Simultané Ex vivo Tests fonctionnels de deux rétines par In vivo Système Électrorétinogramme

L’objectif général de cette procédure est d’évaluer la fonction des cellules d’une rétine de souris isolée à l’aide d’un système commercial in vivo, d’un électrorétinogramme ou d’un système ERG associé à un adaptateur ex vivo. Ceci est accompli en disséquant d’abord les rétines des deux yeux d’une souris. La deuxième étape consiste à monter le photorécepteur de la rétine côté haut, dans un porte-échantillon.

Ensuite, le porte-échantillon est placé sur une plaque chauffante dans le système ERG in vivo et relié à la perfusion contrôlée par gravité. La dernière étape consiste à connecter les électrodes du porte-échantillon à un amplificateur et à stimuler les rétines avec de la lumière pour obtenir des réponses ERG. En fin de compte, l’ERG ex vivo est utilisé pour montrer comment les voies de signalisation médiées par les bâtonnets et les cônes peuvent être disséquées à l’aide de la pharmacologie et de protocoles de stimulation lumineuse spécialisés.

Le principal avantage de cette technique par rapport à d’autres méthodes existantes, telles que les enregistrements in vivo, les ERG ou les enregistrements sur cellule unique, est qu’elle offre un rapport signal/bruit plus élevé, des enregistrements plus longs et plus stables, ainsi que la possibilité de manipulations pharmacologiques faciles et quantitatives. De plus, cette méthode peut être utilisée pour dépister l’efficacité et l’innocuité des médicaments conçus pour traiter les maladies rétiniennes chez les rétines des primates et des donneurs humains. Au moins un jour à l’avance, modifiez la partie inférieure du porte-échantillon en collant du papier filtre gris noir sur le haut des dômes. Utilisez de l’époxy à deux composants pendant cinq minutes le long des bords des dômes et, si nécessaire, utilisez un microscope à dissection. Une fois la colle sèche, appuyez sur le papier filtre à plat sur le dôme.

Il sera bon pour environ un mois d’enregistrement. Retirez ensuite le papier et nettoyez le dôme avec de l’éthanol à 70 %. Maintenant, pour préparer l’électrode d’abord, remplissez les canaux de l’électrode avec la solution d’électrode.

Essayez d’éviter d’introduire des bulles d’air. Vissez ensuite les électrodes à granulés dans les canaux d’électrodes. Connectez les pièces supérieure et inférieure du porte-échantillon à l’aide de quatre vis et remplissez les conduites de perfusion avec une solution d’électrode.

Ensuite, mesurez la résistance et la tension entre les fils des paires d’électrodes. La résistance doit être inférieure à 100 kilo ohms et la tension inférieure à 10 millivolts. Si les canaux sont exempts de bulles et que les électrodes sont en bon état, versez maintenant 400 à 700 millilitres de milieu de perfusion dans une bouteille en verre pour la perfusion de l’échantillon.

Versez également 300 millilitres pour la dissection et conservez-le dans un réfrigérateur. Ensuite, placez la tubulure de perfusion à travers le bloc d’échangeur de chaleur et placez le bloc préchauffé sur la plaque chauffante. Entourez maintenant la bouteille d’un bouchon doté d’une entrée de gaz et d’une entrée de tube de perfusion.

L’entrée de gaz doit être fixée à une pierre à air. Mettez le biberon préchauffé là où le milieu de perfusion sera maintenu à 37 degrés Celsius. Ensuite, amorcez les lignes de perfusion en les remplissant de milieu de perfusion pour initier l’écoulement entraîné par gravité dans un système ocus science.

Placez la bouteille à l’intérieur de la cage de Faraday pour minimiser le bruit et utilisez de longues lignes de sortie de perfusion à partir du porte-échantillon. Positionné bien en dessous du niveau du porte-échantillon et du flacon de perfusion, protégez ces lignes de sortie et connectez le bouclier à la masse de l’amplificateur à travers la cage de Faraday. Pour éviter le couplage du bruit électromagnétique au signal ERG, fixez la sonde de température à l’étage de chauffage.

