Name: Isolement des leucocytes à partir de linterface humaine materno-fœtale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Découvrez l'isolement des leucocytes de la décidue humaine par dissociation mécanique, digestion enzymatique et gradient de densité. Cette méthode préserve les marqueurs de surface pour l'immunophénotypage et les études fonctionnelles.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Eunice Kennedy Shriver Institut national de la santé infantile et le développement humain, NIH / DHHS. Ce travail a également été soutenue, en partie, par l&#39;Initiative de l&#39;Université Wayne State périnatale en maternelle, périnatale et santé de l&#39;enfant. Nous tenons à remercier Maureen McGerty (Wayne State University) pour ses lectures critiques du manuscrit.

Ce protocole est approprié pour l&#39;isolement des leucocytes des caduque basale et parietalis caduque en préparation pour l&#39;immunophénotypage par cytométrie de flux. En outre, les cellules isolées peuvent être utilisées pour le tri cellulaire, culture cellulaire, l&#39;isolement de l&#39;ARN, et la cytologie. Avant de travailler avec les échantillons mentionnés dans le présent protocole, l&#39;approbation éthique humaine doit être obtenue auprès du Comité d&#39;éthique de la recherche locale et Institutional Review Board. La collecte et l&#39;utilisation d&#39;échantillons humains à des fins de recherche ont été approuvés par les Institutional Review Board de l&#39;Institut national de la santé infantile et du développement humain (NICHD) Eunice Kennedy Shriver, National Institutes of Health (NIH), ministère de la Santé et des Services sociaux (DHHS , Bethesda, MD, USA) et Wayne State University (Detroit, MI, USA). Un consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de toutes les femmes enceintes avant le prélèvement d&#39;échantillons de tissus. REMARQUE: Tout en travaillant avec le sang des animaux, les cellules, ou de dangeragents UO comme mentionné dans ce protocole, il est essentiel que la biosécurité appropriée et des mesures de sécurité de laboratoire soient suivies. 1. Dissection des déciduales tissus humains NOTE: La plaque de base est la base au-dessous et ci-joint au placenta et représente la surface maternelle. Les membranes chorioamniotic comprennent l&#39;amnios et le chorion. La plaque basale comprend les caduque basale et le chorion comprend parietalis caduque (Figure 1). <ol><li> Decidua basalis <ol><li> Disséquer un morceau de la plaque de base d&#39;un cotylédon du placenta (figures 1A et 1B). </li><li> Placez-le sur une planche à découper stérile avec les villosités placentaires vers le haut. Le côté montrant la villosités placentaires est généralement rouge sang avec le tissu poilu en apparence. La plaque basale est lisse et pâle de couleur rouge. </li><li> Utilisez tranchants, ciseaux pointes fines et une pince pour retirer la villtissus et les vaisseaux sanguins UO. Gardez le tissu trempé dans 1x PBS (Ca2 + - et Mg 2+ - gratuitement) pendant le processus (figure 1C). Recueillir 2 à 3 de ces pièces et rincez-les soigneusement avec 1x PBS pour éliminer le sang (figure 1D). </li></ol></li><li> Decidua parietalis <ol><li> Disséquer un morceau de membranes chorioamniotic (environ 10 cm x 10 cm, figure 1E). Placez-le sur la planche avec le chorion vers le haut. Le côté chorionique contient des caillots de sang et est généralement la lumière de couleur jaunâtre. </li><li> Utilisez pointes fines pinces pour retirer autant de caillots de sang que possible (figure 1E). Rincer la membrane stérile 1x PBS pour nettoyer l&#39;excès de sang à partir de la membrane jusqu&#39;à ce que le PBS 1x soit claire. </li><li> Utilisez un grattoir à cellules stérile à usage unique pour gratter doucement la couche déciduale de la membrane. Appliquer stérile 1x PBS sur la memBrane tout en complétant ce processus (figure 1F). Recueillir