Name: Lisolement et la propagation des cellules tumorales circulantes dun cancer Modèle Souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Apprenez à isoler et propager des cellules tumorales circulantes à partir du sang total d'un modèle de souris syngénique avec métastase d'hépatocarcinome. Cette technique fournit un modèle reproductible pour la recherche sur la métastase.

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Le travail dans le laboratoire du Dr Ogunwobi est soutenu par une subvention du programme des centres de recherche dans les institutions minoritaires de l’Institut national sur la santé des minorités et les disparités en matière de santé (MD007599) des Instituts nationaux de la santé. Le contenu de ce manuscrit relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles du NIMHD ou du NIH.

Déclaration éthique: Toutes les études sur les animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) du Hunter College de la City University de New York. 1. Procédures pré-expérimentation <ol><li> À l&#39;arrivée à l&#39;animalerie, Maison initialement 3 souris BALB / c à une cage avec une literie de haut et de copeaux de bois filtré. Veiller à ce que les souris ont un accès libre à la nourriture, nourriture pour rongeurs Purina, et de l&#39;eau. Literie et la nourriture doivent être changés deux fois par semaine, alors que les cages doivent être nettoyés une fois par semaine. </li><li> Induire une anesthésie générale chez la souris en utilisant un vaporisateur isoflurane avec de l&#39;oxygène à un débit constant de 1 litre par minute. Le système est autonome et comprend un vaporisateur de précision. </li><li> Position animal dans une boîte en plastique sur lequel le vaporisateur de précision et / système de gaz anesthésique est connecté. Initialement fixé le vaporisateur à 2,5 jusqu&#39;à ce que l&#39;animal est inconscient, à quel point réduire le vaporisateur à 2. </li><li> À ce moment, mettez leLigne de soupape, en le scellant à la surface, et l&#39;ouvrir pour le cône de nez. </li><li> Déplacez l&#39;animal à la zone de préparation, avec le cône de nez placé et raccordé correctement (pour entretien de l&#39;anesthésie). </li><li> Préparer 5 × 10 6 cellules HCC de la souris BNL 1ME A.7R.1 pour l&#39;implantation par souris. BNL 1ME A.7R.1 devrait être de plus en plus dans le milieu (10% de FBS inactivé par la chaleur, 1% de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine) l&#39;incubation dans une boîte de culture de cellules à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec de l&#39;air et 5% CO 2. </li><li> Avec une seringue ayant une aiguille G 20, l&#39;implant 100 pi de PBS contenant 5 x 10 6 cellules de carcinome hépatocellulaire de souris BNL 1ME A.7R.1 dans un lobe de le foie des souris BALB / c pour produire les tumeurs primaires. Post-implantation, maison, les souris BALB / c dans une cage avec les mêmes exigences de maison comme pré-implantatoire. </li><li> Au point de fin d&#39;expérimentation, des signes cliniques de carcinome hépatocellulaire est observable comme réduction significative de la condition corporellemarquer (généralement détectée après 4 semaines). À ce stade, il est probable que les tumeurs primaires ont développé dans le foie tandis que les dépôts métastatiques ont formé dans les poumons. Par la suite, commence le procédé de l&#39;isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes. </li></ol> 2. Collecte de sang total pour la circulation des cellules tumorales Isolement REMARQUE: correctement filtrées la zone de la chirurgie et assurez-vous qu&#39;il est sans encombrement. Autoclave tous les instruments chirurgicaux ou faire tremper dans un désinfectant selon les recommandations du fabricant <ol><li> Sacrifiez souris par euthanasie au expérimentale point final (signes cliniques de développement de la tumeur). Euthanasie des souris devrait impliquer CO 2 asphyxie. Observez la souris correctement pour confirmer l&#39;anesthésie est correctement distribué. Le dioxyde de carbone doit être libéré lentement dans la chambre sur une période de 5 à 10 min, ce qui provoque un arrêt respiratoire. Suivez par exsanguination intracardiaque et cervical dislocation. 