Name: Iridium (III) luminescent sonde pour la détection de la protéine riche en histidine Malarial biomarqueurs protéines-II (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 52 s
Description: Découvrez une sonde à l'iridium phosphorescent pour détecter les biomarqueurs du paludisme via les protéines riches en histidine. Cette méthode offre une signalisation lumineuse robuste et spécifique pour le diagnostic.

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Le soutien de ce travail a été fourni par la Fondation Bill et Melinda Gates Grands défis en santé mondiale : développer des technologies qui permettent l’évaluation de plusieurs affections et agents pathogènes au point de service. K.M.D. a été soutenu par une bourse de recherche supérieure de la NSF (2012095464).

1. Synthèse de l&#39;iridium (III) Complexe <ol><li> Peser 53,6 mg (50 pmol) de [Ir (ppy) 2 -Cl] 2 et dissoudre dans 5 ml de chlorure de méthylène. Ajouter cette solution dans une fiole Erlenmeyer de 50 ml équipé d&#39;une barre d&#39;agitation. </li><li> Peser 26,2 mg (100 pmol) et de AgOTf dissoudre dans 5 ml de methanol. </li><li> Ajouter la AgOTf dissous à la [Ir (ppa) 2 Cl] 2 Solution et remuez pendant 1 heure. Remarque: Une couleur crème bouillie devrait en résulter. </li><li> Après 1 heure, on filtre la suspension à travers du gel de silice dans un flacon dram 25 x 95 mm et évaporer le solvant restant en utilisant un évaporateur rotatif (5-10 min). </li><li> Une fois la plupart du solvant est éliminée, vérifiez que un résidu huileux jaune reste dans le flacon. A ce résidu, ajouter 1 ml de methanol pour re-dissoudre le produit et lyophiliser 1-2 jours pour donner le produit solide jaune. </li><li> Caractériser l&#39;Ir (ppa) 2 (H 2 O) 2 + produit (Ir1) par H &lt;sup&gt; 1 RMN (dans CDCl 3), ESI et UV-Vis comme décrit précédemment. 23 </li></ol> 2. Interactions de Ir1 avec divers acides aminés <ol><li> Préparer une solution à 2 mM de Ir1 dans du methanol (MW 537,10 g / mol). Vortex pour assurer la dissolution complète du solide. </li><li> Préparer 100 uM des solutions des acides aminés et des biomolécules suivantes dans une solution saline tamponnée de HEPES (HBS mM de HEPES, 100, 137 mM de NaCl, pH 7,4) Ala, Asp, Cys, His, Ile, Lys, Ser, Try, Val. </li><li> Introduire à la pipette 100 pi de chaque acide aminé dans une plaque de 96 puits noir. Ajouter 100 ul de HBS à la plaque pour servir de vide. </li><li> Ajouter 2,5 ul de la solution 2 mM Ir1 à chaque échantillon et agiter la plaque sur un agitateur de plaque pendant 10 min. </li><li> Après 10 min, d&#39;acquérir les spectres d&#39;émission des échantillons en utilisant un lecteur de plaques à 96 puits (365 ex / em 400-700). <ol><li> Placer la plaque dans l&#39;instrument et ouvrez le logiciel de lecteur de plaque de mettre en place une nouvelle expérience. </li><li> Définissez le nouveau experiment à lire une analyse de fluorescence à une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 365 nm et une largeur de fente de 9 nm avec le système optique à la position supérieure. </li><li> Lire l&#39;émission de 300 à 700 nm avec une taille de pas de 5 nm. </li><li> Exporter les données pour l&#39;analyse des données. </li></ol></li><li> Transférer les échantillons à une plaque de 96 puits claire et l&#39;image de l&#39;émission en utilisant un transilluminateur UV. </li></ol> 3. Le titrage de Ir1 avec BNT-II <ol><li> Préparer une solution mère 1 mM de BNT-II (PM 8233,6 g / mol) dans du HBS, ainsi qu&#39;une solution à 2 mM de Ir1 dans du methanol. </li><li> De la solution mère, préparer 1 ml de 100 um BNT-II dans HBS. Vortex le tube à centrifuger pour assurer l&#39;échantillon est mélangé. </li><li> Diluer la série 100 uM BNT-II de moitié dans du HBS à une concentration finale de 1,56 uM BNT-II. </li><li> Ajouter 100 ul de chaque dilution, en triple exemplaire, avec HBS servant de blanc, pour les puits d&#39;une plaque à 96 puits. Pour chaque échantillon, ajouter 2,5 pi de 2 mM Ir1. </li><li> Shake la plaque pendant 10 min sur un agitateur de plaque. </li><li> Après agitation, lire l&#39;intensité d&#39;émission à 510 nm (excitation à 365 nm) en utilisant un lecteur de plaques à 96 puits. <ol><li> Placer la plaque dans l&#39;instrument et ouvrez le logiciel de lecteur de plaque de mettre en place une nouvelle expérience. </li><li> Réglez la nouvelle expérience de lire un critère de fluorescence avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 365 nm de longueur d&#39;onde et l&#39;émission de 510 nm. Réglez la largeur de la fente pour les deux longueurs d&#39;onde à 9 nm, avec l&#39;optique à la position supérieure. </li><li> Lire la plaque et d&#39;exporter les données pour l&#39;analyse. </li></ol></li><li> Transférer les échantillons à une plaque de 96 puits claire et l&#39;image de la titration en utilisant un transilluminateur UV. </li></ol> 4. temps réel Kinetic Analyse du système Ir1 / BNT-II utilisant l&#39;interférométrie couche biologique <ol><li> Ajouter 200 pi de tampon cinétique (KB; phosphate 1x solution saline tamponnée avec 0,02% de Tween-20) à 8 puits dans la première colonne d&#39;une plaque de 96 puits noir et insérer la plaque dans le capteur en plastiquetitulaire. Transférer soigneusement 8 Ni (II) biocapteurs NTA à la première colonne dans le support de matière plastique de telle sorte que les pointes sont mises en suspension dans les puits de tampon. Placer le support de matière plastique sur le côté gauche de l&#39;instrument d&#39;interférométrie. </li><li> Préparer un 2 ml d&#39;une solution 0,5 M de BNT-II en Ko. </li><li> Préparer 500 ul d&#39;une solution 10 uM de Ir1 kb, et on dilue en série par la moitié vers le bas à 0,156 pM en Ko. </li><li> Pour une nouvelle plaque et noir 96, pipette 200 pi de Ko à tous les 8 puits dans la colonne A et C. </li><li> De la même plaque, une pipette 200 ul de la solution 0,5 uM BNT-II dans les puits dans la colonne B. </li><li> Introduire à la pipette 200 ul de chaque dilution de Ir1 dans la colonne D, en commençant par KB comme dans l&#39;ébauche ainsi D1. Ajouter les dilutions de sorte que les puits augmentation de la concentration Ir1 long de la colonne. </li><li> Placez cette plaque dans l&#39;instrument à la droite de la plaque contenant les capteurs de pré-mouillage. </li><li> Dans le logiciel biocouche d&#39;interférométrie, mettre en place une base Kinetic expérience en définissant les conseils plaque, le dosage, et de capteurs. <ol><li> Pour définir la plaque, sélectionnez une colonne sur l&#39;écran, faites un clic droit et choisissez la définition appropriée pour les puits. Sélectionnez &quot;tampon&quot; pour les colonnes A et C, &quot;Load&quot; pour la colonne B, et «échantillon» pour la colonne D. </li><li> Définir le dosage dans l&#39;onglet suivant en ajoutant les étapes suivantes (Cliquez sur &quot;Ajouter&quot;): équilibration (Custom), 60 sec; Chargement en cours, 120 s; Ligne de base, 60 sec; Association, 120 s; et de dissociation, 300 sec. Sélectionnez l&#39;étape d&#39;équilibrage et double-cliquez sur la colonne A. Répétez l&#39;opération pour Chargement (colonne B), Baseline (colonne C), Association (colonne D) et de dissociation (colonne C). Sélectionnez les capteurs Ni (II) NTA. </li><li> Déplacer vers l&#39;onglet suivant et confirment que les capteurs sont dans la colonne A sur le support de capteur de plastique. </li><li> Confirmer l&#39;expérience est décrite correctement, insérez un nom de fichier, veiller à ce que «l&#39;expérience de retard&quot; est cochée, et appuyez sur «Go». Note: En raison de la nature de l&#39;instrument automatisé, une fois l&#39;expérience cinétique est décrit, les étapes se produira comme programmé. </li></ol></li><li> Une fois la course cinétique est complète, traiter les données dans le logiciel de traitement prévu. <ol><li> Double-cliquez sur le dossier avec le nom de l&#39;intérêt dans la partie inférieure du panneau sur la gauche. Ensuite, double-cliquez sur le dossier correspondant à la rubrique «Kinetics&quot; dans la partie supérieure du panneau. Allez sur l&#39;onglet de traitement. </li><li> Cochez la case de soustraction sur la gauche pour ouvrir l&#39;écran de sélection du capteur. Faites un clic droit sur le bien A4 et modifier le type de bien de bien référencer. </li><li> Cochez la case à côté de Aligner l&#39;axe Y, et de veiller à l&#39;étape sélectionnée est Baseline. Spécifiez la plage de temps pour être les cinq dernières secondes de la ligne de base (environ 55-60 secondes). </li><li> Cochez la case pour l&#39;Inter-étape Correction et sélectionnez Aligner à la dissociation. Vérifiez que la case Savitzky-Golay filtrage est cochée et appuyez sur &quot;Process Data! ̶1; </li><li> Allez sur l&#39;onglet Analyse. Assurez-vous que &quot;Association et dissociation» est la sélection pour les étapes pour analyser et que le modèle est de 1: 1. Sélectionnez un ajustement complet local et appuyez sur &quot;Courbes Fit!