Name: Simultané Ex vivo Tests fonctionnels de deux rétines par In vivo Système Électrorétinogramme (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Découvrez l'électrorétinogramme ex vivo pour analyser la fonction des cellules rétiniennes isolées de souris. Cette méthode permet d'étudier les voies de signalisation des bâtonnets et des cônes avec une excellente stabilité.

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Ce travail a été soutenu par le NIH subventions EY019312 et EY021126 (VJK), EY002687 au Département d&#39;ophtalmologie et des sciences visuelles à l&#39;Université de Washington, et par la recherche pour prévenir la cécité.

Tous les protocoles expérimentaux étaient en conformité avec le Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire et ont été approuvés par le Comité institutionnel Animal Studies à l&#39;Université de Washington. 1. Configuration de perfusion et porte-échantillon <ol><li> Préparer la solution pour perfusion rétine frais sur le jour de l&#39;expérience. Utilisez de l&#39;eau distillée et déminéralisée. Utilisez l&#39;une des trois solutions suivantes. <ol><li> Préparez-contenant Bicarbonate de la solution (1 L): 1 bouteille de Ames Ames des médias et de 1,9 g de NaHCO 3, </li><li> Préparer la solution de Locke (en mM): 112,5 NaCl, 3,6 KCl, 2,4 MgCl2, 1,2 CaCl2, 10,0 HEPES, 20,0 NaHCO 3, 3,0 Na succinate, 0,5 Na glutamate, 0,02 EDTA, et 10,0 glucose, 0,1% de vitamines MEM et amino acides </li><li> Préparer une solution de Ringer tamponnée par HEPES (en mM): NaCl 133,3, KCl 3,3, MgCl 2 2,0, CaCl 2 1,0, 10,0 glucose, 0,01 EDTA, 12,0 HEPES, pHajusté à 7,5 avec de ~ 5,8 ml de NaOH 1 M, ajouter 0,72 g / L du milieu de culture Leibovitz L-15. Utilisez 20-50 uM DL-AP4 et 50 - 100 uM BaCl 2 pour isoler la réponse du photorécepteur avec tout support de perfusion. </li></ol></li><li> Préparer la solution pour les électrodes 28 (en mM): NaCl 140,0, KCl 3,6, MgCl 2 2,4, CaCl 2 1,2, 3, HEPES 0,01 EDTA et ajuster le pH à 7/4 à 7/5 avec du NaOH. Electrode de solution peut être stockée à température ambiante pendant plusieurs mois. </li><li> Préparer et tester le porte-échantillon. <ol><li> Collez papier filtre noir / gris sur le dessus des dômes de la partie inférieure du porte-échantillon (voir la figure 1A). Étaler à deux composants 5 min de la colle époxy soigneusement autour des bords des sommets plats des dômes. Si nécessaire, le faire en vertu de la dissection microscope. </li><li> Attendez jusqu&#39;à ce que la colle est presque à sec (environ 4 min) et appuyez sur le papier filtre sur les dômes en utilisant un objet plat. Colle de papier filtre, au moins un jour avant l&#39;expérience. Lepapier filtre peut être utilisé plusieurs fois, mais doit être remplacé après un mois d&#39;enregistrements. Utilisez 70% d&#39;éthanol pour nettoyer soigneusement dômes de tout résidu de colle avant d&#39;installer le papier de remplacement. </li><li> Remplissez les canaux d&#39;électrode avec une solution d&#39;électrode en essayant d&#39;éviter les bulles d&#39;air et vissez électrodes de pellets clos avec un adaptateur fileté dans les canaux d&#39;électrodes (voir les figures 1A et B). Connecter les pièces supérieure et inférieure du porte-échantillon avec quatre vis et remplir les lignes de perfusion avec une solution de l&#39;électrode. </li><li> Mesure de la résistance et de la tension entre les conducteurs de chaque paire d&#39;électrodes à l&#39;aide d&#39;un multimètre (figure 1B). La résistance doit être inférieure à 100 #k et la tension en dessous de 10 mV si les canaux sont sans bulles et les électrodes sont dans de bonnes conditions. </li></ol></li><li> Verser 400 à 700 ml de milieu de perfusion dans la bouteille en verre. Encore 300 ml séparée à utiliser dans la dissection des rétines et sdéchira dans un réfrigérateur. Réglez la tubulure de perfusion dans le bloc de l&#39;échangeur de chaleur et placez le bloc préchauffé sur la plaque de chauffage (voir figure 1D). </li><li> Joindre la bouteille avec un bouchon qui a des connexions de CO 2 / O 2 gazeux (si Ames »ou Locke est utilisé) et pour tubulure de perfusion (voir figure 1D). Préchauffer la bouteille avec les médias à 37 o C et le placer sur la plaque chauffante ou sur le dessus de l&#39;unité de stimulation lumineuse dans un bain d&#39;eau réglé à 37-39 o C 17. <ol><li> Premier Les lignes de perfusion par remplissage des médias de perfusion pour initier l&#39;écoulement par gravité. <ol><li> Dans le