5 </li><li> Utiliser une aiguille 25 G fixée à une seringue de 1 ml pour la collecte de sang total. Heparanize la seringue avec 0,01 ml d&#39;héparine. Ponction immédiatement la peau avec l&#39;aiguille inférieur au xyphisternum à environ 45 ° d&#39;angle. Avancez lentement aiguille pour percer le cœur, puis abaissez l&#39;angle de l&#39;aiguille. Maintenir fermement l&#39;aiguille et la seringue en place, et d&#39;en tirer 500 pi - 1000 ul de sang entier du cœur. </li><li> Retirez la seringue et l&#39;aiguille et transférer le sang dans un tube apyrogène 1,5 ml pré-étiquetés. Centrifuger le sang total recueilli dans tube de 1,5 ml apyrogène à 1167 g pendant 5 min. REMARQUE: La centrifugation sépare l&#39;échantillon de sang en trois couches: la couche inférieure ou de l&#39;hématocrite constitué de globules rouges, une couche mince intermédiaire de couche leuco-plaquettaire, et une couche supérieure de plasma. </li><li> Retirer soigneusement le plasma par pipetage et la collecte dans un tube de 1,5 ml apyrogène séparé pour Furthexpériences telles que la détection des acides nucléiques sans cellules 7 RE. </li><li> Pour l&#39;isolement de cellules tumorales circulantes (CTC), de recueillir la couche leucocytaire dans un tube de 1,5 ml apyrogène séparée en préparation de globules rouges (RBC) lyse. Cela est nécessaire pour éliminer les globules rouges résiduels dans la couche leuco-plaquettaire. </li></ol> 3. Recette pour Red Blood Cell (RBC) tampon de lyse <ol><li> Ajouter une solution à 1 L de tampon de lyse RBC. </li><li> Faire un 500 ml de chlorure d&#39;ammonium et 500 ml de Tris. Puis mélanger pour créer une solution à 1 L de tampon de lyse RBC avec une concentration finale de 155 mM de chlorure d&#39;ammonium et 10 mM de Tris. </li><li> Tamponner la solution à un pH de 7,5. Conservez le tampon de lyse RBC à +2 et +8 ° C, et porter à RT immédiatement avant l&#39;utilisation. </li></ol> 4. RBC Lysis de Buffy Coat <ol><li> Ajouter 1 ml de tampon de lyse RBC au tube de 1,5 ml apyrogène stérile contenant la couche leucocyto-plaquettaire collectée. </li><li> Mélanger le contenu du tube parinverser plusieurs fois. Incuber le contenu mélangé du tube pendant 5 min à température ambiante sur le banc. Centrifuger les contenus mixtes pendant 5 min à 1167 x g. </li><li> Après centrifugation, un culot blanchâtre sera obtenu. Jeter le surnageant rougeâtre lentement et avec précaution dans l&#39;eau de Javel à 10% sans aucune interruption au culot. Si la pastille est pas blanchâtre, refaire les étapes 03.01 à 03.05. L&#39;augmentation de la durée d&#39;incubation dans un tampon de lyse RBC à 10 - 15 min peut également être utile. </li><li> Éliminer en toute sécurité les déchets biologiques, une fois la décontamination des déchets biologiques dans 10% de javel est complète après 24 h. </li></ol> 5. Propagation dans la culture cellulaire REMARQUE: Les cellules tumorales sont généralement des cellules en croissance rapide des globules blancs qui sont abondants dans le mélange initial de cellules ensemencées dans le plat. Suite à changement répété de support, et les passages subséquents de CTC, les globules blancs sont éliminés et une population relativement pur de CTC reste. <ol><li> Aprèsélimination du surnageant dans 10% d&#39;agents blanchissants, laver le culot dans une solution saline blanchâtre ml tamponnée au phosphate (PBS) au moins une fois, et remettre en suspension dans un milieu de culture complet pour une propagation dans la culture cellulaire. </li><li> Une fois lavage est terminée, ajouter 1 ml de milieu de culture complet A.7R.1 BNL 1ME (10% de FBS inactivé par la chaleur, 1% de pénicilline / streptomycine et 2 mM de L-glutamine) à la pastille et remise en suspension du culot dans du milieu de culture. </li><li> Ensemencer le mélange remis en suspension de cellules dans une boîte de culture cellulaire. Incuber la boîte de culture cellulaire à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec de l&#39;air et 5% de CO 2. </li><li> Changer le milieu de culture cellulaire toutes les deux à trois jours. Après cinq à sept jours, CTC aura adhéré à la boîte de culture cellulaire et a commencé à proliférer. Ces cellules vont rester viable au-delà de 25 passages et après plusieurs cycles gel et de dégel 5. </li></ol> 6. La vérification du carcinome hépatocellulaire circulation Tumor Cell Line <ol><li> Effectuer APolymerase réaction en chaîne (PCR) à base, pour amplifier un seul segment d&#39;ADN spécifique du gène β-globine souris pour confirmer que le roman a créé des lignées de cellules de la CCT sont des cellules de souris, comme la ligne BNL 1ME A.7R.1 HCC implanté originale. Méthode a été décrite et validée par Steube et al. 5,8 </li><li> Effectuer immunocoloration pour le spécifique hépatocytes marqueur AMPc protéine de liaison 3-like 3 (CREB3L3) en utilisant un anticorps spécifique élément sensible. Cela confirmera ce roman CTC sont en effet établies hépatocytes comme la ligne originale implanté des cellules BNL 1ME A.7R.1. 5 </li></ol>

