Name: Une méthode de distance Silencing activité neuronale chez les rongeurs Pendant phases distinctes de lapprentissage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 22 s
Description: Découvrez une méthode de pharmacogénétique pour inhiber l'activité neuronale chez le rat pendant l'apprentissage. Cette technique combine virus AAV, clozapine-N-oxyde et paradigme de conditionnement sensoriel pour étudier les mécanismes cérébraux de la mémoire.

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Nous remercions les auteurs de Robinson et al. 12 pour leurs contributions à le manuscrit à partir de laquelle ce protocole est partiellement dérivé.

L&#39;utilisation d&#39;animaux sont approuvés par le Oberlin College institutionnel de protection des animaux et utilisation comité et sont en conformité avec le Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire 21. 1. Préparation pour perfusion virale Remarque: Ce protocole utilise BSL-1 précautions. Quand on emploie BSL-2 précautions, une blouse de laboratoire jetable, gants, couvre-chaussures, protections oculaires et un respirateur de particules (tapez N95) sont obligatoires. Toutes les personnes qui les manipulent BSL-2 composés doivent être aptes testé pour un respirateur de particules par une agence de santé publique local. Reportez-vous à Lowery &amp; Majewska (2010) 22 pour plus de détails sur la manipulation et le stockage de vecteurs viraux. <ol><li> Lors de la première utilisation, aliquote et stocker le virus utilisé dans 20 microtubes pi pour éviter le gel et le dégel répétés. </li><li> Préparer la surface de travail en supprimant tous les objets inutiles et la stérilisation de la surface avec 70% d&#39;éthanol. Préparer un 1Solution d&#39;eau de Javel 0% pour décontaminer les déchets de l&#39;AAV. Placez un bécher rempli de la solution d&#39;eau de Javel et une seringue stérile de 10 pi sur la surface de travail. Placer le tube à centrifuger avec l&#39;AAV dans un récipient avec de la glace pilée lors de mise en place. </li><li> Placer le tube à centrifuger avec le virus dans un étau standard. Charger une seringue de 10 ul avec au moins 4 pi d&#39;AAV. Prenez soin de ne pas plier l&#39;embout de la seringue contre le fond du tube de microcentrifugeuse pendant le chargement. Assurez-vous qu&#39;il n&#39;y a pas de bulles d&#39;air dans les 4 pi de solution de AAV dans la seringue. </li><li> Jeter le tube vide de virus dans le bécher contenant 10% de l&#39;eau de Javel. Rangez le restant du virus comme indiqué par le fournisseur. </li><li> Ajouter supplémentaire de 10% de javel pour le conteneur de déchets, et laissez les déchets reposer pendant 30 min avant d&#39;éliminer les déchets liquides décontaminés. </li><li> Éliminer tous les équipements de protection et de déchets en plastique dans un container prévu comme indiqué par les directives institutionnelles. Décontaminate tout équipement ou surfaces ayant été en contact avec le virus en utilisant 10% de javel. </li></ol> 2. Chirurgie <ol><li> Préparer la zone chirurgicale en plaçant le papier absorbant banc sous l&#39;appareil stéréotaxique et sur un espace adjacent désigné comme une zone de manipulation de virus dédié. <ol><li> Placez un récipient de déchets de Javel à 10% dans la zone de manipulation du virus dédié près de l&#39;appareil chirurgical. </li></ol></li><li> Provoquer un niveau stable de l&#39;anesthésie et de préparer le rat pour la chirurgie. <ol><li> Placez le rat dans une chambre d&#39;induction qui contient un mélange de gaz isoflurane (plage de 1 à 3%) et d&#39;oxygène (100% à environ 1 L / min) jusqu&#39;à ce que il ya une perte de conscience et le manque de mouvement intentionnel brut. Maintenir anesthésie à l&#39;isoflurane pendant toute la procédure chirurgicale. </li><li> Après 6 anesthésie profonde est atteint, de se raser le rat d&#39;entre les yeux légèrement derrière les oreilles. </li><li> Placez le rat nouveau dans la chambre d&#39;induction pour une1-3 min supplémentaire. </li><li> Assurez-vous que le système d&#39;anesthésie à l&#39;isoflurane est connecté à la pointe avant de la chirurgie stéréotaxique. Ouvrez le robinet d&#39;arrêt sur le tube isoflurane pour commencer l&#39;écoulement de l&#39;isoflurane à l&#39;stereotax. Maintenir l&#39;isoflurane et de l&#39;oxygène aux niveaux indiqués ci-dessus. </li><li> Placez le rat dans un appareil stéréotaxique de fixation de la bouche sur la barre de morsure et la fixation des barres d&#39;oreilles. </li><li> Appliquer un lubrifiant oculaire pour les yeux et la bétadine sur le site chirurgical avant l&#39;incision. </li></ol></li><li> Ajouter un 2,4 cm incision médiane de la peau sur la surface dorsale du crâne à partir d&#39;environ 2 mm caudale pour les yeux. Rétracter la peau pour exposer le crâne. Périodiquement inculquer 0,9% saline stérile stérile sur les marges du site chirurgical pour empêcher les tissus de séchage. </li><li> Tissus membraneux Effacer du crâne jusqu&#39;à ce bregma et lambda sont clairement visibles. </li><li> Assurez-vous que le crâne est de niveau en mesurant les coordonnées dorsales-ventrale aubregma et au lambda. Ajuster le dispositif stéréotaxique en conséquence jusqu&#39;à ce que les coordonnées dorsale-ventrale au bregma et lambda diffèrent pas de plus de 0,04 mm. </li><li> A cette époque, de réduire le gaz isoflurane à entre 2 et 2,5%. </li><li> Retour à la perceuse bregma, remettre à zéro les coordonnées et ensuite passer la perceuse à la médio-latérale désirée et antéro-postérieure de coordonnées. </li><li> Percer un trou à l&#39;aide de coordonnées d&#39;un foret de 0,9 mm car il produit un trou de taille appropriée pour un 28 G perfusion seringue. </li><li> Mettre la pompe à perfusion pour délivrer virus à un débit de 0,2 ul / min. Placer la seringue dans le bras de perfusion du dispositif stéréotaxique et abaisser la seringue dans la coordination souhaitée. Fournir la quantité voulue de virus (varier de 0,1 à 0,8 ul). Par exemple, offrir 0,8 pi de AAV