios thérapeutiques visant à retarder ou inverser la progression de ces conditions. En tirant parti de la machinerie rétrograde de neurones, une de ces approches a été de cibler les muscles squelettiques afin de gènes thérapeutiques de la navette dans les neurones moteurs de la moelle épinière correspondant. Même si une fois prometteur, le succès de l&#39;approche de livraison tels génique a été entravée par le nombre de sous-optimale des neurones moteurs transduites il a montré jusqu&#39;ici de céder. plaques d&#39;extrémité du moteur (MEPs) sont des régions très spécialisées sur les muscles squelettiques qui sont en contact synaptique direct à la moelle épinière α neurones moteurs. À cet égard, il est important de noter que, jusqu&#39;à présent, les efforts de manière rétrogradetransférer des gènes dans les neurones moteurs ont été faites sans référence à l&#39;emplacement de la région MEP dans les muscles ciblés. Ici, nous décrivons un protocole simple 1) pour révéler l&#39;emplacement exact des députés sur la surface des muscles squelettiques et 2) d&#39;utiliser cette information pour guider la prestation intramusculaire et transport rétrograde optimale ultérieure des traceurs rétrogrades dans les neurones moteurs. Nous espérons que d&#39;utiliser les résultats de ces expériences de traçage dans d&#39;autres études dans l&#39;enquête sur le transport rétrograde de gènes thérapeutiques aux neurones moteurs de la moelle épinière à travers le ciblage des députés.

Acetylcholinesterase coloration histochimique révèle l&#39;emplacement des plaques d&#39;extrémité du moteur sur toute la largeur des muscles. La figure 1 illustre les résultats d&#39;une telle coloration effectuée sur un ensemble des membres antérieurs du rat. Il est recommandé d&#39;optimiser la concentration de la solution de sulfure d&#39;ammonium (par ex., De 5 à 7% au lieu de 10%) ainsi que le moment où le spécimen est immergé dans la solution si la coloration de fond non-spécifique sur l...

L’efficacité de l’absorption intramusculaire et du transport rétrograde des molécules vers les motoneurones correspondants dépend de l’emplacement des sites d’injection par rapport aux plaques d’extrémité motrices (MEP). Ici, nous décrivons comment localiser les MEP sur les muscles squelettiques afin d’optimiser le transport rétrograde des traceurs dans les motoneurones.

Les injections intramusculaires le long des plaques motrices de fin: une approche minimalement invasive à la navette Tracers Directement dans motoneurones

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'augmenter l'efficacité du transport rétrograde des traceurs neuroanatomiques vers les motoneurones de la moelle épinière après une injection intramusculaire. Cela est réalisé en déclenchant une réaction histochimique de l'acétylcholinestérase dans un tissu d'intérêt simulé afin d'identifier l'emplacement des plaques motrices terminales sur la musculature de l'animal. Dans une deuxième étape, des injections intramusculaires du traceur rétrograde sont effectuées sur toute l'étendue de la région des plaques motrices terminales.Sur les muscles d'intérêt, les animaux sont ensuite maintenus pendant 14 jours afin de permettre le transport du traceur vers la moelle épinière. Les motoneurones ciblant finalement toute la longueur de la région de la plaque motrice produisent un nombre plus élevé de motoneurones marqués qui s'étendent sur plusieurs segments de la moelle épinière du rongeur lorsqu'ils sont visualisés par microscopie à fluorescence. Les implications de cette étude s'étendent à la mise au point de thérapies contre les dysfonctionnements neuromusculaires, notamment la lésion de la moelle épinière et la sclérose latérale amyotrophiq

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Dans cet article, nous montrons une méthode pour faire des aiguilles capillaires en verre avec une lumière de 50 um. Cette technique réduit considérablement les dommages au cerveau, minimise la diffusion passive des médicaments et permet un ciblage précis dans le cerveau des rongeurs.

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La transplantation précurseurs neuraux est une stratégie prometteuse pour protéger et / ou le remplacement perdu / dysfonctionnel cervicale neurones moteurs phrénique des blessures de la moelle épinière (SCI) et les neurones moteurs désordre, la sclérose amyotrophique latérales (SLA). Nous fournissons un protocole pour la livraison de cellule à la corne moelle épinière cervicale ventrale dans des modèles rongeurs de la SLA et la SCI.

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Nous fournissons un guide pratique pour la prestation des...

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Source : Mohan, R.,  Injections intramusculaires le long des plaques d’extrémité motrices : une approche mini-invasive pour faire circuler les traceurs directement dans les motoneurones. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo démontre l’administration ciblée d’un traceur neuronal fluorescent dans les motoneurones par injection intramusculaire au niveau des plaques d’extrémité motrice (MEP). Il décrit les étapes de la préparation du rat, de l’injection du traceur et de l’évaluation du potentiel...

Injections intramusculaires le long des plaques d’extrémité motrices pour faire circuler les traceurs directement dans les motoneurones du rat

Le traçage transsynaptique est devenu un outil puissant pour analyser les efférences centrales régulant les cibles périphériques par le biais de circuits multi-synaptiques. Nous présentons ici un protocole qui exploite le virus de la pseudorage transsynaptique pour identifier et localiser un circuit cérébral fonctionnel, suivi de techniques classiques de traçage de tractus pour valider des connexions spécifiques dans le circuit entre des groupes de neurones identifiés.

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Ce protocole montre l’injection d’un vecteur viral marqués transportable dans les tissus de la moelle épinière de rat. Le vecteur est absorbé au niveau de la synapse et transporté vers le corps cellulaire des neurones de la cible. Ce modèle convient pour un traçage rétrograde des voies importantes de la colonne vertébrale ou ciblage des cellules pour des applications de la thérapie génique.

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Cet article détaille les méthodes d’administration intrathécalienne pour les traitements ciblant le SNC chez les souris adultes, en mettant l’accent sur la précision des protocoles et la possibilité d’injections répétées. Il inclut les résultats d’une étude de validation où les oligonucléotides antisens ont réduit l’expression mutante de SOD1 chez des souris modèles SOD1-SLA, soutenant l’utilité de cette approche dans la recherche préclinique sur les maladies neurodégénératives.

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Découvrez une technique d'injection intramusculaire le long des plaques motrices pour optimiser le transport rétrograde de traceurs vers les motoneurones spinaux. Cette méthode améliore la visualisation neuronale en neuroanatomie.

Les injections intramusculaires le long des plaques motrices de fin: une approche minimalement invasive à la navette Tracers Directement dans motoneurones (Vidéo) | JoVE Journal

Les injections intramusculaires le long des plaques motrices de fin: une approche minimalement invasive à la navette Tracers Directement dans motoneurones

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