<ol><li>Ashworth, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+case+of+cancer+in+which+cells+similar+to+those+in+the+tumors+were+seen+in+the+blood+after+death%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Medical+Journal%22%5BJournal%5D)">A case of cancer in which cells similar to those in the tumors were seen in the blood after death.</a> Australian Medical Journal. 1869, 146-147 (14).</li>
<li>van de Stolpe, A., den Toonder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+Tumor+Cells%3A+What+Is+in+It+for+the+Patient%3F+A+Vision+towards+the+Future%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Circulating Tumor Cells: What Is in It for the Patient? A Vision towards the Future.</a> Cancers. 6, 1195-1207 (2014).</li>
<li>Sheng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture%2C+release+and+culture+of+circulating+tumor+cells+from+pancreatic+cancer+patients+using+an+enhanced+mixing+chip%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+on+a+chip%22%5BJournal%5D)">Capture, release and culture of circulating tumor cells from pancreatic cancer patients using an enhanced mixing chip.</a> Lab on a chip. 14, 89-98 (2014).</li>
<li>George, T. J., Ogunwobi, O. O., Sheng, W., Fan, Z. H., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Tissue+is+the+issue%22%3A+circulating+tumor+cells+in+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+gastrointestinal+cancer%22%5BJournal%5D)">"Tissue is the issue": circulating tumor cells in pancreatic cancer.</a> Journal of gastrointestinal cancer. , (2014).</li>
<li>Ogunwobi, O. O., Puszyk, W., Dong, H. J., Liu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+upregulation+of+HGF+and+c-Met+drives+metastasis+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Epigenetic upregulation of HGF and c-Met drives metastasis in hepatocellular carcinoma.</a> PloS one. 8, e63765(2013).</li>
<li>Cheng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent%2C+biocompatible+nanostructured+surfaces+for+cancer+cell+capture+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Transparent, biocompatible nanostructured surfaces for cancer cell capture and culture.</a> International journal of nanomedicine. 9, 2569-2580 (2014).</li>
<li>Yu, M., Stott, S., Toner, M., Maheswaran, S., Haber, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%3A+approaches+to+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells: approaches to isolation and characterization.</a> The Journal of cell biology. 192, 373-382 (2011).</li>
<li>Steube, K. G., Koelz, A. L., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+verification+of+rodent+cell+lines+by+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Identification and verification of rodent cell lines by polymerase chain reaction.</a> Cytotechnology. 56, 49-56 (2008).</li>
<li>Pantel, K., Alix-Panabieres, C., Riethdorf, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+micrometastases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Clinical+oncology%22%5BJournal%5D)">Cancer micrometastases.</a> Nature reviews. Clinical oncology. 6, 339-351 (2009).</li>
<li>Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection%2C+clinical+relevance+and+specific+biological+properties+of+disseminating+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells.</a> Nature reviews. Cancer. 8, 329-340 (2008).</li>
<li>Cristofanilli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells%2C+disease+progression%2C+and+survival+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+journal+of+medicine%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells, disease progression, and survival in metastatic breast cancer.</a> The New England journal of medicine. 351, 781-791 (2004).</li>
<li>De Giorgi, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+tumor+cells+and+bone+metastases+as+detected+by+FDG-PET%2FCT+in+patients+with+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+oncology+%3A+official+journal+of+the+European+Society+for+Medical+Oncology+%2F+ESMO%22%5BJournal%5D)">Circulating tumor cells and bone metastases as detected by FDG-PET/CT in patients with metastatic breast cancer.</a> Annals of oncology : official journal of the European Society for Medical Oncology / ESMO. 21, 33-39 (2010).</li>
<li>Eloubeidi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+ultrasound-guided+fine+needle+aspiration+biopsy+of+patients+with+suspected+pancreatic+cancer%3A+diagnostic+accuracy+and+acute+and+30-day+complications%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+journal+of+gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Endoscopic ultrasound-guided fine needle aspiration biopsy of patients with suspected pancreatic cancer: diagnostic accuracy and acute and 30-day complications.</a> The American journal of gastroenterology. 98, 2663-2668 (2003).</li>
<li>O'Toole, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+complications+of+EUS-guided+fine-needle+aspiration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastrointestinal+endoscopy%22%5BJournal%5D)">Assessment of complications of EUS-guided fine-needle aspiration.</a> Gastrointestinal endoscopy. 53, 470-474 (2001).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Dans cette étude, nous avons décrit comment isoler et propager des CTC à partir du sang total d’une souris syngénique atteinte de CHC. L’objectif de ce travail est d’enrichir les études en cours sur les mécanismes des métastases cancéreuses. 
Un facteur qui contribue au mauvais pronostic de nombreux cancers est le manque de détection précoce et la dissémination généralisée de la tumeur maligne3. Les CTC proviennent de cancers primitifs et se propagent par la circulation sanguine ver...