&quot; </li><li> Mettez en surbrillance toutes les courbes dans le tableau et cliquez sur la droite pour régler toutes les courbes à une couleur. Ensuite, sélectionnez un mondial (complet) apte, regroupés par couleur et Rmax Unlinked par capteur. Appuyez sur &quot;Courbes Fit!&quot; Pour obtenir des données cinétiques mondiaux. </li></ol></li></ol> 5. Sur-perle Détection de BNT-II et rcHRP-II avec Ir1 <ol><li> Préparer 1 ml de chaque solution de 1 pM de BNT-II-II et rcHRP dans du HBS avec Tween (HBST; HBS avec 0,025% de Tween 20). </li><li> Diluer en série chaque protéine par moitié dans HBST à une concentration finale de 15,6 nM. </li><li> Pipette 100 pi de chaque dilution, en triple exemplaire, dans une plaque blanche à 96 puits, avec les dilutions dans l&#39;ordre de la plus faible à la plus forte concentration sur une colonne. </li><li> Pipette 10 ul de 50 um Ni (IINTA) des particules magnétiques agarose dans chaque dilution ainsi. <ol><li> Vortex le tube à centrifuger contenant les particules magnétiques après chaque pipetage pour assurer les particules restent en suspension. </li></ol></li><li> Placer la plaque sur un agitateur de plaque pendant 15 min à incuber les échantillons avec les particules. </li><li> Après cette période d&#39;incubation, placer la plaque sur un aimant de plaque de 96 puits et attendre 30 secondes pour les particules de tirer hors de la solution. </li><li> En utilisant une pipette multicanaux, retirer l&#39;échantillon original et jeter comme des déchets. Retirer la plaque de l&#39;aimant. </li><li> Ajouter 200 pi de HBST à chaque puits en utilisant la pipette multicanaux. Pomper le tampon de haut en bas plusieurs fois pour laver les particules magnétiques. </li><li> Placer la plaque arrière sur l&#39;aimant et attendre 30 secondes pour les particules de tirer hors de la solution. </li><li> Utilisation de la pipette multicanaux, retirer les 200 pi de tampon et le jeter comme un déchet. Retirer la plaque de l&#39;aimant. </li><li> Répétez les étapes 5,8 throug5.10 h deux fois pour terminer trois lavages des particules. </li><li> Ajouter 100 pi de HBST à chaque puits contenant des particules magnétiques suivie par 2,5 pi de 2 mM Ir1. </li><li> Incuber les particules avec IR1 sur un agitateur de plaque pendant 1 heure. </li><li> Après 1 heure, lire l&#39;intensité d&#39;émission à 510 nm (excitation à 365 nm) en utilisant un lecteur de plaques à 96 puits. <ol><li> Placer la plaque dans l&#39;instrument et ouvrez le logiciel de lecteur de plaque de mettre en place une nouvelle expérience. </li><li> Réglez la nouvelle expérience de lire un critère de fluorescence avec une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 365 nm de longueur d&#39;onde et l&#39;émission de 510 nm. Réglez la largeur de la fente pour les deux longueurs d&#39;onde à 9 nm, avec l&#39;optique à la position supérieure. </li><li> Lire la plaque et d&#39;exporter les données pour l&#39;analyse. </li></ol></li><li> Transférer les échantillons à une plaque de 96 puits claire et l&#39;image de la titration en utilisant un transilluminateur UV. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Comme outils de diagnostic basés microparticules viennent à la pointe de la technologie moderne de diagnostic, la détection de biomolécules cibles directement sur la surface de la particule est un atout majeur. Les méthodes de détection moléculaires classiques, tels que ELISA et PCR, sont avantageux en ce qu&#39;ils peuvent atteindre de très faibles limites de détection 25. Cependant, ces tests nécessitent de vastes et longs protocoles réactifs. Cet essai a été conçu pour imiter les interactions en sandwich de type ELISA sans le temps et des exigences de réactif (Figure 5). En outre, le coût de la sonde Ir1 par échantillon a été estimé à environ un centime, alors que le coût d&#39;anticorps pour un ELISA typique est 0,20-0,30 $ par échantillon. Depuis les méthodes décrites ci-dessus reposent sur ​​une sonde iridium cyclometalated pour la détection du biomarqueur du paludisme, cette sonde ne serait pas sensible aux modes de défaillance communs à d&#39;autres méthodes de détection (ie. Fluorophore de quenching et la dégradation anticorps / enzyme). Histidine est unique dans ses propriétés de fixation métalliques. Le travail présenté profite de ce phénomène en remplaçant les anticorps dans un sandwich typique ELISA avec des complexes contenant des métaux. Ni (II) de NTA capture rcHRP-II sur la surface de la particule et Ir1 signale la présence de la protéine. L&#39;étape la plus critique dans l&#39;essai est de permettre aux particules magnétiques de se mélanger avec l&#39;échantillon et la sonde. Dans une plaque à 96 puits ELISA, les biomolécules et les réactifs atteindre l&#39;équilibre avec la surface à deux dimensions du fond du puits. Les particules magnétiques ont tendance à s&#39;installer hors de la solution en raison de leur base d&#39;oxyde de fer dense, ce qui réduirait les sites de liaison disponibles. Ainsi, les particules doivent être mélangées pendant le temps d&#39;essai pour assurer la liaison maximale. Lors de la conception d&#39;un réactif pour le diagnostic de la maladie, il faut garder à l&#39;esprit la forme d&#39;échantillon du patient ainsi que la concentration physiologique du biomarqueur. Pourle paludisme, la concentration de pf HRP-II dans le sang d&#39;un patient peut varier de faible à élevé picomolaire nanomolaire. Bien que ce test est cliniquement pertinente pour les niveaux plus élevés d&#39;infection, la limite de détection doit être améliorée afin de détecter les patients asymptomatiques avec une faible circulation picomolaire pf HRP-II. Dans les procédés décrits ci-dessus, la &quot;mise en marche&quot; signal généré par Ir1 se produit en présence d&#39;histidine. Alors que le biomarqueur paludisme est riche en histidine, d&#39;autres protéines sériques, comme l&#39;albumine sérique humaine et riche en histidine glycoprotéine, seraient provoquent une réponse de signal avec la sonde. Ce serait à son tour conduire à des diagnostics faux positifs. Cela rend la capture de la protéine sur la surface de la particule une étape bénéfique, en ce que la protéine d&#39;intérêt peut être extrait rapidement à partir d&#39;un échantillon de patient. En outre, la conception d&#39;une sonde bifonctionnelle, qui couple un peptide riche en histidine à un élément de reconnaissance moléculaire solide (ie. Aptamère), Pourrait ajouter une autre couche de la spécificité de l&#39;essai. Le peptide serait chargé avec l&#39;iridium avant accouplement afin de l&#39;aptamère. Dans une telle conception, la sonde Ir1 stable peut encore être utilisé, tout en réalisant une spécificité de cible avec l&#39;aptamère. Cela permettrait d&#39;application de la sonde pour détecter la HRP-II natif dans une matrice complexe (p. De plasma ou sang total) et de réduire les effets de liaison non spécifiques. Afin d&#39;améliorer encore le signal de tests de diagnostic rapide, le test pourrait être incorporé dans un système électrochimiluminescent (ECL), où pf HRP-II peut être détecté sur le TDR comme lecture électrochimique 26. Cette sonde d&#39;iridium de la prochaine génération améliorerait grandement notre bourrelet sur-dosage ELISA pour la détection de marqueurs biologiques de la maladie.