plus de 4 min. Remarque: mener des études pilotes pour déterminer le volume d&#39;infusion idéale et la propagation typique de virus dans chaque région d&#39;intérêt. <ol><li> Après la livraison du virus est complete laisser la seringue en place pendant 10 min pour empêcher le reflux dans les voies de l&#39;aiguille. Soulevez lentement la seringue à un taux d&#39;environ 5 mm / min. Répétez jusqu&#39;à ce que toutes les coordonnées ont été infusé avec AAV. </li></ol></li><li> Fermer la plaie en utilisant des agrafes chirurgicales et manteau de la plaie avec une pommade antibiotique topique. </li><li> Suivez les directives institutionnelles pour la gestion de la douleur post-opératoire. </li><li> Placez le rat dans une cage avec literie, un couvercle et une signalisation adéquate et retourner le rat à l&#39;animalerie. <ol><li> Si vous travaillez sous BSL-2 précautions, literie pour recueillir la quantité de temps (généralement 48-72 h) spécifié par les directives institutionnelles. Placez la literie dans un conteneur pour déchets biologiques dangereux. </li><li> Jetez tous les matériaux d&#39;AAV contaminés comme spécifié par les lignes directrices pour leur élimination sûre. </li></ol></li></ol> 3. Appareil Behavioral Remarque: L&#39;appareil de préconditionnement sensorielle consiste en un conditionnement opérant cham normeber (12 &quot;L x 9.5&quot; W x 11.5 &quot;H) avec un plancher inoxydable grille en acier, 2 parois latérales en plexiglas et 2 parois métalliques. <ol><li> Monter un 2,8 W lumière sur l&#39;un des murs d&#39;aluminium pour servir de la lumière de la maison et que le stimulus visuel lorsque flashé à 2 Hz. Monter un haut-parleur sur la chambre de livrer les stimuli auditifs (10 sec, 1500 Hz, 78 dB et un son pur dB bruit blanc 10 sec 78). <ol><li> Utilisation d&#39;une trémie d&#39;alimentation pour délivrer 45 mg de granulés de produits alimentaires dans la coupe des aliments. Dans la coupe de la nourriture, des cellules photoélectriques infrarouges détectent le temps total passé dans la tasse de nourriture avant, pendant et après les présentations des stimuli et des récompenses alimentaires. </li><li> Maison des chambres dans des armoires de insonorisants (22 &quot;W x 22&quot; H x 16 &quot;D) équipés de ventilateurs d&#39;extraction (~ 68 dB). </li><li> Utiliser un ordinateur PC avec le logiciel Med Associates pour contrôler la chambre opérant et acquérir les données. Pendant les séances de conditionnement, de recueillir des données sur le temps total passé avec la tête dans la tasse de nourriture pendant presentation du stimulus lumineux (5 sec époque) et lors de la présentation de la récompense alimentaire (5 sec d&#39;époque). Au cours de la session de test, recueillir des données sur le temps total passé dans la tasse alimentaire en réponse aux présentations des stimuli auditifs (10 sec époque du début, quand les stimuli auditifs sont terminées). </li></ol></li></ol> 4. Aperçu de la sensorielle préconditionnement Paradigm <ol><li> Suite à la récupération de la chirurgie, de restreindre progressivement l&#39;alimentation des rats à 85% de leur poids corporel d&#39;alimentation libre. Consultez le personnel vétérinaire pour un paradigme de restriction alimentaire approprié. Remarque: le préconditionnement 3-sensoriel paradigme de phase est illustrée à la figure 2. </li><li> Préconditionnement Sessions (Phase 1; quotidiennes des sessions de formation de 64 min menée sur 4 jours consécutifs): <ol><li> Rats présents avec 12 essais entremêlées qui se composent de la livraison des stimuli auditifs et visuels. Inclure les intervalles inter-essai que moyenne de 4,5 min (intervalle de 4,0 à 5,0 min) après chacun unprésentation uditory. </li><li> Le 6 des essais, présente une tonalité (relance préconditionnés) pendant 10 secondes, suivi immédiatement par une présentation de 5 sec du stimulus de lumière clignotante. </li><li> Sur les 6 autres essais, présenter le bruit blanc (stimulus non apparié) seul pendant 10 sec. </li></ol></li><li> séances de conditionnement (Phase 2; Daily sessions de formation 64 min menée dans 5 jours consécutifs): <ol><li> Rats présents avec 8 essais qui se composent de la livraison du stimulus visuel (le stimulus de lumière clignotante) pendant 5 secondes immédiatement suivi par la livraison de deux boulettes de nourriture de 45 mg. Inclure les intervalles inter-essai cette moyenne 7 min (intervalle 6,0 à 8,0 min) après chaque essai. Parfois rats nécessitent plus de 5 séances de conditionnement d&#39;apprendre l&#39;association de la nourriture légère. </li></ol></li><li> Session d&#39;essai (phase 3; une seule session de 78 min): <ol><li> Présenter les rats avec 12 essais entremêlées qui se composent de la livraison des seuls stimuli auditifs. Inclure les intervalles inter-essai que AVErage 4,5 min (intervalle de 4,0 à 5,0 min) après chaque présentation auditive. </li><li> Le 6 des essais, présenter le stimulus de tonalité (le stimulus préconditionnés) seul pendant 10 sec. </li><li> Sur les 6 autres essais, présenter le bruit blanc (le stimulus non apparié) seul pendant 10 sec. </li></ol></li><li> Contrebalancer les stimuli en complétant l&#39;étude avec une deuxième série de rats qui reçoivent le bruit blanc que le stimulus préconditionnés et le ton que le stimulus non apparié. </li></ol> 5. pharmacologique et comportementale procédure <ol><li> Tournez sur la puissance de l&#39;appareil de comportement et charger le code Med-PC pour la session de comportement approprié. Fil et le programme de l&#39;appareil de comportement telles que les fans qui sont montés sur les armoires de son atténuation allument quand l&#39;appareil est sous tension. </li><li> Pour préparer une solution à 1 mg / ml de N-oxyde de la clozapine (CNO), peser 5,0 mg de CNO dans un tube conique de 15 ml et ajouter 5 ml d&#39;eau stérile ou stérile 5 ml de 0,9% saliNE. Vortex jusqu&#39;à ce que la solution est claire. <ol><li> Si CNO ne se dissout pas dans la solution ou si des