La communauté de recherche sur le cancer connaît l’existence des cellules tumorales circulantes (CTC) depuis qu’elle a été observée pour la première fois par Thomas Ashworth en 18691. Depuis lors, il a été démontré que les CTC sont importants dans les métastases tumorales et la progression de la maladie2-5. Aujourd’hui, les tumeurs solides sont une cause majeure de morbidité et de mortalité dans le monde. Les CTC sont des cellules rares qui proviennent de tumeurs primaires et voyagent dans la circulation sanguine vers différents organes, dont seule une petite fraction se développe finalement en métastases2 à 5. Notamment, il existe une corrélation positive entre la taille de la tumeur et le CTC numéro3,4. 
Une compréhension de la biologie du CTC peut contribuer à la recherche d’un traitement ciblé. De plus, les CTC peuvent avoir des applications de diagnostic. Pour réaliser ces applications cliniques potentielles, il faut surmonter certains défis actuels liés à l’étude des CTC. L’un des défis est lié au fait que les CTC peuvent être présents sous forme de cellules uniques ou de grappes, et qu’ils peuvent même être capables de changer de phénotype en réponse au microenvironnement sanguin2. De plus, la détection peut être très difficile, en partie en raison du faible nombre de CTC (de quelques à quelques centaines par millilitre) parmi un milliard de cellules hématologiques par millilitre dans le sang6. Néanmoins, ces dernières années, la recherche sur les applications cliniques potentielles des CTC dans les cancers des organes solides s’est intensifiée.
Malgré ces efforts, les défis liés à l’étude et à la compréhension du rôle des CTC persistent en raison de la rareté des CTC et de l’inadéquation des outils technologiques actuellement disponibles. Malgré ces défis, l’énorme potentiel d’applications cliniques continue d’inciter à poursuivre la recherche sur le rôle des CTC dans les métastases cancéreuses.
Nous avons récemment réussi à isoler et à propager en culture cellulaire des CTC à partir d’un modèle murin syngénique orthotopique de métastases de carcinome hépatocellulaire (CHC)5. L’objectif du présent document est de décrire en détail tous les aspects de la méthodologie réussie. L’importance de cette méthodologie réside dans le fait que cette approche peut être modifiée afin d’isoler et de propager avec succès en culture des CTC humains, augmentant ainsi la possibilité d’études in vitro de la biologie des CTC. 
Il existe de multiples applications cliniques potentielles pour l’utilisation des CTC. Les CTC peuvent être utiles pour le pronostic, le suivi de la réponse, le dépistage, la surveillance dynamique des altérations moléculaires tumorales et la thérapie personnalisée4. Par conséquent, une meilleure compréhension de la biologie des CTC a un fort potentiel d’impact clinique.