Étiquetage colorimétriques et fluorescente est une méthode importante pour la détection et le suivi des molécules biochimiques et traite 1,2. Les marqueurs fluorescents plus courantes sont de faible poids moléculaire colorants organiques 3,4, mais ces molécules ne disposent pas toujours des propriétés optiques idéales. Les colorants fluorescents sont sujettes à photoblanchiment, ont souvent des petits déplacements de Stokes, et peut avoir excitation se chevauchant et des spectres d&#39;émission. Marquage colorimétrique est souvent obtenue par l&#39;utilisation de marqueurs enzymatiques, qui ont un signal amplifié utile dans la quantification immunologique 5,6. Ces enzymes ont aussi leurs inconvénients, y compris la photosensibilité, des conditions de réaction, et la durée de conservation courte du substrat. Ces propriétés ont tendance à exiger des dosages immunologiques et des méthodes d&#39;étiquetage des protéines à faire dans des conditions bien contrôlées en utilisant des réactifs coûteux. Complexes de métaux de transition émissives ont été explorés comme une approche d&#39;étiquetage alternatif for détection biochimique. En particulier, cyclometalated Ir (III) a été étudiée dans le contexte de diodes électroluminescentes organiques (OLED) 7-9 oxygène de détection 10, la catalyse 11, et de protéines / cellule coloration 12-14. Photostabilité élevée et l&#39;efficacité quantique font de cette classe de sondes un bon candidat pour la détection de biomolécules 15,16. Il a déjà été constaté que cyclometalated Ir (III) complexes, de la forme [Ir (C ^ N) 2 (solv) 2] +, se lie irréversiblement histidine et provoquer une réponse de signal bleu-vert 12,17. Ces complexes sont non-émissif dans l&#39;état de solvento, mais lorsque l&#39;histidine déplace les molécules de solvant et se lie au centre métallique, ils libèrent un signal intense phosphorescent après irradiation UV à ondes longues. Ce signal se produit uniquement après substitution de ligand, et est le résultat d&#39;un électron à l&#39;état triplet de détente à l&#39;état du sol à travers l&#39;activation du transfert de charge métal-ligand (3 MLCT) et le ligand transfert centrée (3 LC) 8,15 voies. Ces complexes peuvent potentiellement être utilisés en tant que sondes de détection pour les protéines riches en histidine. protéines riches en histidine et leurs niveaux de régulation sont importants dans de nombreuses maladies, y compris la cirrhose du foie, le cancer et les troubles thrombique. 18 Plasmodium falciparum Histidine Rich Protein II (Pf HRP-II) en particulier, est un biomarqueur bien validé de l&#39;infection du parasite du paludisme. Cette protéine est de 67 kDa et contient 34% d&#39;histidine, la plupart du temps au sein de caractéristiques AHHAHHAAD répétant des motifs 19. Ces répétitions histidine peuvent lier les ions métalliques libres 19 et 20 des complexes hème dans le sang de l&#39;hôte. Pf HRP-II est couramment détectée dans les milieux à faibles ressources en utilisant des tests de diagnostic rapide (TDR) immunochromatographiques, mais ces tests sont souvent inexactes en raison de conditions échantillons, la concentration de biomarqueurs bas, des normes de fabrication pauvres, et la dégradation des anticorps 21. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; sondes phosphorescents à base de métaux tels que le cyclometalated Ir (III) décrits ci-dessus sont des options intéressantes pour la détection de Pf HRP-II en raison de leur liaison sélective de l&#39;histidine et leurs propriétés stable et efficace émission. Dans ce document, l&#39;utilisation de [Ir (ppa) 2 (H 2 O) 2] + (Ir1) pour détecter BNT-II, un peptide mimétique ramifié de Pf HRP-II est exploré 22. Cinétique de cette interaction ont été surveillées en temps réel en utilisant des techniques d&#39;interférométrie biocouche. Le test a également été adapté à un format de type ELISA sur-perle, où les limites de nanomolaires de détection ont été atteints. Ce dosage possède des avantages par rapport ELISA classiques, car il peut être réalisé en moins de deux heures avec des réactifs d&#39;anticorps libre, à la place de la 4-5 h et avec des réactifs biologiques nécessaires ELISA typiques.