les tissus déciduales et les placer dans un tube en plastique de 50 ml avec PBS 1x stérile (figure 1G). </li></ol></li></ol> 2. La ventilation mécanique et de digestion enzymatique <ol><li> Laver le tissu disséqué à partir de la caduque basilaire de l&#39;étape (1.1.3) ou la caduque pariétale (de l&#39;étape 1.2.3) avec PBS 1x stérile dans un tube en plastique de 50 ml. Recueillir des pastilles de tissu par centrifugation à 300 g pendant 5 min à température ambiante. </li><li> Aspirer le surnageant situé au-dessus du culot de tissu soigneusement sans perturber le culot. NOTE: A ce stade, les pastilles sont très lâche, car ils contiennent des globules rouges. Si le volume de la pastille est d&#39;environ ou inférieur à 3 ml, remettre en suspension le culot dans 6 ml de solution de détachement cellulaire pré-chauffé à 37 ° C. Si la pastille est supérieure à 3 ml de volume, ajouter plus de solution de détachement cellulaire (ajouter environ 2 fois èmee volume des échantillons de tissus). </li><li> Transférer les tissus homogénéisés (caduque basale + détachement cellulaire solution ou caduque parietalis + solution de détachement cellulaire) à un tube de C. </li><li> Placer le tube de C dans le dissociateur automatique et exécuter le programme correspondant. NOTE: Le programme pour les caduque basale fonctionne pendant 17 secondes avec 668 tours au total par cycle. Le programme pour les parietalis caduque fonctionne pendant 37 secondes avec 235 tours au total par cycle. Ces programmes ont été personnalisés pour isoler des leucocytes caduque basilaire ou parietalis caduque avec un bon rendement et la viabilité cellulaire. </li><li> Après la désagrégation mécanique des tissus, digérer les tissus avec une solution de détachement cellulaire disponible dans le commerce tel que Accutase; (Un cocktail contenant des enzymes protéolytiques et collagénolytiques) pendant 45 min à 37 ° C avec agitation douce. </li></ol> 3. Isolement de leucocytes <ol><li> Après l&#39;incubation, ajouter 10 ml de 1 x PBS à la digemélange stion et passer à travers un tamis cellulaire 100 um dans un tube en plastique de 50 ml. Selon la viscosité du mélange de digestion, on peut avoir besoin d&#39;utiliser plusieurs filtres de cellules pour une mélange. </li><li> Remplir le tube avec 1x PBS et centrifuger à 300 g pendant 5 min à température ambiante. Retirer le PBS 1x-dessus des culots cellulaires soigneusement et remettre en suspension les culots avec 5 ml de tampon FACS glacé. NOTE: Pour étudier les polynucléaires et mononucléaires leucocytes ensemble, passez à l&#39;étape 6.1; d&#39;étudier les leucocytes mononucléaires, passez à l&#39;étape 3.3. </li><li> Ajouter 5 ml de 20% de milieu de gradient de densité (1,077 + 0,001 g / ml) dans un tube en plastique de 15 ml et recouvrir lentement la suspension cellulaire au-dessus du milieu de gradient de densité. Bien que la stratification de l&#39;échantillon, il est important de ne pas mélanger le milieu à gradient de densité avec la suspension de cellules. </li><li> Centrifugeuse avec un rotor swing-out à 500 g pendant 30 min à 4 ° C sans le frein. Il est très important pour désactiver le frein pour éviter de mélanger les cellules et lOsing le gradient. Les leucocytes se trouvent à l&#39;interface entre le milieu à gradient de densité et le tampon FACS. </li><li> Retirer la couche supérieure qui contient les débris de la mémoire tampon et la cellule FACS très soigneusement à l&#39;aide d&#39;une pipette. La bande de l&#39;interface contenant les cellules mononucléaires déciduales et une partie des leucocytes polynucléaires. </li><li> Transférer les cellules à l&#39;interface complètement dans un nouveau tube de plastique de 15 ml. Ajouter au moins 3 fois plus de volume de tampon FACS. </li><li> Centrifuger à 300 g pendant 5 min à pastiller les cellules. Aspirer le surnageant et laver les cellules avec un tampon