Une méthode de distance Silencing activité neuronale chez les rongeurs Pendant phases distinctes de l'apprentissage

L’objectif de cette procédure est de faire taire temporairement et à distance l’activité neuronale dans des régions cérébrales discrètes pendant que les animaux sont engagés dans des tâches d’apprentissage et de mémoire. Pour ce faire, il faut d’abord charger le a a V qui contient un récepteur concepteur et un rapporteur dans une seringue pour la perfusion. La deuxième étape consiste à infuser un a V dans la région d’intérêt dans le cerveau du rat.

Ensuite, la clozapine et l’oxyde, un médicament de synthèse biologiquement inerte, sont préparés et injectés systématiquement dans le rat. La dernière étape consiste à effectuer des tests comportementaux à l’aide d’un paradigme de préconditionnement sensoriel. En fin de compte, la microscopie par immunofluorescence sur le tissu cérébral du rat est utilisée pour vérifier l’emplacement du récepteur concepteur.

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences comportementales, y compris, mais sans s’y limiter, la régulation de la motivation, de l’attention, de l’apprentissage et de la mémoire Assurez-vous que toutes les précautions institutionnelles pour travailler avec des virus adéno-associés sont suivies tout au long du virus utilisé dans cette vidéo est classé comme un composé de biosécurité de niveau un. Préparez une solution d’eau de Javel à 10 %. La décontamination d’une déchetterie, d’un bega contenant une solution d’eau de Javel et une seringue stérile de 10 microlitres.

Dans l’espace de travail, placez le tube de micro-centrifugeuse contenant une aliquote de a a V dans un étau de paillasse standard Load, une seringue de 10 microlitres avec au moins quatre microlitres de a a v. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans les quatre microlitres d’une solution a v. Dans la seringue, jetez le tube à virus vide dans le bécher contenant 10 % d’eau de Javel.

Ajoutez 10 % d’eau de Javel supplémentaire dans le conteneur à déchets et laissez reposer les déchets pendant 30 minutes avant de jeter les déchets liquides décontaminés comme spécifié par les directives institutionnelles. Préparez la zone chirurgicale en plaçant du papier de banc absorbant sous l’appareil stéréotaxique et dans un espace adjacent désigné comme zone de manipulation des virus. Après avoir induit l’anesthésie, il y avait 3 % d’isode, de fluor et d’oxygène à raison d’un litre par minute.

Rase la fourrure d’entre les yeux jusqu’à légèrement derrière les oreilles. Après le rasage, remettez le rat dans la chambre d’induction pendant trois minutes avec le rat fixé dans un appareil stéréotaxique. Couvrez les yeux avec une pommade ophtalmique et préparez le site d’incision en nettoyant avec de la bétadine.

Après avoir pratiqué une incision médiane de 2,4 centimètres de la peau, recouvrant le crâne, en commençant par un cordon d’environ deux millimètres jusqu’aux yeux, rétractez la peau pour exposer le crâne, puis dégagez le tissu membraneux du crâne jusqu’à ce que bgma et lambda soient clairement visibles. Après vous être assuré que le crâne est plat, positionnez la perceuse à bgma, mettez les coordonnées à zéro, puis déplacez la perceuse aux coordonnées médiales, latérales et postérieures antérieures souhaitées. Percez un trou à l’aide d’un foret de 0,9, 0,7 ou 0,5 millimètre.

Réglez la pompe à perfusion pour qu’elle libère le virus à un rythme de 0,2 microlitre par minute. Insérez la seringue dans le bras de perfusion de l’appareil stéréotaxique et abaissez la seringue à la coordonnée souhaitée. Utilisez la pompe pour délivrer la quantité souhaitée de virus une fois la livraison des virus terminée.