<table><tbody><tr><td>Dicholortétrakis(2-(2-pyridinyl)phényl)diiridium(III)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>658383</td><td></td></tr><tr><td>argent trifluorométhanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>176435</td><td></td></tr><tr><td>Gel de silice</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>6858</td><td></td></tr><tr><td>L-Acides aminés</td><td>Fisher Scientific</td><td>varie</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>BNT-II peptide</td><td>Synthétisé en interne</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Laboratoire de consultants en immunologie HRPII recombinant</td><td>inc.</td><td>AGPF-55</td><td></td></tr><tr><td>Costar polypropylène noir 96 puits</td><td>plaque Fisher Scientific</td><td>07-200-567</td><td></td></tr><tr><td>Costar polypropylène blanc 96 puits</td><td>Fisher</td><td>Scientific 07-200-589</td><td></td></tr><tr><td>Grenier polypropylène noir 96 puits</td><td>plaque VWR</td><td>89089-582</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA particules d’agarose magnétique</td><td>Qiagen</td><td>36111</td><td></td></tr><tr><td>Ni(II)NTA capteurs d’interférométrie de biocouche</td><td>ForteBio</td><td>18-5101</td><td></td></tr><tr><td>Octet Red96 Biolayer Interférométrie Instrumet</td><td>ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biotek Synergy H4 Lecteur de microplaques</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fisher Biotech Transilluminator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FBDLT-88</td><td></td></tr></tbody></table>

iridium (iii) luminescent sonde pour la détection de la protéine riche en histidine malarial biomarqueurs protéines-ii

Iridium(III) Luminescent Probe for Detection of the Malarial Protein Biomarker Histidine Rich Protein-II

Ce travail décrit la synthèse d&#39;un non-émissive, cyclometalated Ir (III), Ir (ppa) 2 (H 2 O) 2 + (Ir1), qui déclenche un signal phosphorescent rapide, longue durée de vie quand elle est coordonnée à une histidine contenant une protéine immobilisée sur la surface d&#39;une particule magnétique. Synthèse de Ir1, avec des rendements élevés, est complet O / N et implique le fractionnement du parent cyclometalated Ir (III) dimère de chloro-ponté dans deux équivalents de complexe solvaté. Pour confirmer la spécificité, plusieurs acides aminés ont été sondés pour l&#39;activité de coordination lorsqu&#39;il est ajouté à la sonde synthétisée, et seulement histidine ont provoqué une réponse de signal. Utilisation BNT-II, un peptide mimétique ramifié du biomarqueur paludisme Histidine Rich Protein II (Pf HRP-II), la sonde de l&#39;iridium a été validé comme un outil pour la détection HRP-II. Effets de trempe ont été notées dans le titrage BNT-II / Ir1 par rapport à la L-histidine / Ir1, mais ceux-ci ont été attribués à encombrement stérique et triPlet état trempe. Biocouche interférométrie a été utilisé pour déterminer la cinétique en temps réel de l&#39;interaction avec des Ir1 BNT-II. Une fois que le système a été optimisé, la limite de détection de rcHRP-II au moyen de la sonde a été trouvé que 12,8 nM en solution. Lorsque cette protéine est immobilisée sur la surface d&#39;une particule magnétique agarose 50 pm, la limite de détection était de 14,5 nM. La réponse robuste du signal de cette sonde inorganique, ainsi que sa souplesse d&#39;utilisation en solution ou immobilisé sur une surface, peuvent se prêter à l&#39;égard d&#39;une variété d&#39;applications, depuis l&#39;utilisation de l&#39;imagerie diagnostique.