solutions plus concentrées de CNO on souhaite ajouter un agent de solubilisation, tel que le DMSO 23. Plus précisément, pour préparer une solution à 1 mg / ml de CNO avec 0,5% de DMSO, 5,0 mg de peser CNO et ajouter 25 ul de DMSO dans un tube conique de 15 ml. Flick doucement assurer que le contenu reste à la base du tube. Lorsque la solution devient limpide, ajoutez 5 ml d&#39;eau stérile ou 5 ml de solution saline stérile à 0,9%. Des instructions supplémentaires pour la préparation de solutions de CNO sont disponibles sur la page des ressources DREADD wiki 25. </li><li> Préparer une nouvelle solution CNO chaque jour qu&#39;il est administré. </li></ol></li><li> Injecter le CNO intrapéritonéale à une dose de 1 mg / kg environ 30 min avant le test comportemental. Par exemple, une injection de 200 g de rat avec 0,2 ml de la / ml solution CNO 1 mg. Le cours de la dose et la durée d&#39;administration CNO ont été sélectionnés sur la base de rapports précédemment publiés 2,12.<ol><li> Injecter CNO 30 min avant chaque session de préconditionnement (phase 1; total de 4 jours d&#39;injections), mais administrer le véhicule avant de toutes les sessions ultérieures de comportement. </li></ol></li><li> Après 30 min, placer les rats dans les chambres de tests comportementaux et lancer le code informatique pour la session de comportement approprié. </li><li> À la fin de la tâche comportementale, retirer immédiatement les rats issus des chambres et retourner les rats à la colonie animale. </li></ol> 6. Les analyses des données comportementales Note: La variable dépendante pour toutes les sessions de comportement est la quantité de temps que la tête du rat est à l&#39;intérieur de la tasse de nourriture comme détecté par l&#39;interruption des cellules infrarouges dans la tasse de nourriture. Les données (à sec) sont recueillies et enregistrées par le logiciel de l&#39;ordinateur. <ol><li> Ne pas effectuer des analyses sur des données générées pendant la phase de préconditionnement. </li><li> Pour les séances de conditionnement: analyser l&#39;un de chacun des ratsbilité d&#39;apprendre l&#39;association de la nourriture légère en comparant le comportement de tasse alimentaire durant la présentation du stimulus visuel à travers les 5 sessions de comportement. Plus précisément, calculer le temps moyen passé dans la tasse de nourriture pendant la lumière époque 5 sec pour chacun des 8 essais / session (soit une moyenne de 8 essais qui sont chacun 5 secondes dans la durée / rat). Comparez commande moyenne et les valeurs expérimentales pour chacune des 5 séances par jour (voir la figure 3A). <ol><li> Analyser la motivation des rats pour obtenir récompense alimentaire en comparant le comportement de coupe alimentaire lors de la livraison de la récompense alimentaire (5 sec d&#39;époque) à travers les 5 sessions de comportement en utilisant le même calcul spécifiée pour l&#39;époque de la lumière 5 sec ci-dessus. Ces valeurs seront systématiquement plus élevés que ceux acquis durant la présentation du stimulus visuel (voir la figure 3B). </li></ol></li><li> Pour la session de test: calculer un ratio de la discrimination qui décrit le comportement de la Coupe alimentaire des rats en réponse à pressentations de chaque stimulus auditif. <ol><li> Plus précisément, pour chaque rat, diviser le temps moyen passé dans la tasse de nourriture suivant chacune des 6 présentations du stimulus préconditionnés sensorielle (par exemple, le ton) par la somme du temps moyen passé dans la tasse de nourriture suivant chacune des 6 présentations de la stimulus sensoriel préconditionnés (ie, le stimulus de la tonalité) et de la moyenne du temps total passé dans la tasse de nourriture suivant chacune des 6 présentations du stimulus non apparié (à savoir, le bruit stimulus blanc). Chaque époque est de 10 secondes dans la durée. Note: Un score de discrimination de 0,5 ou plus démontre que les rats ont appris les associations inhérentes dans le paradigme de préconditionnement sensorielle. </li></ol></li></ol> 7. Vérification de l&#39;AAV placement et d&#39;expression <ol><li> Anesthésier et perfuser les rats transcardiaque utilisant 4% de paraformaldéhyde. Grâce à l&#39;utilisation de marqueurs fluorescents, ne pas dépasser un temps de post-fixation de 2 h à minla perte de l&#39;antigénicité de imize et pour préserver le signal fluorescent. </li><li> Déshydrater cerveaux perfusés en les transférant dans un pot de cerveau contenant 30 ml d&#39;une solution de saccharose à 20% dans une solution saline tamponnée phosphate (1x) pour un minimum de 2 jours ou jusqu&#39;à ce que le cerveau coule au fond du pot de cerveau. </li><li> Utiliser un microtome coulissant congélation pour faire des coupes de cerveau coronale (20-40 um) dans toute l&#39;étendue rostrocaudal de la région d&#39;intérêt. </li><li> Mener immunohistochimie dirigé contre le récepteur étiqueté ou la protéine rapporteur pour déterminer l&#39;emplacement et l&#39;expression du récepteur de concepteur et / ou rapporteur 12. Un protocole de coloration immunohistochimique est fourni sur la page des ressources DREADD wiki 25. </li><li> Montez les sections sur des lames et lamelle SuperFrost-plus à l&#39;aide de 100-200 ul d&#39;un milieu de montage aqueux. </li><li> Effectuer la microscopie à fluorescence sur le tissu du cerveau de vérifier le placement de l&#39;AAV et l&#39;expression des protéines 12,24.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Ce protocole décrit comment appliquer une approche pharmacogénétique (DREADD) d&#39;étudier comment une région spécifique du cerveau contribue à une tâche d&#39;apprentissage complexe multi-phase. Avec la possibilité de faire taire temporairement et à distance l&#39;activité neuronale dans des régions discrètes du cerveau à travers les phases de l&#39;apprentissage, cette combinaison d&#39;approches fournit une plate-forme pour enquêter sur un large éventail de comportements, y compris les formes plus nuancées ou masqué...