système LKC, placer la bouteille sur le dessus de l&#39;unité de stimulateur 17 pour fournir un écoulement gravitationnel significatif qui est ensuite ajustée par les régulateurs de débit sans être affectée par le niveau d&#39;abaissement de la solution de perfusion dans le flacon pendant l&#39;expérience. </li><li> Dans le système Ocuscience, placez le pbouteille de erfusion l&#39;intérieur de la cage de Faraday afin de minimiser le bruit et les placer à long perfusion lignes de sortie de la porte-échantillon (voir l&#39;étape 2.8) bien en dessous du niveau du support de spécimen (et une bouteille de perfusion) pour augmenter entraînement gravitationnelle de la solution. Protégez ces lignes de sortie et connecter le blindage à la terre de l&#39;amplificateur pour éviter le couplage du bruit électromagnétique au signal ERG. </li></ol></li></ol></li><li> Ajustez la perfusion de 3 - 5 ml / min en utilisant les régulateurs de débit. Connectez 5% de CO 2/95% O 2 du gaz d&#39;un cylindre avec régulateur approprié et ajuster le débit pour assurer bouillonnement constant des médias dans la bouteille par une pierre à air. </li></ol> Préparation de l&#39;échantillon 2. <ol><li> Assemblez instruments de dissection propres et nettes, y compris microciseaux lame droite, un ou deux 45 o pince à épiler, une lame de rasoir et une pièce rectangulaire de papier filtre. </li><li> Pour environ 200 ml de froid perfusion de solution dans une grande boîte de Petri de sorte que toute la partie inférieure du porte-échantillon (y compris les dômes) peut être immergé dans la solution. Cette étape devient important lors du montage des rétines sur les dômes (voir l&#39;étape 2.6). Bien que certaines solutions sont conçues pour être saturée avec du carbogène (5% de CO2 / 95% d&#39;O 2), ce ne soit pas essentiel aux fins de dissection et n&#39;a pas été fait dans les expériences décrites ici. </li><li> Pour une expérience typique, garder les animaux dans les 12/12 heures cycle d&#39;obscurité / lumière et l&#39;obscurité, de les adapter pour les 6 - 12 heures avant les enregistrements. Euthanasier l&#39;animal par inhalation de CO 2 suivie par dislocation cervicale sous faible lumière rouge et de faire toutes les procédures suivantes sous la lumière rouge ou IR dim (utiliser par exemple, filtre rouge en face de la source de lumière du microscope). <ol><li> Tirez les yeux en utilisant une pince à épiler et les mettre dans les médias. Placez un œil à la fois sur un petit morceau de papier (par exemple, du papier régulier du filtre) et de faire enallumé environ sur le niveau de ora serrata tout en maintenant l&#39;œil avec des pincettes (cela se fait en dehors de la solution ici). </li></ol></li><li> Coupez le long de l&#39;ora serrata (ou plus près de l&#39;équateur de l&#39;œil) avec microciseaux et retirez la cornée et le cristallin. Placez la tasse d&#39;oeil dans les médias froid dans la grande boîte de Pétri et répétez la même procédure avec l&#39;autre œil. </li><li> Couper une petite incision du haut de l&#39;œilleton vers le nerf optique en gardant les ciseaux entre la rétine et la sclérotique afin de garder la rétine aussi intact que possible. Tenue de la sclère des deux côtés de l&#39;incision à l&#39;aide de deux pinces à épiler et tirer la pince à une distance l&#39;une de l&#39;autre pour détacher la rétine. <ol><li> Couper le nerf optique et essayer d&#39;isoler la rétine avec un montant minimum de contact physique à la surface distale. RPE sera principalement détacher automatiquement à partir de la rétine au cours du processus de dissection. Il est plus important d&#39;éviter la perturbation mécanique de la rétine que pour effectuer ladissection rapidement, généralement rétines peut être incubée au moins 30 min dans la solution sans effets significatifs sur les propriétés de réponse. </li></ol></li><li> Monter les rétines sur les dômes de support de l&#39;échantillon (figure 1C). Immerger la partie inférieure du porte-échantillon dans la boîte de Pétri avec les rétines disséqués. Faites glisser la rétine, côté photorécepteur (la surface convexe de la rétine isolée) vers le haut, au-dessus du dôme et soulever le porte-échantillon de telle sorte que la rétine se fixe sur le papier filtre. Répétez la procédure pour l&#39;autre rétine. </li><li> Séchez soigneusement la plaque de support pour empêcher la diaphonie électrique entre les rétines ainsi que le bruit et le signal manœuvre. Porte-échantillons a joints toriques