Comme le montre la Figure 1, la synthèse de complexes de fractionnement impliquer la Ir1 du pont de chlorure dans le dimère de parent par précipitation du chlorure sous la forme de AgCl insoluble et d&#39;association de molécules d&#39;eau par rapport au centre métallique. La formation de Ir1 a été confirmée par RMN H 1 et ESI. En outre, des bandes caractéristiques de transfert de charge métal-ligand UV-visible et π-π * transitions ont été assignés au spectre, la validation en outre la formation de Ir1. Ce solvaté complexe présente aucun caractère émissive lorsqu&#39;il est excité à 365 nm. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig1.jpg" /> Figure 1:.: Synthèse et caractérisation de pont Ir1 réaction de chlorure de fendage de Dichlorotetrakis (2- (2-pyridinyl) phényl) diiridium (III) pour créer le complexe aquo Ir (ppy) 2 (H 2 O) 2 </sub&gt; + (Ir1). Lors de l&#39;addition de L-His à la aquo complexe dans un tampon aqueux, le signal luminescent est activé. Une fois que le complexe a été synthétisé et caractérisé, la sélectivité pour l&#39;acide aminé a été analysée comme décrit précédemment en utilisant une iridium analogique 17 similaire. La figure 2A montre que seule l&#39;histidine a déclenché une réponse de signal à 510 nm, lorsqu&#39;il est excité à 365 nm. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig2.jpg" /> Figure 2: Acide aminé sélectivité et titrage avec de Ir1 Peptides riche en histidine (A) Interaction de 200 uM de différents acides aminés (Cys, Ser, Asp, Glu, Phe, Lys, Arg, Tyr, Trp, His) avec 50 uM. Ir1 dans HBS. Scans spectrales ont été prises 400-700 nm à une longueur d&#39;onde d&#39;excitation de 365 nm dans une plaque de 96 puits noir. Signal en unités relatives de fluorescence (RFU) à partir de tous les acides aminés butre histidine (trace noire en pointillés) était négligeable. Concentrations (B) nanomolaires de BNT-II (▪) et rcHRP-II (♦) ont été titrés avec Ir1 dans HBS. Les peptides riches en histidine ont été incubées avec la sonde pendant 15 min dans une solution avant la lecture de l&#39;émission à 510 nm après excitation à 365 nm de la lumière. La limite de détection a été calculé comme la valeur de x lorsque y = 3σ vide. Cet &quot;interrupteur marche-&quot; de la phosphorescence de la sonde d&#39;iridium se produit parce que l&#39;état excité singulet (1 MLCT / 1 LC) de l&#39;Ir (III) bioconjugué subit croisement intersystème à l&#39;état excité triplet (3 MLCT), lorsque l&#39;histidine est coordonné au centre métallique. Cette sonde a été appliqué à BNT-II un peptide mimétique du biomarqueur du paludisme Plasmodium falciparum Histidine Rich Protein II (pf HRP-II). Dans un titrage de BNT-II avec IR1, une réponse de signal dépendant de la concentration a été observée ( <strong&gt; Figure 2B). Recombinant HRP-II (rcHRP-II) a également présenté une réponse similaire en solution. Les limites de détection des BNT-II et rcHRP-II de la solution étaient de 54,8 nM et 12,8 nM, respectivement. En utilisant des techniques d&#39;interférométrie biocouche, le K D de Ir1 lier à BNT-II immobilisé sur une surface Ni (II) NTA a été jugée 2,05 uM (figure 3). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig4.jpg" /> Figure 3: cinétique en temps réel d&#39;analyse de Ir1 avec BNT-II interférométrie couche biologique pour l&#39;analyse cinétique de diverses concentrations de liaison à Ir1 BNT-II sur la surface d&#39;un capteur de verre (II) Ni NTA.. Après équilibrage des capteurs kb (région A), les capteurs sont chargés avec 0,5 uM BNT-II (région B). Une fois que le peptide est chargé sur les capteurs, une ligne de base est établie (région C) avant de mesurer l&#39;association de Ir1 au BNT-II (région D). Aprèsune période d&#39;association, les capteurs sont placés de nouveau dans KB pour mesurer dissociation (Région E). L&#39;ensemble du processus d&#39;analyse cinétique prend moins de 30 minutes. Lors d&#39;une transition à partir d&#39;un essai à base de solution à une plate-forme de particules magnétiques, la complexité accrue de la particule dans le système doit être prise en compte. Il était connu de travaux antérieurs, que ces particules se lient efficacement le paludisme biomarqueur pf HRP-II. 24 plaques fluorescentes noires ont bien travaillé pour le dosage de la solution décrit ci-dessus, mais les plaques blanches étaient mieux adaptés à la plate-forme de détection sur-particules, comme vu dans la figure 4A. Dans une assiette blanche, la lumière est réfléchie dans l&#39;échantillon, ce qui permet une meilleure absorption par le Ir1 lié à la surface de la particule. Dans l&#39;essai sur-particules, la limite de détection de rcHRP-II a été déterminée à 14,5 nM (figure 4B). La limite de détection pour rcHRP-II en solution et sur-talon sont statisquement la même basée sur une test t non apparié (p = 0,731). <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" style="font-size: 14px; line-height: 28px;" /> Figure 4:. Sur-perle Détection de BNT-II et HRP-II (A) différence entre le signal détecté à partir Ir1 lié à BNT-II sur la surface de 50 um Ni particules agarose (II) NTA magnétiques dans un noir 96- ainsi plaque (trait plein) par rapport à une plaque de 96 puits blanc (ligne pointillée). Les particules ont été excités avec lumière à 365 nm, et l&#39;émission a été mesurée à 510 nm. (B) Le titrage de rcHRP-II immobilisé sur des particules magnétiques et détecté en utilisant Ir1. La limite de détection a été calculé comme le VALue de x lorsque y = 3σ vide. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52856/52856fig5.jpg" /> Figure 5: Représentation schématique de la détection sur-cordon de rcHRP-II avec Ir1 régime général de HRP-II se lier à la surface de Ni (II) NTA Les particules et marqué avec Ir1.. Les particules sont incubées avec un peptide riche en histidine pendant 15 min. Après cette période d&#39;incubation, les particules sont lavées à l&#39;aide d&#39;un aimant HBST, afin de tirer les particules hors de la solution. Enfin, les particules de peptide lié sont incubées avec Ir1 pendant 1 heure avant la lecture de l&#39;émission à 510 nm après excitation à 365 nm de la lumière.