Un défi passionnant dans le domaine de la neuroscience comportementale est de déterminer les substrats neuronaux de comportements complexes. Un certain nombre de techniques telles que des lésions permanentes au cerveau, l&#39;inactivation temporaire par implants de canules et optogénétique ont été utilisées pour identifier les contributions des régions discrètes du cerveau à sous-composantes de comportements complexes. Bien que ces approches informent notre compréhension de la spécificité régionale lors de l&#39;apprentissage, chaque technique est pas sans limites. Plus précisément, les lésions permanentes sont généralement menées avant le test comportemental, ainsi leurs effets sont présents tout au long de la durée du paradigme. études de canulation qui impliquent la présentation d&#39;un inactivateur de neurones à court terme (par exemple, la tétrodotoxine) peut produire des dommages importants aux tissus du cerveau et peut induire un stress chez les sujets juste avant les tests de comportement. En outre, l&#39;inactivation par insertion de canule est limitée à la région de tissu qui entoure lapointe de la canule. Enfin, tout en optogénétique propose une gamme de flexibilité pour le contrôle temporel de l&#39;activité dans des régions spécifiques du cerveau, il est coût prohibitif et techniquement exigeant. Ces limitations peuvent être surmontées en utilisant une approche pharmacogénétique (Designer-récepteurs-Exclusivement-Activé par Designer-drogues, DREADDs) 1,2. Surtout, alors que le concept de la pharmacogénétique est sophistiqué, l&#39;exécution de la technique est simple. Similaires à des méthodes chirurgicales stéréotaxiques traditionnels qui impliquent infusion de la toxine (par exemple, NMDA, l&#39;acide iboténique) dans les régions du cerveau discrètes, cette technique implique l&#39;infusion d&#39;un virus adéno-associé (AAV) qui contient un fragment d&#39;ADN d&#39;un récepteur du G-protéine inhibitrice modifié couplée (hM4Di; le récepteur de designer) dans la région d&#39;intérêt des rongeurs de laboratoire standard (voir Figure 1). Le vecteur viral contient également un rapporteur fluorescent (de mcitrine). Une fois incorporé danspour les cellules, le récepteur de concepteur (et protéine rapporteur) sont au maximum exprimé ~ 3 semaines après la perfusion et peuvent être activés sélectivement pour 2-5 heures par l&#39;administration systémique du médicament concepteur contraire biologiquement inerte, la clozapine N-oxyde (CNO) 1 , 3. Parce que l&#39;expérimentateur est doté de contrôle temporel précis, encore à distance sur l&#39;activité neuronale dans des régions spécifiques du cerveau, la pharmacogénétique combine particulièrement bien avec les paradigmes comportementaux qui sont menées en plusieurs phases. Dans cet exemple, la contribution du cortex rétrosplénial (RSC) au stimulus stimulus apprentissage est comparé à son rôle dans l&#39;apprentissage pavlovien, mais cette combinaison d&#39;approches est bien adapté à un certain nombre de questions qui visent à déterminer comment les régions spécifiques du cerveau contribuent à comportement complexe. En outre, bien que non décrite dans le présent protocole, les approches virales et transgéniques peuvent être utilisés pour atteindre cellule spécifique de type DREADD expression 2. Comme is inhérente à paradigmes comportementaux qui impliquent pharmacologiques et / ou d&#39;autres types de manipulations expérimentales, un examen attentif de la conception expérimentale et l&#39;analyse quantitative ultérieure est nécessaire lors de l&#39;utilisation de l&#39;approche DREADD. Expérimentateurs nouvelles à l&#39;approche DREADD sont renvoyés à un examen complet de la technologie de DREADD actuelle 2. Chaque jour, les organismes apprennent de nouveaux stimuli et les événements et leurs relations les uns aux autres. Même dans un environnement familier, comme la maison, on est prompt à détecter des altérations dans les relations entre les stimuli parce que ces changements peuvent être un facteur prédictif d&#39;événements significatifs. Tel stimulus stimulus (ie, relationnelle) apprentissage implique la conjonction de multiples stimuli et a toujours été associée à l&#39;hippocampe, qui réside au centre du lobe temporal médial 4. Cependant, ne existe pas l&#39;hippocampe, ni agir dans l&#39;isolement; régions corticales à l&#39;intérieur et à l&#39;extérieurcôté du lobe temporal médian fournir des informations sensorielles critique pour la formation hippocampique 7.5. Études de lésions permanentes traditionnels fournissent des preuves convaincantes de la participation d&#39;un certain nombre de régions corticales (par exemple, les cortex rétrosplénial, postrhinal et entorhinal) dans l&#39;apprentissage de l&#39;hippocampe-dépendante, mais sont limités dans leur capacité à discerner le rôle d&#39;une région en particulier lors des phases distinctes de apprentissage 8-10. Le présent protocole teste l&#39;hypothèse que la SRC est nécessaire pour l&#39;apprentissage de stimulus-relance en faisant taire la SRC au cours d&#39;une seule phase d&#39;un 3-phase de préconditionnement sensorielle paradigme 11,12. En bref, les rats reçoivent des perfusions d&#39;un AAV qui contient le récepteur de concepteur et ~ 3 semaines plus tard sont administré le concepteur médicament (CNO) 30 min avant le début des tests comportementaux. Dans le présent protocole, les rats expérimentaux reçoivent CNO lors de la première phase de test (lorsque stimulus stimulus LearNing se produit) et ils reçoivent véhicule pendant les deux prochaines phases de test. Pour contrôler les effets involontaires des CNO sur le comportement, infuser rats avec le récepteur de concepteur (hM4Di) et injecter avec le véhicule à la place du CNO. Pour tenir compte des effets généraux de perfusion virale et l&#39;expression du récepteur, insuffler un virus de contrôle qui ne contient pas le récepteur de concepteur et administrer CNO. Un certain nombre de différents serotypes de l&#39;AAV sont utilisées pour fournir le matériel génétique. Les NIH Guidelines actuelles pour la recherche impliquant recombinant ou des molécules synthétiques soutient que l&#39;AAV (tous les sérotypes) et constructions de AAV recombinants ou synthétiques, dans lequel le transgène ne code pas non plus un produit de gène potentiellement tumorigène ou une molécule de la toxine et sont produites en l&#39;absence d&#39;un virus auxiliaire, exige BSL-1 (groupe précautions Annexe B-1. risque 1 (RG1) Agents) 13. Un certain nombre de critiques se rapportant à la structure de l&#39;AAV, l&#39;utilité et la sécurité sont disponibles 14,15. En particulier, bien que, En raison de préoccupations relatives à 16,17 et potentiels mécanismes cancérogènes possibles sur la reproduction 18-20 chez les rongeurs, certains établissements exigent l&#39;utilisation de BSL-2 précautions lorsque vous travaillez avec AAV. Vérifiez la BSL appropriée avant d&#39;utiliser en consultation avec les comités de surveillance dans les établissements individuels où la recherche sera menée, les Centers for Disease Control et les lignes directrices des NIH pour la recherche impliquant l&#39;ADN recombinant molécules 13 lors de l&#39;utilisation de vecteurs viraux pour la manipulation génétique aux États-Unis. Les besoins en logement de protection individuelle, formation des enquêteurs, vecteur confinement, décontamination, l&#39;élimination des matériaux décontaminés, animales et post-injection sont spécifiées par ces directives. En outre, consulter et suivre appropriée institutionnel de protection des animaux et utilisation des lignes directrices du comité ou des directives équivalentes du comité de surveillance institutionnels pour assurer la manipulation, l&#39;administration et la disposition de l&#39;AAV.