autour des dômes de partie inférieure pour empêcher solution déversement entre la parties inférieure et supérieure du titulaire ainsi que pour aider à l&#39;isolation électrique des photorécepteurs et des cellules ganglionnaires de la rétine côtés individuels. Fixez la partie supérieure de la porte avec les quatre vis (voir la figure 1B) et remplir les canaux de perfusion avec une solution de perfusion en utilisant une seringue et une aiguille. </li><li> Transférer le porte-échantillon à côté du bloc de l&#39;échangeur de chaleur et de connecter les entrée et sortie perfusion lignes au support de spécimen (figure 1D). Raccorder les électrodes à l&#39;amplificateur ERG (électrodes supérieures relient à la terre / moins broche dans l&#39;amplificateur) et fixer l&#39;unité stimulateur / contrôle sur le porte-échantillon en utilisant un adaptateur ou faites glisser le coussin chauffant dans l&#39;unité de stimulateur selon le in vivo ERG système est utilisé. </li></ol> 3. Enregistrements <ol><li> Configurer les paramètres de l&#39;amplificateur et de relance en utilisant le logiciel du système in vivo. Réglez la fréquence d&#39;acquisition d&#39;une valeur comprise entre 1 et 10 kHz et filtrage passe-bas à 300 Hz. Ne pas utiliser le filtrage passe-haut. Utilisez 60 Hz (ou 50 Hz en Europe) Notch Filter si nécessaire. </li><li> Fiche de référence sans la stimulation lumineuse et d&#39;esprith stimulation dim (ex., le feu vert de -35 dB ou 0,3 mCd sm -2) pour tester bonne connexion électrique entre les électrodes et l&#39;échantillon rétine. Attendez de 10 - 20 min avant de commencer la collecte de données de telle sorte que la température et la fonction rétinienne atteignent un état stable. <ol><li> Choisissez les paramètres de stimulation selon l&#39;une expérience spécifique et commencer la collecte des données. Par exemple, utiliser le feu vert de -40 à 0 dB ou de 0,1 à 1,000 mCd sm -2 pour une famille de réponse scotopique. Utilisez environ 2 à 3 log-unités lumineux clignote en enregistrements photopiques où tiges doivent être réprimées par la lumière de fond (3-30 Cdm -2) ou un flash de la sonde (environ 1,3 Cd sm -2 = 1 dB, voir Figure 3). </li><li> Cependant, rappelez-vous que les valeurs d&#39;intensité lumineuse exactes pourraient être quelque peu dépendant de votre étalonnage du système et les conditions expérimentales. En règle générale, les intensités d&#39;échelle en baisse de 5 à 10 fois par rapport à in vivo </em&gt; enregistrements lors de l&#39;utilisation de lumière verte 17. Une housse noire avec des ouvertures au-dessus des rétines (inclus dans le système d&#39;adaptateur commerciale) peut être utilisé pour réduire la dispersion de la lumière dans le support d&#39;échantillon et de faciliter la stimulation homogène et égale des deux rétines par la sphère de la publicité in vivo systèmes de Ganzfeld. NOTE: Pour les enregistrements de la rétine adaptée à l&#39;obscurité, les intensités des bouffées de test utilisées dans un agent de blanchiment expérience typique seulement une fraction négligeable du pigment de sorte que l&#39;absence de régénération conduit RPE-est pas un problème. En outre, il a été montré précédemment que cône pigment régénération peut encore avoir lieu dans la rétine isolée par l&#39;intermédiaire de la cellule Müller cycle visuel 20. </li></ol></li><li> Comme expériences durent habituellement de 30 minutes à plusieurs heures, de surveiller la dérive de référence, le niveau de bruit et la stabilité de réponse lors de l&#39;expérience que les changements de ceux-ci pourraient indiquer des problèmes techniques. NOTE: Augmentation du bruit ou de la diminutionamplitudes d de réponse peuvent indiquer des bulles d&#39;air dans les canaux de perfusion ou électrodes, température trop basse ou haute, solution de fuite / déversement ou de déplacement de la rétine. </li></ol> 4. Nettoyage <ol><li> Détachez le porte-échantillon à partir des lignes de perfusion, l&#39;ouvrir et vider les rétines du papier filtre. Retirez les électrodes et les rincer avec de l&#39;eau distillée (ne pas utiliser de l&#39;éthanol). Nettoyer le porte-échantillon (y compris les canaux de perfusion) avec de l&#39;éthanol et / ou de l&#39;eau distillée. Rincer soigneusement tubulure de perfusion avec&gt; 70% d&#39;éthanol. </li><li> Rincer la bouteille de perfusion avec de l&#39;eau distillée (ne pas utiliser de détergents). L&#39;éthanol peut également être utilisé pour nettoyer la bouteille. </li></ol>