Des réactifs de détection robustes sont de plus en plus nécessaires pour développer de nouveaux outils de diagnostic du paludisme. Une sonde à l’iridium(III) a été conçue pour émettre un signal luminescent de longue durée en présence d’un biomarqueur de protéine du paludisme riche en histidine. La détection de la protéine en solution ou immobilisée sur une particule magnétique offre une flexibilité d’application.

Iridium (III) luminescent sonde pour la détection de la protéine riche en histidine Malarial biomarqueurs protéines-II

This work outlines the synthesis of a non-emissive, cyclometalated Ir(III) complex, Ir(ppy)2(H2O)2+ (Ir1), which elicits a rapid, long-lived ...

L'objectif général de cette procédure est de détecter la présence d'un biomarqueur protéique riche en histidine dans un échantillon à l'aide d'une sonde iridium phosphorescente. Cela est réalisé en premier lieu par la synthèse du complexe d'iridium cyclométhylé. Après une rupture rapide des ponts chlorure du complexe dimère parent, le complexe d'iridium cyclométhylé peut être isolé et purifié avant d'être utilisé dans le test.La deuxième étape consiste à valider les interactions de la sonde avec divers acides aminés afin de garantir sa spécificité. En présence d'histamine seule, le signal phosphoréscence s'active uniquement en présence d'histamine et est observé par spectroscopie de luminescence. Ensuite, comme preuve de concept, la sonde à base d'iridium est titrée avec un peptide mimétique du biomarqueur du paludisme, la protéine riche en histidine deux, afin de déterminer les limites de détection en solution.De plus, la cinétique de l'interaction de la sonde avec le peptide est élucidée à l'aide de la biocouche interférométrique. La dernière étape consiste à immobiliser une protéine recombinante riche en histidine à la surface de particules magnétiques au nickel NTA et à évaluer la limite de détection de la protéine à l'aide de la sonde. Enfin, la luminescence et la spectroscopie sont utilisées pour montrer comment les protéines peuvent être détectées à la surface d'un support solide à l'aide d'une nouvelle classe de sondes iridium phosphorescentes.Les principaux avantages de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le marquage par protéines fluorescentes et les dosages immuno-enzymatiques sont que la sonde est robuste, présente des cinétiques d'association rapides et n'est pas sensible au photoblanchiment. De plus, cette technique ne nécessite pas de temps prolongé, contrairement aux dosages immuno-enzymatiques.Les implications de cette technique s'étendent à l'analyse de l'infection palustre, en raison de la forte teneur en histidine de la protéine biomarqueuse de l'infection par Plasmodium SRO appelée protéine riche en histidine deux. Nous avons eu l'idée de cette méthode en remarquant qu'un article avait été publié utilisant une sonde iridium cyclométhylée pour marquer des cellules vivantes.Dans cet article, ils ont indiqué que la sonde pénétrait dans la cellule vivante et illuminait les noyaux en se liant aux protéines riches en his-cine. Compte tenu de la nature du biomarqueur mal, la protéine deux riche en his-cine, nous avons décidé d'utiliser cette sonde pour détecter notre protéine d'intérêt. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle en raison de la complexité du test et du grand nombre d'étapes de lavage et de transfert nécessaires pour détecter cette protéine cible sur la particule. Pour commencer, prenez 53,6 milligrammes du dimère iridium parent et dissolvez-les dans cinq millilitres de chlorure de méthylène.Ajouter cette solution à un flacon Lummi de 50 millilitres équipé d'une barre magnétique en forme d'étoile. Ensuite, peser 26,2 milligrammes de FL d'argent et dissoudre dans cinq millilitres de méthanol. Ajouter le FL d'argent dissous à la solution mère de dimère d'iridium et agiter pendant une heure.Un précipité de couleur crème devrait se former après une heure. Filtrer le précipité à travers un gel de silice dans un filtre. Transférer le produit filtré dans un flacon DRAM de 25 par 95 millimètres et évaporer le solvant restant à l’aide d’un évaporateur rotatif pendant cinq à dix minutes. Une fois que la majeure partie du solvant est éliminée, vérifier qu’un résidu huileux de couleur jaune demeure dans le flacon.À ce résidu, ajoutez un millilitre de méthanol pour solubiliser le produit. Laissez reposer pendant un à deux jours afin d'obtenir un solide jaune, puis caractérisez le produit comme décrit dans le protocole du texte afin d'étudier les interactions de la sonde iridium avec divers acides aminés. Prélèvez à la pipette 100 microlitres de chaque solution d'acide aminé et déposez-les dans une plaque 96 puits noire.Ajouter 100 microlitres de solution saline tamponnée ou HBS dans la plaque pour servir de blanc. Puis ajouter 2,5 microlitres de la solution préparée à deux millimolaire de sonde iridium à chaque échantillon et agiter la plaque sur un agitateur de plaque pendant 10 minutes. Après 10 minutes, acquérir les spectres d'émission des échantillons à l'aide d'un lecteur de plaques 96 puits.Pour ce faire, placez la plaque dans l'appareil et ouvrez le logiciel du lecteur de plaques afin de configurer une nouvelle expérience. Ensuite, transférez les échantillons dans une plaque transparente de 96 puits et visualisez l'émission à l'aide d'un transilluminateur UV afin d'effectuer la titration de la sonde d'iridium avec le peptide ramifié imitant le biomarqueur du paludisme, la protéine riche en histidine deux BNT deux. Préparez d'abord une solution mère à un millimolaire de BNT deux dans du HBS.Ensuite, diluez sérialement la solution BN T deux comme décrit dans le protocole écrit. Ajoutez 100 microlitres de chaque dilution en triple exemplaire, avec le HBS servant de témoin, dans les puits d'une plaque de 96 puits ; pour chaque échantillon, ajoutez 2,5 microlitres de la sonde à l'iridium à deux millimolaire. Agitez la plaque pendant 10 minutes sur un agitateur pour plaque, puis mesurez l'intensité d'émission à 510 nanomètres à l'aide d'un lecteur de plaques de 96 puits.Enfin, transférez les échantillons dans une plaque claire de 96 puits et imagez le titrage à l’aide d’un transilluminateur UV afin d’effectuer une analyse cinétique en temps réel par interférométrie en couche biologique. Commencez par ajouter 200 microlitres de tampon cinétique dans huit puits de la première colonne d’une plaque noire de 96 puits. Après avoir inséré la plaque dans le support capteur en plastique, transférez soigneusement huit biosenseurs au nickel dans la première colonne du support en plastique, de sorte que les extrémités soient suspendues dans les puits contenant le tampon.Ensuite, insérez le support en plastique du côté gauche de l'instrument d'interférométrie dans une nouvelle plaque noire de 96 puits ; ajoutez 200 microlitres de KB dans les huit puits des colonnes un et trois de la même plaque, puis ajoutez 200 microlitres de la solution de BNT deux à 0,5 micromolaire dans les puits de la colonne deux. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de chaque dilution de la sonde d'iridium dans la colonne quatre, en commençant par le KB comme témoin dans le puits A4. Ajoutez les dilutions de sorte que la concentration de la sonde d'iridium augmente progressivement vers le bas de la colonne.Placer cette plaque à droite de la plaque contenant les capteurs préhumidifiés dans le logiciel de biocouche d'interférométrie. Configurer une expérience cinétique de base en définissant le test de la plaque et les embouts de capteur pour définir la plaque, sélectionner une colonne à l'écran, cliquer avec le bouton droit et choisir la définition appropriée. Pour les puits, sélectionner le tampon.Pour les colonnes une et trois, charger pour la colonne deux et l'échantillon. Pour la colonne quatre, définir le dosage dans l'onglet suivant en cliquant d'abord sur ajouter un équilibre. Chargement de 60 secondes, puis 120 secondes.Association 120 secondes et dissociation 300 secondes. Sélectionnez l'étape d'équilibre et double-cliquez sur la colonne un. Ensuite, faites de même pour le chargement sur la colonne deux, la ligne de base sur la colonne trois, l'association sur la colonne quatre et la dissociation sur la colonne trois.Enfin, sélectionnez les capteurs au nickel NTA. Vérifiez que l'expérience est correctement définie. Saisissez un nom de fichier.Veillez à cocher l'expérience de délai, puis appuyez sur démarrer. Une fois l'acquisition cinétique terminée, traitez les données à l'aide du logiciel de traitement fourni afin d'effectuer la détection sur perles du BNT deux et de la HRP deux recombinante avec la sonde iridium. Préparez une dilution en série du BNT deux et de la HRP deux recombinante comme décrit dans le protocole écrit.Ensuite, pipetez 100 microlitres de chaque dilution en triple exemplaire dans une plaque blanche de 96 puits, en ordonnant les dilutions de la plus faible à la plus forte concentration selon une colonne. Ajoutez 10 microlitres de particules magnétiques de nickel NTA 50 µM dans chaque dilution. Veillez à maintenir les particules magnétiques en suspension pendant la pipetage. Si elles commencent à sédimenter, mélangez-les à l’aide de la pipette ou par vortex. Placez ensuite la plaque sur un agitateur de plaque pendant 15 minutes afin d’incuber les échantillons avec les particules. À l’issue de cette période d’incubation, positionnez la plaque sur un aimant de 96 puits et attendez 30 secondes pour que les particules soient retirées de la solution.À l’aide d’une pipette multicanaux, retirez l’échantillon initial et jetez-le comme déchet après avoir retiré la plaque de l’aimant, en ajoutant 200 microlitres de HBS avec du tween ou de HBST dans chaque puits. À l’aide de la pipette multicanaux, aspirez et expulsez le tampon plusieurs fois afin de laver les particules magnétiques. Replacez la plaque sur l’aimant et attendez 30 secondes pour que les particules sortent de la solution.À l’aide de la pipette multicanal, prélevez 200 microlitres de tampon et jetez-les comme déchet. Retirez la plaque de l’aimant avant de répéter deux fois les étapes de lavage, afin d’effectuer au total trois lavages des particules. Ajoutez ensuite 100 microlitres de HBST dans chaque puits contenant les particules magnétiques, suivis de 2,5 microlitres de la solution du traceur d’iridium à deux millimolaire.Incubez les particules avec la sonde d'iridium sur un agitateur de plaque pendant une heure. Après une heure, lisez l'intensité d'émission à 510 nanomètres à l'aide d'un lecteur de plaques 96 puits.Après la synthèse et la caractérisation de la sonde au cyclométallate d'iridium, divers acides aminés sont testés pour leur réactivité avec le complexe. Seul l'histidine provoque une réponse de signal en unités de fluorescence relative lors du titrage de la sonde. En présence de deux peptides contenant de l'histamine en solution, une réponse dépendante de la concentration est observée.Cette réponse peut être observée ici sous lumière UV large bande. La microbalance à onde guidée pour l'analyse cinétique de différentes concentrations de la sonde iridium liant BNT deux à la surface d'un capteur en nickel. Le capteur en verre NT.A révèle que la sonde iridium présente une affinité micromolaire pour les peptides contenant de l'histidine.La limite de détection de la protéine riche en histidine à l'aide de la sonde était similaire lorsque la protéine était immobilisée à la surface d'une particule magnétique. Comme en solution, ce marquage de la protéine peut être visualisé à la surface des particules elles-mêmes, une fois la technique maîtrisée. Cette technique peut être réalisée en deux heures si elle est effectuée correctement.Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de faire preuve de précaution lors des étapes de lavage et de transfert avec les particules magnétiques liant les protéines. Éliminer les protéines non liées par lavage est essentiel pour une détection correcte de la P-F-H-R-P deux immobilisée, concevoir un élément de reconnaissance moléculaire capable de cibler spécifiquement la protéine liée par des interactions anticorps-antigène. L'utilisation continue de la sonde d'iridium robuste permettra une détection plus sensible et spécifique des protéines liées à la surface des particules après son développement.Cette technique pourrait permettre aux chercheurs dans le domaine du diagnostic d'explorer l'utilisation de réactifs robustes non seulement pour la détection du paludisme, mais aussi pour d'autres maladies infectieuses.