<table><tbody><tr><td>Mâle, Long Evans Rats, 55-60 jours</td><td>Hilltop Lab Animals Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine</td><td>Virus Vector Core</td><td></td><td>Attention : Il s’agit d’un composé BSL-1</td></tr><tr><td>rAAV8/hSyn-GFP</td><td>Virus Vector Core</td><td></td><td>Attention : Il s’agit d’un composé BSL-1</td></tr><tr><td>Clozapine-N-oxide</td><td>R& D Systems</td><td>4936-10</td><td>Médicament de synthèse</td></tr><tr><td>Couvercle de cage à rats (polycarbonate)</td><td>Conception alternative&nbsp ;</td><td>FT 8XL-PC</td><td>Utilisé pour couvrir les cages d’animaux 48-72 heures après la perfusion</td></tr><tr><td>Papier filtre (remplacement)</td><td>Conception alternative</td><td>FP-R-1018XAD</td><td>Papier filtre qui va avec les couvercles de cage</td></tr><tr><td>Étau de table</td><td>JETS</td><td>2201-265</td><td>Pour maintenir des tubes de microscentrifugeuse contenant des AAV dans la hotte</td></tr><tr><td>Sacs poubelles pour risques biologiques</td><td>Agrafes</td><td>113444</td><td>Doublures pour risques biologiques Medline</td></tr><tr><td>Poubelle pour risques biologiques</td><td></td><td></td> Amazon.com <td>United Solutions Poubelle rectangulaire à roulettes de 34 gallons avec crochet et poignée</td></tr><tr><td>Isoflurane, 100 ml</td><td>Patterson Veterinary Supply Inc.</td><td>07-890-8540</td><td>Anesthésique</td></tr><tr><td>Double petit animal stéréotaxique avec console de lecture à affichage numérique</td><td>David Kopf</td><td>Modèle 942</td><td>Matériel chirurgical</td></tr><tr><td>Barres d’oreille non rompues, lot de 2 (rat)</td><td>David Kopf</td><td>Modèle 955</td><td>Matériel chirurgical</td></tr><tr><td>Masque d’anesthésie (rat)</td><td>David Kopf</td><td>Modèle 906</td><td>Matériel</td></tr> <tr><td>chirurgicalLa perceuse stéréotaxique à grande vitesse comprend un contrôleur de moteur de table, une pédale, une pièce à main, un porte-pièce à main stéréotaxique</td><td>David Kopf</td><td>Modèle 1474</td><td>Équipement chirurgical</td></tr><tr><td>Fraises Microdrill, 0,9 mm</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>19007-09</td><td>Alimentation chirurgicale</td></tr><tr><td>Pousse-seringue automatisé avec contrôleur micro4</td><td>David Kopf</td><td>Modèle UMP3-1</td><td>Équipement chirurgical</td></tr><tr><td>Lame en céramique amovible Pro-animal kit de tondeuse</td><td>Ahdis</td><td>21420</td><td>Approvisionnement chirurgical</td></tr><tr><td>Nettoyant pour la peau à la bétadine</td><td>Perdue Products L.P</td><td>67618-149-04</td><td>Approvisionnement chirurgical</td></tr><tr><td>Pommade antibiotique triple</td><td>Medline Supply</td><td>53329-087-01</td><td>Approvisionnement chirurgical</td></tr><tr><td>Puralube vetent</td><td>Only Approvisionnement vétérinaire</td><td>17033-211-38</td><td>Approvisionnement chirurgical</td></tr><tr><td>Dino-lite</td><td>Microscope</td><td>AD7013MTL</td><td>Une alternative à la lunette de disection traditionnelle</td></tr><tr><td>Dino-lite support de table rigide</td><td>Microscope</td><td>MS36B</td><td>Matériel chirurgical</td></tr><tr><td>28 G 10 &mu ; l seringue</td><td>Hamilton</td><td>80308-701SN</td><td>Équipement chirurgical</td></tr><tr><td>Cabine d’insonorisation MDF extra haute</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-018MD</td><td>22' L x 22 » H x 16 » P</td></tr><tr><td>Chambre d’essai modulaire extra haute</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-007</td><td>Équipement comportemental</td></tr><tr><td>Sol en grille en acier inoxydable</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-005</td><td>Équipement</td></tr> <tr><td>comportementalLumière de maison</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-215M</td><td>Utilisé comme lumière de maison et lampe de stimulation</td></tr><tr><td>Distributeur de granulés modulaire</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-203M-45</td><td>Équipement comportemental</td></tr><tr><td>Réceptacle à granulés, type tasse</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-200R1M</td><td>Équipement comportemental</td></tr><tr><td>Détecteur d’entrée de tête pour rat</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-254-CB</td><td>Équipement comportemental</td></tr><tr><td>Granulés alimentaires de précision sans poussière, 45 mg</td><td>Bio-Serv</td><td>F0165</td><td>Alimentation comportementale</td></tr><tr><td>Haut-parleur de cage pour chambre à rats</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ENV-224AM</td><td>Équipement comportemental</td></tr><tr><td>Générateur audio programmable</td><td>Med Associates, Inc</td><td>ANL-926</td><td>Équipement comportemental</td></tr><tr><td>Boîtier intelligent ctrl 8 entrées/16 sorties</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-716P2</td><td>Équipement comportemental</td></tr><tr><td>Grande armoire de table et bloc d’alimentation</td><td>Med Associates, Inc</td><td>SG-6510D</td><td>Équipement comportemental</td></tr><tr><td>Package d’interface PCI</td><td>Med Associates, Inc</td><td>DIG-700P2-R2</td><td>Équipement comportemental</td></tr><tr><td>Ordinateur central MED Intel avec moniteur X Pro 19"</td><td>Med Associates, Inc</td><td>COM-103V</td><td>Équipement comportemental</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (grannulaire), 1 kg</td><td>Microsopie électronique Sciences</td><td>19210</td><td>Danger : cancérogène, peser dans la capuche</td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal de lapin (HA-Tag)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>3724S</td><td>Réactif d’histologie</td></tr><tr><td>XP Anticorps monoclonal de lapin (GFP)</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>2956S</td><td>Réactif d’histologie</td></tr><tr><td>Anti-IgG de lapin</td><td>Cell Signaling Technologies</td><td>4412S</td><td>Fournitures d’histologie</td></tr><tr><td>Superfrost plus lames</td><td>VWR international</td><td>483111-703</td><td>Fournitures d’histologie</td></tr></tbody></table>