Laissez la seringue en place pendant 10 minutes pour éviter le reflux dans l’aiguille, suivez le suivi, soulevez lentement la seringue à une vitesse d’environ cinq millimètres par minute. Passez ensuite à la coordonnée suivante et répétez la procédure jusqu’à ce que toutes les coordonnées aient été imprégnées d’un a v. Après avoir refermé la plaie et administré une analgésie postopératoire conformément au protocole approuvé, placez le rat dans une cage propre avec une litière, un couvercle et une signalisation appropriée.

Lorsque le rat est complètement rétabli de l’anesthésie, remettez-le dans la salle d’hébergement. Attendez trois semaines ou plus avant de commencer les tests comportementaux pour assurer une expression adéquate du récepteur concepteur. Cette figure montre les trois phases du paradigme du préconditionnement sensoriel, la phase de préconditionnement, la phase de conditionnement et la phase de test.

Le médicament de synthèse, la clozapine et l’oxyde ou CNO, est utilisé pour faire taire l’activité neuronale En activant le récepteur de conception, le CNO peut être injecté avant toute phase du test. Ici, le CNO est injecté 30 minutes avant chacune des séances de préconditionnement. Après avoir préparé une solution fraîche d’un milligramme par millilitre de clozapine et d’oxyde, conformément aux instructions de la partie écrite du protocole, injectez le CNO intrapéritonéal à une dose d’un milligramme par kilogramme 30 minutes avant le test comportemental.

Lancez le code informatique pour la session comportementale appropriée. Après 30 minutes, placez les rats dans les chambres d’essai et commencez la première des 4 séances de préconditionnement de 64 minutes en présentant aux rats 12 essais mixtes qui consistent en l’administration de stimuli auditifs et visuels. Dans six des essais, le stimulus de précondition est tonifié pendant 10 secondes, suivi immédiatement d’une présentation de cinq secondes du stimulus de la lumière clignotante dans les six autres essais.

Présentez le bruit blanc, le stimulus non aéré seul pendant 10 secondes. Une fois la phase de préconditionnement terminée, commencez les séances de conditionnement, qui se dérouleront sur cinq jours consécutifs. Présentez aux rats huit essais qui consistent en l’administration du stimulus visuel, la lumière clignotante pendant cinq secondes suivie immédiatement de l’administration de 2 granulés de nourriture de 45 milligrammes.

Ce temps comprend des intervalles entre les essais qui durent sept minutes lorsque les séances de conditionnement sont terminées. Effectuez la séance d’essai unique de 78 minutes en présentant aux rats 12 essais mixtes qui consistent en l’administration des stimuli auditifs seuls. Sur six des essais.

Présentez le stimulus de tonalité, le stimulus de précondition seul pendant 10 secondes. Sur les six autres essais, présentez le bruit blanc, le stimulus non apparié seul pendant 10 secondes. Une fois la tâche comportementale terminée, retirez immédiatement les rats des chambres et retournez-les à la colonie animale.

Analyser les données de la phase de conditionnement et de test selon les instructions détaillées de la partie écrite du protocole. Après avoir effectué une immunohistochimie dirigée contre le rapporteur marqué ou la protéine rapporteure, examinez les sections de coloration par microscopie pour déterminer l’emplacement et l’expression du récepteur concepteur et/ou du rapporteur comme prévu, le contrôle et les rats expérimentaux ont également appris l’association pavlovienne entre le stimulus de la lumière clignotante et la nourriture. Pendant les séances de conditionnement.

Les deux groupes étaient également motivés pour obtenir une récompense alimentaire pendant la séance de conditionnement. En revanche, au cours de la session de test critique, les rats expérimentaux n’ont pas réussi à faire la distinction entre les stimuli auditifs préconditionnés et non aériens, tandis que les rats témoins montrent un meilleur comportement en réponse aux présentations du stimulus pré-conditionné. Ainsi, des rats témoins, mais non expérimentaux, ont montré l’effet de préconditionnement sensoriel.

Cette image montre une vérification histologique de l’emplacement d’une perfusion a v dans la région d’intérêt dans le cerveau du rongeur après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer les contributions de régions cérébrales spécifiques et/ou de types cellulaires à un comportement complexe in vivo.