Maintenant, à l’aide de régulateurs, ajustez le débit de solution à trois à cinq millilitres par minute. Enfin, si nécessaire, introduisez de la voiture et du gaz dans la solution et ajustez le régulateur pour un flux constant de bulles de la pierre à air. Commencez par verser environ 200 millilitres de solution de perfusion froide dans une grande boîte de Pétri afin que toute la partie inférieure du porte-échantillon puisse être complètement immergée.

Euthanasier un animal élevé sous un cycle de 12 à 12 heures de lumière sombre, puis adapté à l’obscurité pendant six à 12 heures avant les enregistrements. Toutes les procédures suivantes doivent être effectuées sous une lumière rouge ou infrarouge tamisée. Après avoir isolé chaque œil, placez-les dans le milieu oculaire.

Transférez ensuite un œil sur un petit morceau de papier filtre sur le papier. Saisissez-le avec une pince à épiler et faites-y une fente à peu près au même niveau que l’aura serrata de la fente. Coupez le long de l’aura serrata ou quelque part plus près de l’équateur pour enlever la cornée et le cristallin.

Retirez ensuite la cornée et les extrémités de la lentille et transférez l’œilleton dans le support froid. Répétez cette même procédure avec l’autre œil. Maintenant, en travaillant avec un œilleton, faites une petite incision du haut vers le nerf optique.

Gardez les ciseaux entre la rétine et la sclérotique afin que la rétine reste aussi intacte que possible. Ensuite, saisissez la sclérotique des deux côtés de l’incision à l’aide de deux pinces à épiler et séparez le tissu pour détacher la rétine. Pour isoler la rétine, coupez le nerf optique et retirez la rétine avec un minimum de contact avec sa surface distale.

Maintenant, montez les rétines isolées sur les dômes du porte-échantillon. Tout d’abord, plongez la partie inférieure du porte-échantillon dans la boîte de Pétri avec les rétines disséquées. Diapositive suivante.

Le photorécepteur de la rétine ou le côté convexe vers le haut au-dessus du dôme. Soulevez ensuite doucement le porte-échantillon pour que la rétine se fixe au papier filtre. Répétez ensuite la procédure pour l’autre rétine.

Séchez maintenant soigneusement la plaque de support pour éviter les bruits de diaphonie et les manœuvres de signal. Après avoir séché le support, vissez la partie supérieure et remplissez les canaux de perfusion avec la solution de perfusion d’une seringue à l’aide d’une aiguille. Placez le porte-échantillon à côté du bloc d’échange de chaleur.

Connectez ensuite les lignes de perfusion d’entrée et de sortie. Terminez l’installation en connectant les électrodes à l’amplificateur ERG et en fixant l’unité de commande du stimulateur au porte-échantillon. Pour obtenir des réponses importantes et réutilisables, il est important d’effectuer une dissection et un montage soigneux des rétines, ainsi que de maintenir une perfusion stable et sans bulles au-dessus des rétines avant de collecter des données.

Attendez 10 à 20 minutes pour que la température et la fonction des rétines stabilisent les réponses flash ont été enregistrées à partir de six rétines sauvages de type C 57 noir adaptées à l’obscurité à l’aide de différentes solutions de profusion standard. Les formes d’onde et la cinétique de réponse semblaient similaires dans les médias ames et dans les médias locks. La sensibilité des photorécepteurs des bâtonnets était également similaire.

D’autre part, dans une solution de ringer tamponnée en tas sans réponse au bicarbonate ou au carbogoène, les amplitudes étaient significativement plus petites. La stabilité du BWA a également été souvent compromise dans la sonnerie du tas. L’ajout de 40 micromolaires de A PB a efficacement supprimé l’onde B positive.

Cela a révélé une vague négative importante et lente qui a été attribuée à l’activité des cellules de Mueller, ajoutant 100 micromolaires de baryum aboli. Ce composant révèle la réponse photoréceptrice du signal ERG ex vivo. Cette méthode peut être combinée avec d’autres outils tels que la pharmacologie et la génétique pour répondre à des questions sur les mécanismes moléculaires de la signalisation rétinienne et les maladies cécitantes chez les mammifères, y compris les rétines humaines.