une méthode de distance silencing activité neuronale chez les rongeurs pendant phases distinctes de l&#39;apprentissage

A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning

Ce protocole décrit comment faire taire temporairement et à distance l&#39;activité neuronale dans des régions discrètes du cerveau tandis que les animaux sont engagés dans des tâches d&#39;apprentissage et de mémoire. L&#39;approche combine la pharmacogénétique (Designer-récepteurs-Exclusivement-Activé par Designer-drogues) avec un paradigme comportemental (préconditionnement sensorielle) qui est conçu pour distinguer entre les différentes formes d&#39;apprentissage. Plus précisément, la livraison médiée viral est utilisé pour exprimer un récepteur du G-protéine inhibitrice génétiquement modifié couplé (designer Receptor) dans une région du cerveau discret dans le rongeur. Trois semaines plus tard, lorsque les niveaux d&#39;expression des récepteurs de concepteur sont élevés, un agent pharmacologique (designer drogues) est administré par voie systémique 30 min avant une session de comportement spécifique. Le médicament a une affinité pour le récepteur de créateur et, par conséquent conduit à l&#39;inhibition des neurones qui expriment le récepteur de concepteur, mais est par ailleurs biologiquement inerte. La région du cerveau reste réduit au silence pour 2-5 heures (Depending de la dose et la voie d&#39;administration). À la fin du paradigme comportemental, le tissu cérébral est évaluée pour le placement correct et l&#39;expression du récepteur. Cette approche est particulièrement utile pour déterminer la contribution des différentes régions du cerveau à des composants spécifiques de comportement et peut être utilisé dans un certain nombre de paradigmes comportementaux.

Résultats de comportement À la fin de l&#39;expérience, l&#39;efficacité de l&#39;inactivation temporaire spécifique à la région doit être évaluée quantitativement et qualitativement. Le présent exemple concerne un paradigme trois phases du comportement (préconditionnement sensoriel), dans lequel CNO a été administrée afin d&#39;atténuer l&#39;activité neuronale dans le RSC pendant les sessions de préconditionnement pour tester l&#39;hypothèse que la SRC est nécessaire pour la formation d&#39;a...

Ce protocole décrit comment réduire temporairement et à distance l’activité neuronale dans des régions cérébrales discrètes pendant que les rats sont engagés dans des tâches d’apprentissage et de mémoire. L’approche combine la pharmacogénétique (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) avec un paradigme comportemental (préconditionnement sensoriel) conçu pour distinguer les différentes composantes de l’apprentissage.

Une méthode de distance Silencing activité neuronale chez les rongeurs Pendant phases distinctes de l&#39;apprentissage

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while animals are engaged in learning and ...