<table><tbody><tr><td>Héparine Sel de sodium 1 g</td><td>VWR</td><td>89508-852</td><td></td></tr><tr><td>BTX Tube Micro 1,5 ml Transparent NS</td><td>VWR</td><td>89511-254</td><td>1,5 ml sans pyrogène Eppendorf Tubes</td></tr><tr><td>Aiguille Stérile Disp BD 25 G x 1 po</td><td>VWR</td><td>BD305125</td><td>25 G</td></tr><tr><td>Aiguille Slp Tip SRNG 1 ml 200 chacun par paquet</td><td>VWR</td><td>BD309659</td><td>1 ml Embout de seringue</td></tr><tr><td>Seringue 1 ml leur lok Pk 100</td><td>VWR</td><td>BD309628</td><td>Seringue de 1 ml</td></tr><tr><td>VWR Forceps Tissue 6</td><td>VWR</td><td>82027-446</td><td>Pince</td></tr><tr><td>Cyromold intrm 15 x 15 x 5 mm PK 100</td><td>VWR</td><td>25608-924</td><td>Cyromold</td></tr><tr><td>Cryo-oct compund 4 oz</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Oct compound</td></tr><tr><td>VWR Slide sprfrst 25 x 75 mm PK72</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td>Slides</td></tr><tr><td>VWR Cover Glass #2 22 x 50 mm</td><td>VWR</td><td>48-382-128</td><td>Verre de couverture</td></tr><tr><td>VWR Slide Box True North Fm Pu</td><td>VWR</td><td>89140-278</td><td>Slide Box</td></tr><tr><td>Super HT PAP Pen</td><td>VWR</td><td>89427-058</td><td>Stylo PAP</td></tr><tr><td>Eau sans RNASe et DNAse 2 L</td><td>VWR</td><td>101454-204</td> Tampon <td>d’eau sans nucléase</td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure Grade 500 g</td><td>VWR</td><td>97061-796</td><td>Tampon Tris</td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium ACS Grade 2, 5 kg</td><td>VWR</td><td>97062-048</td><td>Tampon au chlorure d’ammonium</td></tr><tr><td>Falcon Boîte de culture tissulaire 60 x 15 mm Style polystyrène</td><td>VWR</td><td>353002</td><td>Boîte de culture tissulaire</td></tr><tr><td>Clorox Eau de Javel, régulière</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>Clorox Bleach</td></tr><tr><td>PBS, 1x (solution saline tamponnée au phosphate) sans calcium ni magnésium (500 ml)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>21-040-CV</td><td>PBS, 1x</td></tr><tr><td>DMEM, 1x&nbsp ; avec 4,5 g/L de glucose & L-glutamine sans pyruvate de sodium</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>10-017-CV</td><td>DMEM 1x milieu pour cellules BNL 1ME A.7R.1</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>35-010-CV</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine Solution, 100x</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>30-002-Cl</td><td>Pénicilline Streptomycine</td></tr><tr><td>Sorvall Biofuge pico</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>75002411</td><td>Centrifugeuse à 13 000 tr/min</td></tr></tbody></table>

l&#39;isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes d&#39;un cancer modèle souris