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Homogène de détection rapide des essais biologiques utilisant un support magnétique Système de modulation Biosensing

Quantitatives à haut débit, en temps réel, et sans étiquette de détection biomoléculaire (ADN, protéines, etc) sur...

Détection biomoléculaire employant le capteur interférométrique Réflectance Imaging (IRIS)

Nous présentons ici un protocole d'analyser les interactions ARN / protéines. L'essai de décalage de mobilité électrophorétique (EMSA) est basé sur la migration différentielle des complexes ARN / ARN et de protéine libre pendant l'électrophorèse sur gel natif. En utilisant une sonde d'ARN radiomarqué, complexes / protéine ARN peuvent être visualisés par autoradiographie.

Maj de mobilité électrophorétique Assay (EMSA) pour l&#39;étude des interactions ARN-protéine: L&#39;IRE / IRP Exemple

Bien que l'analyse haute résolution de fusion offre la possibilité de différencier les polymorphismes nucléotidiques simples dans une population hétérogène, biais d'amplification allèle mutant peut augmenter sa capacité à détecter les allèles présents à des pourcentages relativement faibles dans un échantillon. Ce protocole décrit des améliorations qui permettent d'améliorer la sensibilité de l'analyse de fusion de haute résolution.

Méthodes pour augmenter la sensibilité de la haute résolution de fusion Single Nucleotide Polymorphism génotypage dans le paludisme

Les microARN humains se déplacent des érythrocytes hôtes vers les parasites de Plasmodium falciparum. Ici, les techniques utilisées pour transfecter des microARN synthétiques dans les érythrocytes de l’hôte et isoler tous les ARN de P. falciparum sont décrites.  De plus, cet article détaille une méthode d’isolement des polysomes chez P. falciparum pour déterminer l’occupation ribosomique et le potentiel de traduction des transcrits du parasite.

Méthodes pour étudier le rôle de réglementation de petits ARN ribosomal et l&#39;occupation des<em&gt; Plasmodium falciparum</em

Nous décrivons ici une procédure permettant une analyse détaillée de l’activation dépendante de la phosphorylation du facteur de transcription IRF3. Ceci est réalisé grâce à la combinaison d’un SDS-PAGE haute résolution et d’un PAGE-natif couplé à des immunoblots utilisant plusieurs anticorps phosphospécifiques.

A Haute Résolution méthode de surveillance activation phosphorylation dépendante de IRF3

Nous présentons ici un protocole pour la détection et la quantification de Plasmodium falciparum infectés aqueuse globules rouges à l’aide d’un spectromètre infrarouge de la réflexion totale atténuée et analyse de données multivariées.

Détection et Quantification de Plasmodium falciparum dans aqueux globules rouges par atténuée totale réflexion spectroscopie infrarouge et analyse de données

Pour améliorer les tests de diagnostic sérologiques pour les antigènes de mycobacterium tuberculosis, nous avons développé des nanosondes d’oxyde de fer superparamagnetic pour détecter la tuberculose extrapulmonaire.

Synthèse, caractérisation et application de nanosons à oxyde de fer superparamagnetic pour la détection de la tuberculose extrapulmonaire

Ce protocole se concentre sur l'identification des protéines qui se lient aux phosphates inositol ou phosphoinositides. Il utilise la chromatographie d'affinité avec les phosphates d'inositol biotinylated ou les phosphoinositides qui sont immobilisés par l'intermédiaire de streptavidin à l'agarose ou des perles magnétiques. Les protéines de liaison du phosphate d'inositol ou du phosphoinositide sont identifiées par le ballonnement occidental ou la spectrométrie de masse.

Identification du phosphate d'inositol ou du phosphoinositide Protéines interactatrices par chromatographie d'affinité couplée à la fente occidentale ou à la spectrométrie de masse

L’immunoassay d’électrochimie (ECLIA) est une nouvelle approche pour la détection quantitative des variantes de protéines MeCP2 endogènes et exogènement appliquées, qui produit des mesures hautement quantitatives, précises et reproductibles avec une erreur intra- et inter-essais faible sur un large éventail de travail. Ici, le protocole pour le MeCP2-ECLIA dans un format de 96 puits est décrit.

Un essai à base d’électrochimie pour Les variantes de protéines MeCP2

Le présent protocole décrit une opération détaillée d’imagerie par fluorescence NIR-II en temps réel d’une souris à l’aide d’un dispositif d’imagerie optique NIR-II.

Une sonde de fluorescence NIR-II brillante pour l’imagerie vasculaire et tumorale

Découvrez une sonde à l'iridium phosphorescent pour détecter les biomarqueurs du paludisme via les protéines riches en histidine. Cette méthode offre une signalisation lumineuse robuste et spécifique pour le diagnostic.

Iridium (III) luminescent sonde pour la détection de la protéine riche en histidine Malarial biomarqueurs protéines-II

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