L'objectif de cette procédure est de bloquer temporairement et à distance l'activité neuronale dans des régions cérébrales spécifiques pendant que les animaux effectuent des tâches d'apprentissage et de mémoire. Cela est réalisé en chargeant d'abord un V a a contenant un récepteur conçu sur mesure et un marqueur dans une seringue pour perfusion. La deuxième étape consiste à perfuser un V a a dans la région d'intérêt du cerveau du rat.Ensuite, le médicament synthétique biologiquement inerte, la clozapine et son oxyde, est préparé et injecté systémiquement dans le rat. L'étape finale consiste à réaliser des tests comportementaux à l'aide d'un paradigme de conditionnement sensoriel préalable. Enfin, une microscopie par immunofluorescence sur le tissu cérébral du rat est utilisée pour vérifier le positionnement du récepteur synthétique.Cette méthode peut aider à répondre à des questions essentielles dans le domaine des neurosciences comportementales, notamment, sans s'y limiter, la régulation de la motivation, de l'attention, ainsi que des processus d'apprentissage et de mémoire. Veillez à respecter toutes les précautions institutionnelles relatives à l'utilisation des virus adéno-associés tout au long de l'expérimentation ; le virus utilisé dans cette vidéo est classé comme un composé de niveau de biosécurité 1. Préparez une solution d'eau de Javel à 10 %. Pour la décontamination des déchets, prévoyez un récipient contenant de la solution d'eau de Javel et une seringue stérile de 10 microlitres.Dans l'espace de travail, placez le tube de microcentrifugeuse contenant un aliquot de a V dans un étau de laboratoire standard. Chargez une seringue de 10 microlitres avec au moins quatre microlitres de a A v. Veillez à ce qu'il n'y ait aucune bulle d'air dans les quatre microlitres de solution de a a v. Jetez le tube de virus vide dans le bécher contenant de l'eau de Javel à 10 % à l'aide de la seringue.Ajouter une solution supplémentaire de 10 % d'eau de Javel au récipient des déchets, et laisser reposer les déchets pendant 30 minutes avant d'éliminer les déchets liquides désinfectés conformément aux directives institutionnelles. Préparer la zone chirurgicale en plaçant du papier absorbant sur la paillasse sous l'appareil stéréotaxique et dans un espace adjacent désigné comme zone dédiée à la manipulation des virus. Après l'induction de l'anesthésie par 3 % d'isoflurane, de fluor et d'oxygène à un débit d'un litre par minute.Raser le pelage entre les yeux jusqu’un peu derrière les oreilles. Après le rasage, replacer le rat dans la chambre d’induction pendant trois minutes, le rat étant fixé dans un appareil stéréotaxique. Couvrir les yeux avec une pommade ophtalmique et préparer le site d’incision en le nettoyant avec du Bétadine.Après avoir pratiqué une incision médiane de 2,4 centimètres de la peau, recouvrant le crâne, en partant d'environ deux millimètres caudaux aux yeux, rétracter la peau pour exposer le crâne, puis enlever le tissu membraneux du crâne jusqu'à ce que le bgma et le lambda soient clairement visibles. Une fois que le crâne est bien plat, positionner la fraise sur le bgma, mettre les coordonnées à zéro, puis déplacer la fraise aux coordonnées médiale, latérale et antéro-postérieure souhaitées. Perforer un trou à l’aide d’un foret de 0,9, 0,7 ou 0,5 millimètre.Régler la pompe d'infusion pour délivrer le virus à un débit de 0,2 microlitres par minute. Placer la seringue dans le bras d'infusion du dispositif stéréotaxique et abaisser la seringue jusqu'aux coordonnées souhaitées. Utiliser la pompe pour délivrer la quantité souhaitée de virus une fois la délivrance des virus terminée.Laisser la seringue en place pendant 10 minutes afin d'éviter un reflux dans l'aiguille, puis remonter lentement la seringue à une vitesse d'environ cinq millimètres par minute. Ensuite, passer à la coordonnée suivante et répéter la procédure jusqu'à ce que toutes les coordonnées aient été perfusées avec un aav. Après la fermeture de la plaie et l'administration d'une analgésie postopératoire conformément au protocole approuvé, placer le rat dans une cage propre contenant de la litière, un couvercle et une signalisation appropriée.Lorsque le rat est complètement remis de l'anesthésie, le ramener dans la salle d'hébergement. Attendre trois semaines ou plus avant de commencer les tests comportementaux afin de garantir une expression adéquate du récepteur conçu. Cette figure illustre les trois phases du paradigme de conditionnement sensoriel préalable : la phase de préconditionnement, la phase de conditionnement et la phase de test.La drogue de conception, la clozapine-N-oxyde ou CNO, est utilisée pour inhiber l'activité neuronale. En activant le récepteur conçu, le CNO peut être injecté avant n'importe quelle phase de test. Ici, le CNO est injecté 30 minutes avant chacune des séances de conditionnement. Après avoir préparé une solution fraîche de un milligramme par millilitre de clozapine-N-oxyde, conformément aux instructions figurant dans la partie écrite du protocole, injecter le CNO par voie intrapéritonéale à une dose de un milligramme par kilogramme, 30 minutes avant le test comportemental.Lancez le code informatique pour la session comportementale appropriée. Après 30 minutes, placez les rats dans les chambres de test et commencez la première des quatre séances de préconditionnement de 64 minutes en présentant aux rats 12 essais intercalés composés de stimuli auditifs et visuels. Lors de six essais, présentez un ton, le stimulus préconditionnant, pendant 10 secondes, suivi immédiatement par une présentation de cinq secondes du stimulus lumineux clignotant lors des six autres essais.Présentez le bruit blanc, le stimulus non diffusé seul, pendant 10 secondes. À l’issue de la phase de préconditionnement, commencez les séances de conditionnement, qui seront réalisées sur cinq jours consécutifs. Présentez aux rats huit essais composés de la présentation du stimulus visuel, la lumière clignotante pendant cinq secondes, suivie immédiatement de l’administration de 2 granulés alimentaires de 45 milligrammes.Cette fois, inclure des intervalles inter-essais de sept minutes lorsque les séances de conditionnement sont terminées. Réaliser la séance de test unique de 78 minutes en présentant aux rats 12 essais intercalés, constitués de la présentation des stimuli auditifs seuls. Sur six des essais.Présentez le stimulus sonore, le stimulus préconditionné seul pendant 10 secondes. Lors des six autres essais, présentez le bruit blanc, le stimulus non apparié seul pendant 10 secondes. À l’achèvement de la tâche comportementale, retirez immédiatement les rats des compartiments et ramenez-les à la colonie animale.Analyser les données provenant des phases de conditionnement et de test conformément aux instructions détaillées dans la partie écrite du protocole. Après avoir effectué une immunohistochimie dirigée contre le marqueur rapporteur ou la protéine rapportrice, examiner les sections colorées par microscopie afin de déterminer la localisation et l'expression du récepteur conçu et/ou du rapporteur, comme prévu. Les rats témoins et expérimentaux ont appris de façon similaire l'association pavlovienne entre le stimulus lumineux clignotant et la nourriture au cours des séances de conditionnement.Lors des séances, les deux groupes étaient également motivés à obtenir une récompense alimentaire pendant la séance de conditionnement. En revanche, lors de la séance de test cruciale, les rats expérimentaux n'ont pas réussi à discriminer entre les stimuli auditifs préconditionnés et ceux qui ne l'étaient pas, tandis que les rats témoins présentaient un comportement accru au niveau du récipient à nourriture en réponse à la présentation du stimulus préconditionné. Ainsi, seul le groupe témoin, et non le groupe expérimental, a montré l'effet de préconditionnement sensoriel.Cette image montre la vérification histologique de l'emplacement d'une perfusion intraveineuse dans la région d'intérêt du cerveau de rongeur après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs en neurosciences pour explorer les contributions de régions cérébrales spécifiques et/ou de types cellulaires particuliers aux comportements complexes in vivo.

