Génération et multi-phénotypique criblage à haut contenu de Coxiella burnetii Mutants de transposon

L’objectif global de cette procédure est d’identifier à grande échelle. Les facteurs COE impliqués dans les étapes clés du cycle infectieux, y compris l’entrée dans les cellules hôtes, la génération d’une niche réplicative bactérienne et la persistance. Ceci est accompli en générant d’abord une banque de comutants GF PT par transposition sur la mutagénèse.

Ensuite, les cellules hôtes sont infectées par chaque mutant isolé. Ensuite, la réplication intracellulaire de chaque mutant est suivie en temps réel à l’aide d’un lecteur de microplaques afin d’identifier les mutations les plus préjudiciables à l’infection par Coxiella. Enfin, les cellules infectées par la coxiella sont analysées par microscopie automatisée.

En fin de compte, l’analyse automatisée des images permet la caractérisation morphologique de chaque phénotype obtenu pour associer chaque gène muté à une fonction présumée dans le cycle infectieux de la coxielle. Cette méthode peut aider à résoudre des problèmes clés dans le domaine des interactions hôte-pathogène, tels que l’identification à grande échelle des gènes essentiels d’un agent pathogène donné nécessaires pour interagir avec l’ensemble de la cellule et détourner ses machineries moléculaires à son profit. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car l’ensemencement et l’isolement des colonies de COE sont difficiles à réaliser.

En effet, le COE forme de très petites colonies qui doivent être soigneusement extraites de deux aro d’ACCM mous. Comment cette méthode peut donner un aperçu de l’infection de laboratoire coccique. Il peut également être appliqué à d’autres bactéries pathogènes intracellulaires telles que la salmonelle, le burel, les mycobactéries, etc.

Après avoir transformé la coxiella compétente avec des plasmides de revêtement de transposon et de transposase selon le protocole de texte, pour isoler les mutants individuels, préparez des aros de fond en mélangeant 10 millilitres de 0,5 % aros fondus avec 10 millilitres de deux X accm, deux dans une armoire de sécurité microbienne ou MSC et ajoutez les antibiotiques appropriés versez immédiatement dans une boîte de Pétri et laissez-le refroidir à découvert pendant 30 minutes, puis séchez à l’air libre pendant 20 minutes. Pour préparer des aros de sac supérieur, mélangez 1,25 millilitres de deux x accm deux avec 0,75 millilitres d’eau dans un tube de polystyrène de 15 millilitres. Ajoutez les antibiotiques appropriés et incubez à 37 degrés Celsius.

Ajoutez ensuite un à 100 microlitres de culture bactérienne et vortex pendant cinq secondes. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de mélange d’aros fondu et versez immédiatement sur les aros du bas. Laissez refroidir la plaque pendant 20 minutes.

Placez le couvercle sur le dessus et incubez à quatre degrés Celsius pendant 20 minutes pour aider à solidifier. Retirez ensuite le couvercle et faites sécher la plaque à l’air libre pendant 20 minutes avant de la transférer dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone et 2,5 % d’oxygène pendant six à sept jours. Une fois que les colonies sont détectables, collectez-les en coupant l’extrémité d’une pointe de pipette d’un millilitre et en l’utilisant pour isoler les bouchons contenant des colonies uniques.

Ensuite, ils sont transférés dans les puits d’une plaque de 24 puits contenant 1,5 millilitres d’accm deux. Après avoir préparé une courbe standard, selon le protocole de texte, quantifiez chaque suspension bactérienne en distribuant cinq microlitres de 10 % Triton X 100 par puits. Dans une microplaque de 96 puits avec des parois et un fond noirs, ajoutez 50 microlitres de suspensions bactériennes dans chaque puits et incubez sur une plaque agitée pendant 10 minutes.

À température ambiante, utilisez un tampon XTE pour diluer le réactif de quantification de l’ADN double brin un à 200, et ajoutez 55 microlitres du réactif dilué à chaque échantillon. Dans la microplaque de 96 puits avec un agitateur de plaque bien mélangée avant d’incuber dans l’obscurité à température ambiante pendant deux à cinq minutes, mesurez la fluorescence des échantillons à l’aide d’un lecteur de microplaques à fluorescence et de filtres pour les longueurs d’onde de fluorescéine standard. Pour obtenir le graphique de concentration d’ADN bactérien, les lectures de fluorescence dans la courbe standard précédemment préparée, divisez la concentration d’ADN par la masse du génome de la coxiella pour obtenir la concentration bactérienne.

Exprimer les résultats en équivalents génomiques par millilitre après avoir effectué la PCR de colonie d’amorce unique et le séquençage de l’ADN selon le protocole de texte. À l’aide d’un logiciel d’analyse de séquence, chargez le génome annoté complet de Coxiella Burnett I 4 93 NM one avec la fonction d’alignement sur la référence, chargez et alignez les résultats de la séquence à l’aide de blast N et déterminez le site de transposition. Après avoir préparé une suspension de cellules Vero de 10 à cinq cellules par millilitre dans un milieu RPMI, selon le protocole de texte, distribuez 100 microlitres de la suspension dans chaque puits d’une plaque noire à 96 puits avec un fond plat et transparent, centrifugez la plaque à 400 fois G et espace pendant cinq minutes et incubez à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant la nuit.