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Université Washington à St. Louis a conclu un accord de licence avec Xenotec, Inc. et peut recevoir des redevances de la vente de l&#39;adaptateur ex vivo.

<html> Nous démontrons ici les étapes critiques pour l&#39;obtention de haute qualité ex vivo enregistrements ERG simultanément à partir de deux rétines de souris isolées en utilisant des composants in vivo du système ERG avec un ex vivo ERG adaptateur. Dans cette étude, nous avons perfusé les deux rétines de l&#39;animal avec la même solution (soit Ames &#39;, Ringer Locke ou) mais il est également possible de perfuser chaque rétine avec une solution différente, par exemple, à des fin...

Électrorétinogramme (ERG) est une technique bien établie qui peut être utilisé pour enregistrer l&#39;activité électrique de la rétine provoquée par la lumière. Le signal est généré ERG principalement par les variations de tension provoquées par les courants radiaux (selon l&#39;axe des photorécepteurs et les cellules bipolaires) circulant dans l&#39;espace extracellulaire résistif de la rétine. Le premier signal ERG a été enregistrée en 1865 par Holmgren de la surface d&#39;un œil de poisson 1. Einthoven et Jolly 1908 2 divisés la réponse ERG à l&#39;apparition de la lumière en trois vagues différentes, appelé A, B, et C-ondes, qui sont maintenant connu pour refléter principalement l&#39;activité des photorécepteurs, les cellules bipolaires ON, et l&#39;épithélium pigmentaire cellules, respectivement 8.3. ERG peut être enregistrée dans les yeux des animaux anesthésiés ou humains (in vivo), de la préparation des yeux isolé 9, à travers la rétine isolée intacte (ex vivo) 3,10-15 ou à travers les couches de la rétine spécifiques avec des microélectrodes (localERG) 4,16. Parmi ceux-ci, in vivo ERG est actuellement la méthode la plus largement utilisée pour évaluer la fonction rétinienne. Il est une technique non invasive qui peut être utilisé à des fins diagnostiques ou pour suivre la progression de maladies de la rétine chez les animaux ou patients. Cependant, in vivo enregistrements ERG produisent un signal compliqué avec plusieurs composants qui se chevauchent, souvent contaminés par le bruit extraoculaire physiologique (par exemple, la respiration et l&#39;activité cardiaque). ERG local peut être utilisé pour enregistrer le signal à travers des couches spécifiques de la rétine, mais il est le plus invasive et présente le plus faible rapport signal-sur-bruit (SNR) par rapport aux autres configurations d&#39;enregistrement ERG. ERG local est aussi techniquement exigeante et nécessite un équipement coûteux (par exemple, un microscope et micromanipulateurs). Transretinal ERG de la intacte, la rétine isolée (ex vivo ERG) offre un compromis entre les méthodes in vivo et ERG locales permettant stable et higenregistrements h SNR de rétines intactes d&#39;animaux ou les humains 17. Récemment, cette méthode a été utilisée avec succès pour étudier la fonction des bâtonnets et des cônes photorécepteurs dans les rétines de mammifères, les primates et les droits de 18-20. En outre, en raison de l&#39;absence de l&#39;épithélium pigmentaire de la rétine ex vivo, la composante c-onde positive du signal ERG est retiré et un composant PIII lente négative importante est révélée dans les enregistrements ex vivo. La composante lente PIII a été démontré que provenir de l&#39;activité des cellules gliales de Müller dans la rétine 21-23. Ainsi, ex vivo ERG procédé pourrait également être utilisé pour étudier les cellules de Müller dans la rétine intacte. Plusieurs études ont également montré que les ex vivo enregistrements ERG pourraient être utilisés pour mesurer la concentration d&#39;agents pharmacologiques autour de la rétine 24 et de tester l&#39;innocuité et l&#39;efficacité des médicaments 25-27. Multiple commercial dans des systèmes in vivo sont disponibles etutilisée dans de nombreux laboratoires qui ne disposent pas nécessairement vaste expérience en électrophysiologie. En revanche, ex vivo dispositifs ont pas été disponible jusqu&#39;à récemment 17 et par conséquent que très peu de laboratoires sont en cours avantage de cette technique puissante. Il serait bénéfique de faire des enregistrements ex vivo ERG disponible pour plusieurs laboratoires afin de faire progresser nos connaissances sur la physiologie et la pathologie de la rétine, et de développer de nouvelles thérapies pour les maladies cécitantes. Nous démontrons ici un dispositif simple et abordable ex vivo ERG 17 et montrons comment il peut être utilisé en combinaison avec plusieurs systèmes vivo ERG disponibles dans le commerce pour enregistrer dans la signalisation de bâtonnet et le cône médiation (A et B-ondes) et la fonction de les cellules de Müller (ralentir PIII) de rétines de souris de type sauvage intacte.