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Behavior

Comportement

Dans ce rapport, nous présentons un système entièrement automatisé et hautement polyvalent, capable de tester simultanément plusieurs cognitifs des comportements et enregistrer les activités neuronales pour les rongeurs.

Un système entièrement automatisé et hautement polyvalent pour Test Multi-Fonctions cognitives et l&#39;enregistrement des activités neuronales chez les rongeurs

Placez un chiot nouveau-né anesthésié sur un coussin chauffant.Désinfectez le cuir chevelu avec de l’éthanol.Remplissez une seringue avec une solution virale contenant des virus adéno-associés portant le gène d’un récepteur inhibiteur activé par un médicament et d’un colorant de suivi.Alignez l’embout de la seringue avec la tête du chiot et injectez lentement le virus dans le cerveau pour une distribution uniforme.Laissez le chiot récupérer.Pendant l’incubation, les particules virales pénètrent...

Inhibition chimiogénétique de l’activité neuronale chez une souris néonatale

Source : Lai, J., et al. Enregistrement électrophysiologique simultané et micro-injections d’agents inhibiteurs dans le cerveau des rongeurs. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo démontre une technique basée sur la micro-injection pour l’enregistrement neuronal simultané et l’inhibition dans le colliculus supérieur du rat. La procédure implique un ciblage stéréotaxique, un forage du crâne et l’insertion d’un injectrode, qui délivre un neurotransmetteur inhibiteur tout en enregistrant l’activité...

Inhibition de l’activité neuronale et sa détection par électrophysiologie chez le rat

Un protocole entièrement automatisé pour rongeur conditionnement opérant est proposé. Le protocole repose sur le contrôle temporel précis des événements de comportement pour enquêter sur la mesure dans laquelle les expériences influences ce contrôle l'activité sous-jacente de neurones d'intégration sensori-motrice et de contrôle cognitif.

Un protocole conditionné rongeurs entièrement automatisé pour sensorimotrice intégration et expériences de contrôle cognitif

Apprendre de nouvelles associations stimulus-réponse engage un large éventail de processus neuronaux qui sont finalement pris en compte dans l'évolution sortie de pic de neurones individuels. Nous décrivons ici un protocole de comportement permettant un enregistrement continu de l'activité unique neurone tandis que les animaux acquièrent, éteindre, et réacquérir une réponse conditionnée dans une seule session expérimentale.

L&#39;enregistrement des potentiels d&#39;action unique neurones de se déplacer librement à travers Pigeons Trois étapes de l&#39;apprentissage

Ici, nous fabriquons une pipette en verre avec une double fonction : l’inhibition des structures cérébrales profondes par des micro-injections de médicaments et le suivi en temps réel de leurs effets grâce à des enregistrements électrophysiologiques simultanés.

Simultanée électrophysiologique Enregistrement et micro-injections d&#39;agents inhibiteurs dans le cerveau des rongeurs

Navette boîte éviter l'apprentissage est bien établi en neuroscience comportementale. Ce protocole décrit comment navette boîte apprentissage chez les rongeurs peut être combiné avec microstimulation site spécifique électrique intracorticale (ICMS) et chronique simultanée dans les enregistrements vivo comme un outil pour étudier plusieurs aspects de l'apprentissage et de la perception.

Combiné navette-Box formation avec électrophysiologique Cortex enregistrement et la stimulation comme un outil pour étudier perception et l&#39;apprentissage

Stimulation du nerf vague (VNS) a émergé comme un outil pour induire la plasticité synaptique ciblée dans le cerveau antérieur de modifier une gamme de comportements. Ce protocole décrit comment mettre en œuvre VNS pour faciliter la consolidation de la mémoire la peur de l'extinction.

Stimulation du nerf vague comme un outil pour induire la plasticité dans les voies pertinentes pour l&#39;extinction d&#39;apprentissage

Nous présentons des méthodes de construction d’électrodes pour enregistrer simultanément l’activité neuronale extracellulaire et libérer plusieurs substances neuroactives au voisinage des sites d’enregistrement chez les souris éveillées. Cette technique permet l’analyse détaillée des entrées synaptiques locales présumées vers le neurone d’intérêt.

Extracellulaires enregistrement de l&#39;activité neuronale Combiné avec Microiontophoretic Application des substances neuroactifs chez la souris Awake

La conception et l'assemblage de micromoteurs pour des enregistrements électrophysiologiques in vivo des signaux du cerveau de la souris est décrite. En attachant des faisceaux de microélectrodes aux transporteurs carrossables robustes, ces techniques permettent des enregistrements de neurones à long terme et stable. Le design léger permet une performance comportementale sans restriction par l'animal implantation d'entraînement suivant.

Construction de tableaux Microdrive pour les enregistrements de neurones chroniques chez la souris Behaving Awake

Découvrez une méthode de pharmacogénétique pour inhiber l'activité neuronale chez le rat pendant l'apprentissage. Cette technique combine virus AAV, clozapine-N-oxyde et paradigme de conditionnement sensoriel pour étudier les mécanismes cérébraux de la mémoire.

Une méthode de distance Silencing activité neuronale chez les rongeurs Pendant phases distinctes de l'apprentissage

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