L'isolement et la propagation des cellules tumorales circulantes d'un cancer Modèle Souris

L'objectif général de cette procédure est d'isoler et de propager des cellules tumorales circulantes à partir du sang total d'un modèle de tumeur syngénique chez la souris présentant une métastase de carcinome hépatocellulaire. Cette opération s'effectue en centrifugant d'abord le sang total prélevé chez les souris afin d'isoler l'interphase leucocytaire. Ensuite, les érythrocytes présents dans cette interphase sont lysés et les cellules tumorales circulantes sont récupérées sous forme de culot.

Les cellules sont ensuite lavées, suspendues dans un milieu de culture complet et propagées en culture cellulaire. Les cellules tumorales en prolifération rapide restent viables au cours de nombreux passages et peuvent être vérifiées à l'aide de techniques diagnostiques moléculaires standard. L'importance de l'isolement des cellules tumorales circulantes par notre technique réside dans le fait qu'elle fournit un modèle reproductible, qui peut être optimisé pour une utilisation potentielle en milieu clinique.

Michelle Nadu, une étudiante de premier cycle de notre laboratoire, va démontrer la procédure avec moi. Prélèvement de sang total à partir d'un modèle tumoral Ciea Kamau présentant une métastase de carcinome hépatocellulaire, tel que décrit dans un article distinct de J de centrifugeuse verticale. Le sang total recueilli est centrifugé à 1 167 ×g pendant cinq minutes à température ambiante.

Une fois les couches séparées, retirez soigneusement la couche supérieure de plasma et transférez-la dans un tube de 1,5 millilitre exempt de ROGEN pour des expériences ultérieures, telles que la détection d'acides nucléiques libres circulants. Ensuite, transférez la couche de globules blancs dans un autre tube de 1,5 millilitre exempt de ROGEN en vue de la lyse des globules rouges. Cette étape est nécessaire pour éliminer les globules rouges résiduels présents dans la couche de globules blancs avant l'isolement des cellules tumorales circulantes.

Commencez par préparer une solution d'un litre de tampon de lyse des globules rouges avec une concentration finale de 155 millimolaire de chlorure d'ammonium et de 10 millimolaire de triss. Ajustez le pH de la solution à 7,5. Prélevez un aliquot de deux à quatre millilitres à partir du stock, soit un mélange de tampon de lyse des globules rouges d'un litre.

Ensuite, ajoutez un millilitre de tampon d'hémolyse des globules rouges dans le tube contenant le buffy coat recueilli. Mélangez le contenu du tube en l'inversant plusieurs fois. Incubez ensuite le tube pendant cinq minutes à température ambiante sur la paillasse.

Ensuite, centrifuger le mélange pendant cinq minutes à 1 167 × g. Après la centrifugation, un culot blanchâtre sera obtenu. Éliminer lentement et soigneusement le surnageant rougeâtre dans de l'eau de javel à 10 % sans perturber le culot.

Après avoir éliminé le surnageant, laver le culot blanchâtre dans un millilitre de PBS. Ensuite, recentrifuger les cellules et les resuspendre dans un milieu de culture complet. Déposer les cellules resuspendues dans une boîte de culture cellulaire et incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié sous air et 5 % de dioxyde de carbone.

Changer le milieu de culture cellulaire tous les deux ou trois jours. Après cinq à sept jours, les cellules tumorales circulantes se seront fixées au plat de culture cellulaire et auront commencé à proliférer. Afin de vérifier que les cellules tumorales circulantes du carcinome hépatocellulaire ont été correctement isolées.

Réalisez une PCR pour un segment spécifique du gène de la bêta-globine murine, comme décrit et validé par Stu. Ensuite, réalisez une immunomarquage des cellules à l’aide d’un anticorps spécifique de la protéine liant l’élément de réponse au cyclique A MP, marqueur spécifique des hépatocytes, isoforme trois comme trois. Les techniques standard utilisées ici sont illustrées par des images représentatives de cellules tumorales circulantes provenant de deux souris distinctes.

En culture à partir d'un modèle murin syngénique orthotopique de carcinome hépatocellulaire. Les cellules tumorales métastatiques adhèrent à la boîte et prolifèrent rapidement. Elles peuvent être amplifiées au-delà de 25 passages et résistent à des cycles répétés de congélation-décongélation.

Ainsi, après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler et propager des cellules tumorales circulaires viables, ainsi que de les caractériser à la fois sur le plan moléculaire et fonctionnel.