Isolation and Propagation of Circulating Tumor Cells from a Mouse Cancer Model

Les métastases cancéreuses sont la principale cause de décès associés au cancer. Des études récentes ont montré que les cellules tumorales circulantes (CTC) sont importantes dans les métastases cancéreuses. En effet, le nombre de CTC est corrélé à la taille de la tumeur. Ici, une description détaillée est fournie d’une méthodologie d’isolement et de propagation des CTC à partir d’un modèle murin syngénique de carcinome hépatocellulaire (CHC) qui permet une analyse en aval des mécanismes moléculaires potentiellement importants des métastases tumorales d’organes solides. Cette méthode est efficace et reproductible. Il s’agit d’une technique non invasive qui, par conséquent, a le potentiel de remplacer la biopsie invasive de tissus humains qui peut être associée à des complications. Par conséquent, la méthode décrite ici permet d’isoler et de propager les CTC à partir d’échantillons de sang total afin qu’ils puissent être examinés et caractérisés. Cela a un potentiel d’adaptation future pour des applications cliniques telles que le diagnostic et la thérapie ciblée personnalisée.

La méthodologie décrite ici a montré que les CTC peuvent être isolés. Les souris ont été euthanasiés au expérimentale point final. Le processus impliqué asphyxie du dioxyde de carbone, l&#39;exsanguination intra-cardiaque et dislocation cervicale. Un schéma d&#39;étapes de cette intervention sont illustrées sur la figure 2. Des échantillons de sang total prélevé par exsanguination intracardiaque ont été traitées selon le protocole décrit ci-dessus. Après quoi, la centrifugation a été ut...

Il a été démontré que la classe Les cellules tumorales circulantes (CTC) jouent un rôle important dans les métastases tumorales. Ici, une méthode d’isolement et de propagation de CTC à partir du sang total d’un modèle de tumeur de souris syngénique de métastases de carcinome hépatocellulaire (CHC) est décrite.

L&#39;isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes d&#39;un cancer Modèle Souris