Le lendemain, tombez à température ambiante 96 plaques de puits contenant les mutants de coxiella et diluez 150 microlitres de suspensions bactériennes dans 300 microlitres de RPMI sans rouge de phénol et FBS dans une plaque de puits profond de 96 puits ensuite, retirez le milieu des cellules Vero et distribuez 100 microlitres par puits de mutants de coxiella dilués. Utilisez le puits A un comme contrôle négatif et les puits A deux et trois comme contrôles positifs à l’aide d’un support de plaque de centrifugeuse étanche aux aérosols, centrifugez la plaque à 400 fois G et à température ambiante pendant 10 minutes. Ensuite, après avoir incubé la plaque à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée de 5 % de dioxyde de carbone pendant deux heures, remplacez le milieu contenant des bactéries par 100 microlitres par puits de milieu RPMI complet frais par un lecteur de microplaques à fluorescence et des filtres pour la fluorescéine.

Mesurez la fluorescence GFP tous les jours pendant sept jours Le septième jour après l’infection, retirez le milieu de la plaque et remplacez-le par 50 microlitres par puits de milieu complet frais contenant une dilution de un à 1000 de colorant fluorescent perméable aux cellules. Incuber les cellules pendant 30 à 60 minutes après l’incubation, remplacer le milieu par 50 microlitres par puits de 4 % de PFA dans le PBS incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Retirez ensuite le tampon contenant du PFA avant d’utiliser le PBS pour laver les puits trois fois Après avoir retiré le lavage final, versez 50 microlitres de solution de blocage dans chaque puits et incubez à température ambiante pendant 30 minutes.

Remplacez ensuite la solution de blocage par 40 microlitres par puits, une solution de blocage fraîche et une dilution de un à 500 d’anticorps anti-lampe. Après l’incubation à température ambiante pendant 30 minutes, retirez la solution et utilisez un laveur de plaques pour laver les puits cinq fois en appliquant 100 microlitres par puits de PBS. Ajoutez ensuite 40 microlitres par puits de solution de blocage contenant l’anticorps secondaire fluorescent approprié et accroché 3 3 2 5 8 à cinq microgrammes par millilitre.

Incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Lavez les échantillons cinq fois et laissez le dernier lavage PBS dans les puits pour les empêcher de se dessécher. Pour effectuer l’acquisition d’images, utilisez un microscope automatisé à épifluorescence équipé d’un objectif 20 x et de 3 4 88 5 55 et de six canaux de 15 nanomètres.

Acquérir 21 champs indépendants par puits afin d’imager un minimum de 5 000 cellules par échantillon. Appliquez la mise au point automatique en utilisant le canal des noyaux de la cellule hôte comme référence. Enfin, utilisez l’analyse d’image automatisée pour extrapoler un certain nombre de caractéristiques pertinentes à partir des images acquises.

Cette figure illustre 38 transposées sur les mutants en 16 points ICM Coxe L à Gènes et les courbes de croissance qui évaluent la viabilité des mutants sont montrées ici. Ici. Les courbes de croissance intracellulaires des mutants de coxiella incubés avec des cellules épithéliales fournissent une analyse quantitative des phénotypes associés aux insertions de transposition dans le génome de la coxiella. Dans cette figure, l’acquisition automatisée d’images a été effectuée pour identifier et caractériser les noyaux des cellules hôtes, les contours cellulaires, les lysosomes et les colonies de coxiella.

La corrélation des colonies de coxiella avec les cellules et les lysosomes permet l’analyse morphologique des vacuoles contenant des coxiella. La corrélation des colonies de coxiella avec les contours des cellules hôtes permet l’analyse morphologique des cellules infectées. Enfin, les quatre canaux sont fusionnés.

La surface moyenne des colonies de coxiella est tracée en fonction du nombre de colonies par cellule afin d’identifier les mutations qui affectent la réplication intracellulaire de coxiella et/ou la capacité des bactéries à envahir les cellules hôtes. Des mutants ont été observés dans trois groupes de mutations qui ont affecté la croissance intracellulaire de coxiella, l’internalisation de la coxiella dans les cellules et des phénotypes non significatifs. Ici, la surface moyenne des colonies de coxiella est tracée en fonction du nombre de cellules hôtes survivant à l’infection afin d’identifier les mutations qui confèrent une cytotoxicité à coxiella après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des infections bactériennes pour explorer les interactions hôte-pathogène à grande échelle, et a identifié l’hôte et les cibles bactériennes pour le développement de nouvelles thérapies pour contrer les maladies infectieuses.