<table><tbody><tr><td>In vivo Système ERG</td><td>OcuScience</td><td>HMsERG</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id77.html">www.ocuscience.us/id77.html</a</td></tr><tr><td>>In vivo Système ERG</td><td>LKC Technologies</td><td>UTAS-E 3000</td><td><a href="http://www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html">www.lkc.com/products/UTAS/bigshot.html</a></td></tr><tr><td>Ex Adaptateur vivo</td><td>OcuScience</td><td>Ex VIVO ERG adapter</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/id107.html">www.ocuscience.us/id107.html</a></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>North Central Instruments</td><td>Leica M80</td><td><a href="http://www.ncimicro.com/store/ListProduct.asp?bSub=T&amp ; idCategory=27">Peut utiliser n’importe quelle marque</>un</td></tr> <tr><td>émetteur IR</td><td>Opto Diode Corp.</td><td>OD-50L</td><td><a href="http://www.optodiode.com/">www.optodiode.com</a></td></tr><tr><td>Lunette de vision nocturne Prowler</td><td>B.E. Meyers Electro Optics</td><td>D4300-I</td><td>Produit de qualité militaire.</td></tr><tr><td>Filtre rouge</td><td>Rosco Laboratories</td><td>Roscolux #27 Medium Red</td><td>Peut être utilisé à la place du système IR</td></tr><tr><td>Lampe frontale rouge</td><td>OcuScience</td><td>ERGX011</td><td><a href="http://www.ocuscience.us/catalog/i29.html">www.ocuscience.us/catalog/i29.html</a></td></tr><tr><td>Microscissors</td><td>WPI, Inc.</td><td>500086</td><td><a href="http://www.wpiinc.com/">www.wpiinc.com/</a></td></tr><tr><td>Pince à épiler Dumont #5</td><td>WPI, Inc.</td><td>14101</td><td></td></tr><tr><td>Lames de rasoir</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>72000</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com</a></td></tr><tr><td>Echelle</td><td>Metler Toledo</td><td>AB54-S/FACT</td><<td>a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Peut utiliser n’importe quelle marque</a</td></tr><tr><td>>pH-mètre et électrode</td><td>Beckman Coulter</td><td>pHI 350</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Peut utiliser n’importe quelle marque</a></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60129</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">Peut utiliser n’importe quelle marque</a></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63020</td><td>1.0 M solution</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21114</td><td>1.0 M solution</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>431788</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Bicarbonate</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>S6297</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>Ames medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>BaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0750</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>DL-AP4</td><td>Tocris Bioscience</td><td>101</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>d’acide succinique sel disodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>224731</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>d’acide L-glutamique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2834</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>de D-(+)-Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>de milieu de culture Leibovitz L-15</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4386</td><td>Peut utiliser n’importe quelle marque</td></tr><tr><td>MEM vitamines</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6895</td><td></td></tr><tr><td>MEM acides aminés</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5550</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN3156</td><td>5 % CO2</td></tr></tbody></table>

simultané<em&gt; ex vivo</em&gt; tests fonctionnels de deux rétines par<em&gt; in vivo</em&gt; système Électrorétinogramme

Simultaneous ex vivo Functional Testing of Two Retinas by in vivo Electroretinogram System

Un signal d’électrorétinogramme in vivo (ERG) est composé de plusieurs composants superposés provenant de différents types de cellules rétiniennes, ainsi que de bruit provenant de sources extra-rétiniennes. Ex vivo L’ERG fournit une méthode efficace pour disséquer la fonction des cellules rétiniennes directement à partir d’une rétine isolée intacte d’animaux ou d’yeux de donneurs. De plus, l’ERG ex vivo peut être utilisé pour tester l’efficacité et l’innocuité d’agents thérapeutiques potentiels sur le tissu rétinien d’animaux ou d’humains. Nous montrons ici comment les systèmes ERG in vivo disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour effectuer des enregistrements ERG ex vivo à partir de rétines de souris isolées. Nous combinons les unités de stimulation lumineuse, électroniques et de chauffage d’un système in vivo standard avec un porte-échantillon conçu sur mesure, un système de perfusion contrôlé par gravité et un blindage contre le bruit électromagnétique pour enregistrer simultanément des signaux ERG ex vivo à faible bruit à partir de deux rétines avec le logiciel d’acquisition inclus dans le commerce in vivo Systèmes. De plus, nous démontrons comment utiliser cette méthode en combinaison avec des traitements pharmacologiques qui éliminent des composants ERG spécifiques afin de disséquer la fonction de certains types de cellules rétiniennes.

Nous avons enregistré les réponses flash de type sauvage adaptés à l&#39;obscurité (WT) C57BL / 6 rétines de souris en suivant les protocoles expérimentaux décrits ci-dessus et illustrés dans la Figure 1 en utilisant différentes solutions de perfusion classiques (Figure 2). Les formes d&#39;ondes et de la cinétique de réponse ainsi que la sensibilité des photorécepteurs à bâtonnets semblent similaires à Ames »et les médias de Locke (Figure 2A et B). D&#...