Cancer metastasis is the foremost cause of cancer-associated deaths. Recent studies have shown that circulating tumor cells (CTCs) are important in cancer ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et de propager des cellules tumorales circulantes à partir du sang total d'un modèle de tumeur syngénique chez la souris présentant une métastase de carcinome hépatocellulaire. Cette opération s'effectue en centrifugant d'abord le sang total prélevé chez les souris afin d'isoler l'interphase leucocytaire. Ensuite, les érythrocytes présents dans cette interphase sont lysés et les cellules tumorales circulantes sont récupérées sous forme de culot.Les cellules sont ensuite lavées, suspendues dans un milieu de culture complet et propagées en culture cellulaire. Les cellules tumorales en prolifération rapide restent viables au cours de nombreux passages et peuvent être vérifiées à l'aide de techniques diagnostiques moléculaires standard. L'importance de l'isolement des cellules tumorales circulantes par notre technique réside dans le fait qu'elle fournit un modèle reproductible, qui peut être optimisé pour une utilisation potentielle en milieu clinique.Michelle Nadu, une étudiante de premier cycle de notre laboratoire, va démontrer la procédure avec moi. Prélèvement de sang total à partir d'un modèle tumoral Ciea Kamau présentant une métastase de carcinome hépatocellulaire, tel que décrit dans un article distinct de J de centrifugeuse verticale. Le sang total recueilli est centrifugé à 1 167 ×g pendant cinq minutes à température ambiante.Une fois les couches séparées, retirez soigneusement la couche supérieure de plasma et transférez-la dans un tube de 1,5 millilitre exempt de ROGEN pour des expériences ultérieures, telles que la détection d'acides nucléiques libres circulants. Ensuite, transférez la couche de globules blancs dans un autre tube de 1,5 millilitre exempt de ROGEN en vue de la lyse des globules rouges. Cette étape est nécessaire pour éliminer les globules rouges résiduels présents dans la couche de globules blancs avant l'isolement des cellules tumorales circulantes.Commencez par préparer une solution d'un litre de tampon de lyse des globules rouges avec une concentration finale de 155 millimolaire de chlorure d'ammonium et de 10 millimolaire de triss. Ajustez le pH de la solution à 7,5. Prélevez un aliquot de deux à quatre millilitres à partir du stock, soit un mélange de tampon de lyse des globules rouges d'un litre.Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon d'hémolyse des globules rouges dans le tube contenant le buffy coat recueilli. Mélangez le contenu du tube en l'inversant plusieurs fois. Incubez ensuite le tube pendant cinq minutes à température ambiante sur la paillasse.Ensuite, centrifuger le mélange pendant cinq minutes à 1 167 × g. Après la centrifugation, un culot blanchâtre sera obtenu. Éliminer lentement et soigneusement le surnageant rougeâtre dans de l'eau de javel à 10 % sans perturber le culot.Après avoir éliminé le surnageant, laver le culot blanchâtre dans un millilitre de PBS. Ensuite, recentrifuger les cellules et les resuspendre dans un milieu de culture complet. Déposer les cellules resuspendues dans une boîte de culture cellulaire et incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié sous air et 5 % de dioxyde de carbone.Changer le milieu de culture cellulaire tous les deux ou trois jours. Après cinq à sept jours, les cellules tumorales circulantes se seront fixées au plat de culture cellulaire et auront commencé à proliférer. Afin de vérifier que les cellules tumorales circulantes du carcinome hépatocellulaire ont été correctement isolées.Réalisez une PCR pour un segment spécifique du gène de la bêta-globine murine, comme décrit et validé par Stu. Ensuite, réalisez une immunomarquage des cellules à l’aide d’un anticorps spécifique de la protéine liant l’élément de réponse au cyclique A MP, marqueur spécifique des hépatocytes, isoforme trois comme trois. Les techniques standard utilisées ici sont illustrées par des images représentatives de cellules tumorales circulantes provenant de deux souris distinctes.En culture à partir d'un modèle murin syngénique orthotopique de carcinome hépatocellulaire. Les cellules tumorales métastatiques adhèrent à la boîte et prolifèrent rapidement. Elles peuvent être amplifiées au-delà de 25 passages et résistent à des cycles répétés de congélation-décongélation.Ainsi, après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler et propager des cellules tumorales circulaires viables, ainsi que de les caractériser à la fois sur le plan moléculaire et fonctionnel.

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Médecine

La vidéo décrit la technique d’injection intra-génétique de cellules cancéreuses pour développer un modèle murin orthotopique avec des tumeurs très uniformes. Par conséquent, le modèle de souris orthotopique permet une simulation réaliste des métastases, fournissant un outil précieux pour étudier les changements de phénotype pendant la croissance et la dissémination de la tumeur.

Injection de cellules tumorales intracécales : une technique d’administration de cellules cancéreuses pour l’établissement d’un modèle murin de cancer colorectal orthotopique

Cette vidéo décrit un protocole détaillé pour isoler les cellules tumorales circulantes à partir de l’échantillon de sang entier d’un modèle murin de tumeur colorectale euthanasiée. Ces CTC isolés peuvent être cultivés et utilisés pour l’analyse en aval prévue.

Isolement des CTC à partir d’un échantillon de sang total : une méthode pour obtenir des CTC à partir d’un modèle murin de cancer colorectal

La dissémination métastatique du cancer est la principale cause de décès liés au cancer. Nous fournissons une description en profondeur de notre méthodologie de chirurgie de survie pour établir un système orthotopique "patient comme" modèle de souris syngénique pour étudier les mécanismes de métastases dans les tumeurs d'organes solides.

Un «Patient-Like&quot; Orthotopique Syngénique modèle de souris de carcinome hépatocellulaire Métastases

Nous rapportons une méthode fiable pour isoler et cultiver des cellules endothéliales primaires spécifiques à la tumeur à partir de modèles murins génétiquement modifiés.

Isolement et culture Expansion des cellules endothéliales spécifique de la tumeur

Ce manuscrit détaille une méthode utilisée pour générer des xénogreffes dérivées de patients atteints d’un cancer de la prostate (PDX) à partir de cellules tumorales circulantes (CTC). La génération de modèles PDX à partir de CTC fournit un modèle expérimental alternatif pour étudier le cancer de la prostate ; La tumeur la plus fréquemment diagnostiquée et une cause fréquente de décès par cancer chez les hommes.

Génération de cancer de la prostate des patients Dérivé modèles de xénogreffe de cellules tumorales circulantes

Nous décrivons l'établissement de tumeurs colorectales orthotopiques par injection de cellules tumorales ou organoïdes dans le cécum des souris et l'isolement subséquent des cellules tumorales circulantes (CTC) de ce modèle.

Isolation des cellules tumorales circulantes dans un modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

Un modèle animal est nécessaire pour décrypter le rôle des cellules tumorales (CTC) dans la promotion de la colonisation lors de métastases du cancer pulmonaire en circulation. Ici, nous avons mis en place et a effectué avec succès une in vivo test d’essai spécifiquement l’exigence de la fibronectine polymériques (polyFN) Assemblée sur CTC pour la colonisation de poumon.

La mise en place d’un essai de colonisation poumon pour la visualisation de cellules de tumeur dans les tissus pulmonaires en circulation

Ici, nous présentons un workflow intégré pour identifier les caractéristiques phénotypiques et moléculaires qui caractérisent les cellules tumorales circulantes (CTCs). Nous combinons l’immunocoloration en direct et la micromanipulation robotisée de CTCS simples et groupés avec des techniques à cellules uniques pour l’analyse en aval et l’évaluation de la capacité d’ensemencement des métastases.

Micromanipulation de cellules tumorales circulantes pour l’analyse moléculaire en aval et l’évaluation du potentiel métastatique

Ce protocole décrit une méthode reproductible pour l'isolement des cellules primaires de rhabdomyosarcoma de souris, de la formation et du traitement de la tumorsphere, et de la transplantation d'allogreffe commençant des cultures de tumorspheres.

Dérivation et traitement de la tumorale à partir de cellules tumorales primaires isolées de la souris Rhabdomyosarcomas

La culture des CTC permet une caractérisation fonctionnelle plus profonde du cancer, en testant l’expression de marqueurs spécifiques et en évaluant la résistance aux médicaments et la capacité de coloniser le foie, entre autres possibilités. Dans l’ensemble, la culture du CCT pourrait être un outil clinique prometteur pour la médecine personnalisée afin d’améliorer les résultats pour les patients.

Les lignées cellulaires tumorales circulantes : un outil innovant pour la recherche fondamentale et translationnelle

L’application des résultats de la microscopie intravitale est mise à l’épreuve par sa faible profondeur de pénétration dans les tissus. Nous décrivons ici un modèle de souris à chambre de fenêtre dorsale qui permet le co-enregistrement de la microscopie intravitale et des modalités d’imagerie cliniquement applicables (par exemple, CT, IRM) pour une corrélation spatiale directe, rationalisant potentiellement la traduction clinique des résultats de la microscopie intravitale.

Modèle murin de tumeur à chambre fenêtre de pli cutané dorsal pour la microscopie intravitale combinée et l’imagerie par résonance magnétique dans la recherche translationnelle sur le cancer

Apprenez à isoler et propager des cellules tumorales circulantes à partir du sang total d'un modèle de souris syngénique avec métastase d'hépatocarcinome. Cette technique fournit un modèle reproductible pour la recherche sur la métastase.

L'isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes d'un cancer Modèle Souris

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