Ex vivo ERG peut être utilisé pour enregistrer l’activité électrique des cellules rétiniennes directement à partir de rétines intactes isolées d’animaux ou d’humains. Nous démontrons ici comment les systèmes ERG in vivo courants peuvent être adaptés aux enregistrements ERG ex vivo afin de disséquer l’activité électrique des cellules rétiniennes.

Simultané<em&gt; Ex vivo</em&gt; Tests fonctionnels de deux rétines par<em&gt; In vivo</em&gt; Système Électrorétinogramme

An In vivo electroretinogram (ERG) signal is composed of several overlapping components originating from different retinal cell types, as well as noise ...

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer la fonction des cellules provenant d'une rétine de souris isolée à l'aide d'un système commercial d'électrorétinogramme (ERG) in vivo associé à un adaptateur ex vivo. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant les rétines des deux yeux d'une souris. La deuxième étape consiste à monter les rétines côté photorécepteurs vers le haut dans un support d'échantillon.Ensuite, le porte-échantillon est placé sur une plaque chauffante du système ERG in vivo et raccordé à la perfusion contrôlée par gravité. La dernière étape consiste à relier les électrodes du porte-échantillon à un amplificateur et à stimuler les rétines avec de la lumière afin d'obtenir des réponses ERG. En définitive, l'ERG ex vivo permet de montrer comment les voies de signalisation médiées par les bâtonnets et les cônes peuvent être disséquées à l'aide de la pharmacologie et de protocoles spécialisés de stimulation lumineuse.L'avantage principal de cette technique par rapport aux autres méthodes existantes, telles que les enregistrements in vivo, les ERG ou les enregistrements unitaires, est qu'elle permet d'obtenir un rapport signal sur bruit plus élevé, des enregistrements plus longs et plus stables, ainsi qu'une possibilité de manipulations pharmacologiques simples et quantitatives. En outre, cette méthode peut être utilisée pour évaluer l'efficacité et la sécurité de médicaments destinés au traitement des maladies de la rétine sur des rétines de primates et de donneurs humains. Au moins un jour à l'avance, modifier la partie inférieure du support d'échantillon en collant du papier filtre gris foncé sur le dessus des dômes. Utiliser une colle époxy bi-composant à prise rapide (cinq minutes) le long des bords des dômes, et si nécessaire, employer un microscope stéréoscopique. Une fois la colle sèche, aplatir fermement le papier filtre contre le dôme.Il sera utilisable pendant environ un mois d'enregistrement. Ensuite, retirez le papier et nettoyez la coupole avec de l'éthanol à 70 %. Maintenant, pour préparer l'électrode, remplissez d'abord les canaux de l'électrode avec la solution d'électrode.Veillez à éviter l'introduction de bulles d'air. Ensuite, vissez les électrodes en pastille dans les canaux des électrodes. Reliez les pièces supérieure et inférieure du porte-échantillon avec quatre vis et remplissez les lignes de perfusion avec la solution électrolytique. Ensuite, mesurez la résistance et la tension entre les fils des paires d'électrodes. La résistance doit être inférieure à 100 kiloohms et la tension inférieure à 10 millivolts. Si les canaux sont exempts de bulles et que les électrodes sont en bon état, versez maintenant 400 à 700 millilitres de milieu de perfusion dans un flacon en verre pour la perfusion de l'échantillon.Également, versez 300 millilitres pour la dissection et conservez-les au réfrigérateur. Ensuite, faites passer le tube de perfusion dans le bloc échangeur de chaleur et placez le bloc préchauffé sur la plaque chauffante. Fermez maintenant la bouteille avec un bouchon comportant une entrée pour le gaz et une entrée pour le tube de perfusion.L'entrée de gaz doit être reliée à une pierre poreuse. Placer la bouteille préchauffée à l'endroit où le milieu de perfusion sera maintenu à 37 degrés Celsius. Ensuite, amorcer les lignes de perfusion en les remplissant de milieu de perfusion afin d'initier l'écoulement par gravité dans un système Ocus Science.Placer la bouteille à l'intérieur de la cage de Faraday afin de minimiser le bruit et utiliser de longues lignes de perfusion en sortie depuis le porte-échantillon. Positionner ces lignes de sortie bien en dessous du niveau du porte-échantillon et de la bouteille de perfusion, les protéger et relier le blindage à la masse de l'amplificateur via la cage de Faraday. Pour éviter le couplage du bruit électromagnétique au signal d'ERG, fixer la sonde de température sur le plateau chauffant.À l’aide des régulateurs, réglez maintenant le débit de la solution à trois à cinq millilitres par minute. Enfin, si nécessaire, introduisez de l’air et du gaz dans la solution et ajustez le régulateur afin d’obtenir un flux régulier de bulles provenant de la pierre poreuse. Commencez par verser environ 200 millilitres de solution de perfusion froide dans une grande boîte de Pétri, de sorte que la partie inférieure entière du porte-échantillon puisse être complètement immergée.Endormir un animal élevé selon un cycle lumineux de 12 heures de lumière et 12 heures d’obscurité, puis adapté à l’obscurité pendant six à douze heures avant les enregistrements. Toutes les procédures suivantes doivent être effectuées sous lumière rouge ou infrarouge atténuée. Après avoir isolé chaque œil, le placer dans le milieu oculaire.Ensuite, transférez un œil sur un petit morceau de papier filtre placé sur le papier. Saisissez-le avec une pince et faites une incision au niveau approximatif de la serrure aurée à partir de la fente. Incisez le long de la serrure aurée ou un peu plus près de l'équateur pour enlever la cornée et le cristallin.Ensuite, retirez la cornée et les extrémités du cristallin, puis replacer la cavité oculaire dans le milieu froid. Répétez la même procédure avec l'autre œil. Maintenant, en travaillant avec une cavité oculaire, faites une petite incision depuis le haut vers le nerf optique.Conserver les ciseaux entre la rétine et la sclérotique afin que la rétine reste aussi intacte que possible. Ensuite, saisir la sclérotique des deux côtés de l'incision à l’aide de deux pincettes et tirer sur les tissus pour détacher la rétine. Pour isoler la rétine, sectionner le nerf optique et retirer la rétine en limitant au minimum le contact avec sa surface distale.Maintenant, montez les rétines isolées sur les dômes du porte-échantillon. Commencez par immerger la partie inférieure du porte-échantillon dans la boîte de Pétri contenant les rétines disséquées. Diapositive suivante.Le photorécepteur rétinien ou le côté convexe vers le haut au-dessus du dôme. Ensuite, soulevez délicatement le porte-échantillon afin que la rétine adhère au papier filtre. Répétez ensuite la procédure pour l'autre rétine.À présent, séchez soigneusement la plaque porte-échantillon afin d'éviter le bruit de couplage et la dérivation du signal. Après séchage du support, vissez la partie supérieure et remplissez les canaux de perfusion avec la solution de perfusion à l’aide d’une seringue munie d’une aiguille. Placez le porte-échantillon à côté du bloc d’échange thermique.Ensuite, connectez les lignes de perfusion d'entrée et de sortie. Terminez la configuration en raccordant les électrodes à l'amplificateur d'ERG et en fixant l'unité de contrôle du stimulateur au porte-échantillon. À l'aide d'un adaptateur, pour obtenir des réponses importantes et réutilisables, il est essentiel de réaliser une dissection et un montage soigneux des rétines, ainsi que de maintenir une perfusion stable et sans bulles au-dessus des rétines avant la collecte des données.Attendre de 10 à 20 minutes afin que la température et la fonction de la rétine se stabilisent. Les réponses au flash ont été enregistrées à partir de rétines de type sauvage C57 Black Six, adaptées à l’obscurité, en utilisant différentes solutions de perfusion standards. Les formes d’onde et la cinétique des réponses étaient similaires dans le milieu Ames et dans le milieu Locke. La sensibilité des photorécepteurs en bâtonnets était également similaire.D'autre part, dans les solutions de Ringer tamponnées sans bicarbonate ou réponse au carbogène, les amplitudes étaient nettement plus faibles. La stabilité de la BWA était également souvent compromise dans le Ringer de Heap. L'ajout de 40 micromolaire de A PB éliminait efficacement la B onde positive.Cela a révélé une grande onde lente négative attribuée à l'activité des cellules de Müller ; l'ajout de 100 micromolaire de baryum a annulé cette composante, mettant ainsi en évidence la réponse des photorécepteurs du signal ERG ex vivo. Cette méthode peut être combinée à d'autres outils tels que la pharmacologie et la génétique afin de répondre à des questions sur les mécanismes moléculaires de la signalisation rétinienne et des maladies entraînant la cécité, dans les rétines de mammifères, y compris celles de l'homme.

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Le développement de l'électrorétinogramme multifocal (mfERG) est une avancée importante dans le diagnostic et la caractérisation de la rétinopathie. Électrorétinogrammes Multifocal sont une moyenne mathématique d'une approximation d'une onde b. Les logiciels peuvent tirer ERGs de plus d'une centaine de zones rétiniennes en quelques minutes par œil. Scotomes et la dysfonction rétinienne peut être cartographiés et quantifiés.

Électrorétinogrammes multifocale

Nous décrivons une méthode relativement simple de transretinal électrorétinogramme (ERG) pour l'obtention des enregistrements photoresponses bâtonnets et des cônes de la rétine de la souris intacte. Cette approche tire profit du bloc de la transmission synaptique de photorécepteurs à isoler leurs réponses claires et de les enregistrer en utilisant des électrodes sur le terrain placé à travers le plat isolé monté sur la rétine.

Transretinal Recordings ERG de rétine de souris: Rod et Photoresponses Cône

Cet article décrit l'enregistrement des cellules individuelles de fluorescence taggés populations neuronales dans la rétine de souris intactes. En utilisant deux photons d'excitation infrarouge cellules transgenetically étiquetés ont été ciblés pour patch-clamp pour étudier leurs réponses lumière, les propriétés des champs réceptifs, et la morphologie.

Populations cellulaires Caractérisation électrophysiologique des exprimant la GFP dans la rétine intacte

Cette vidéo montre comment enregistrer l’électrorétinogramme (ERG) et le potentiel évoqué visuel (VEP) chez un rat conscient. Le rat, avec des électrodes implantées chirurgicalement, est d’abord adapté à l’obscurité. Après avoir appliqué des gouttes dilatantes, l’animal est placé dans une contention et positionné dans un bol Ganzfeld. Les signaux ERG et VEP sont ensuite enregistrés.

Enregistrement d’un électrorétinogramme et d’un potentiel évoqué visuel chez un rat

L’électrorétinogramme (ERG) est un potentiel électrique généré par la rétine en réponse à la lumière. Cet article décrit comment utiliser l’ERG pour évaluer la fonction rétinienne, chez des rats adaptés à l’obscurité, et comment il peut être utilisé pour évaluer une intervention neuroprotectrice, dans le cas présent un préconditionnement ischémique à distance.

Utilisation de la Électrorétinogramme pour évaluer la fonction dans le Retina rongeurs et les effets protecteurs de la distance préconditionnement ischémique Limb

Ce protocole décrit la mesure simultanée de l’électrorétinogramme et des potentiels évoqués visuels chez des rats anesthésiés.

Enregistrement simultané de Électrorétinographie et potentiels évoqués visuels chez des rats anesthésiés

Ici, nous présentons une méthode pour enregistrer les réponses électriques évoquées par la lumière de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) chez la souris en utilisant une technique connue sous le nom de DC-ERGs décrite pour la première fois par Marmorstein, Peachey et ses collègues au début des années 2000.

Électrorétinogramme couplé direct (DC-ERG) pour l’enregistrement des réponses électriques évoquées par la lumière de l’épithélium pigmentaire rétinien de souris

L’adhésion aux normes internationales et le maintien de l’adaptation des ténèbres rétiniennes sont essentiels pour obtenir des réponses valides à l’électrorétinographie en plein champ dans le diagnostic et la prise en charge des maladies rétiniennes héréditaires. Un protocole pratique utilisant une chambre noire portative est fourni pour obtenir l’électrorétogramme plein champ pour les enfants en bas âge et les enfants sous la sous-dation ou l’anesthésie générale dans le cadre de salle...

Enregistrement électrorétogramme pour nourrissons et enfants sous anesthésie pour atteindre une adaptation optimale des ténèbres et des normes internationales

L’imagerie in vivo est un outil puissant pour l’étude de la biologie dans la santé et la maladie. Ce protocole décrit l’imagerie transpupillaire de la rétine de la souris avec un microscope standard à deux photons. Il démontre également différentes méthodes d’imagerie in vivo pour marquer par fluorescence plusieurs cohortes cellulaires de la rétine.

Transpupillaire Imagerie in vivo à deux photons de la rétine de souris

La modification de l’équipement existant de réseau multiélectrodes ou de pince patch rend l’électrorétinogramme ex vivo plus largement accessible. Des méthodes améliorées pour enregistrer et maintenir les réponses lumineuses ex vivo facilitent l’étude du photorécepteur et de la fonction des cellules ON-bipolaires dans la rétine saine, des modèles animaux de maladies oculaires et des rétines de donneurs humains.

Optimisation de la configuration et des conditions de l’électrorétinogramme ex vivo pour étudier la fonction de la rétine dans les petits et grands yeux

Ce protocole présente et décrit les étapes pour l’isolement, la dissection, la culture et la coloration des explants rétiniens obtenus à partir d’une souris adulte. Cette méthode est bénéfique comme modèle ex vivo pour étudier différentes maladies neurovasculaires rétiniennes telles que la rétinopathie diabétique.

Explant rétinien de la rétine de souris adulte comme modèle ex vivo pour l’étude des maladies neurovasculaires rétiniennes

Découvrez l'électrorétinogramme ex vivo pour analyser la fonction des cellules rétiniennes isolées de souris. Cette méthode permet d'étudier les voies de signalisation des bâtonnets et des cônes avec une excellente stabilité.

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