FACS. Pastiller les cellules avec un autre centrifugation à 300 g pendant 5 min à température ambiante. REMARQUE: Pour effectuer la culture de cellules, voir l&#39;étape 4. Pour effectuer le tri de cellules, voir l&#39;étape 5. Pour effectuer immunophénotypage, voir l&#39;étape 6. </li></ol> 4. Applications - culture cellulaire <ol><li> Re-suspendre les cellules de l&#39;étape 3.7 dans 1 ml de milieu de culture RPMI 1640. Compter les cellules viables using un compteur automatique de cellules ou d&#39;un hémocytomètre et une solution bleu trypan 0,4%. </li><li> Additionner la quantité de milieu de culture RPMI pour obtenir une concentration cellulaire de 1 x 10 6 cellules / ml. Les cellules sont maintenant prêts pour la culture. </li></ol> 5. Les demandes - Isolement de macrophages pour la culture de cellules primaires <ol><li> Pour isoler CD14 + cellules magnétiquement marquer les cellules de l&#39;étape 3.7 avec des microbilles CD14 (20 perles de pi par 10 7 cellules), incuber pendant 15 min à 4 ° C, et CD14 séparé + cellules d&#39;autres types de cellules par application d&#39;un champ magnétique. Après 2 lavages avec du tampon MACS et le retrait du champ magnétique, éluer les cellules CD14 + retenues magnétiquement avec un tampon MACS. </li><li> Après la centrifugation, remettre en suspension les culots cellulaires dans du milieu de culture RPMI 1640. Les cellules sont prêtes pour le placage (Figure 2). </li></ol> 6. Applications - IMMUNOPHENOTYPAGE <ol><li> Pour utiliser les cellules pour immunophenotyping, re-suspendre les cellules de l&#39;étape 3.7 dans 1 ml de PBS 1x. Compter les cellules viables en utilisant un compteur de cellules automatique ou un hémocytomètre et une solution de bleu trypan à 0,4%. </li><li> Étiqueter les cellules avec un colorant de viabilité peut être fixée (figure 3). Laver les cellules deux fois avec du tampon FACS et remettre en suspension les cellules dans du tampon de coloration. Incuber avec un bloqueur FcR pendant 15 min à 4 ° C. </li><li> Ajouter les anticorps conjugués à des fluorochromes extracellulaires. Par exemple, dans ce protocole, en utilisant l&#39;anti-CD3, anti-CD19, anti-CD14, anti-CD15, anti-CD56 et des anticorps (tableau 1). Incuber pendant 30 min à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Après deux lavages avec 1 x PBS, les cellules seront analysés dans 500 ul de tampon de coloration en utilisant un cytomètre de flux. Une représentation de la stratégie de déclenchement utilisé pour analyser les sous-populations de leucocytes présents dans les tissus déciduales est représenté sur la Figure 4. </li></ol>

Les auteurs ne divulguent aucun conflit d’intérêts.

Caractérisation des propriétés fonctionnelles et phénotypiques de l&#39;infiltration des leucocytes à l&#39;interface materno-fœtale humaine est essentielle pour la compréhension des mécanismes immunitaires qui conduisent à des troubles de la grossesse. Plusieurs techniques ont été décrites pour isoler les leucocytes de l&#39;interface materno-fœtale humaine pendant la grossesse 10,14,25,28,37,42,43. Cependant, chacune de ces techniques est distinct, met en oeuvre des enzymes ou des combinaisons d&#39;enzymes...

La grossesse est caractérisé par trois phases distinctes: une immunologiques) implantation et la placentation précoce associée à une réponse pro-inflammatoire (par exemple, implantation ressemble à un «plaie»); 2) le deuxième trimestre et la plupart du troisième trimestre de la grossesse, lorsque l&#39;homéostasie immunitaire est atteint grâce à un état majoritairement anti-inflammatoire à l&#39;interface materno-fœtale; et 3) la parturition, un état ​​pro-inflammatoire 1-7. Les cellules immunitaires jouent un rôle important dans la régulation de la réponse inflammatoire à l&#39;interface materno-fœtale où leur abondance et le changement de localisation pendant la grossesse 6-9. Chez les humains, l&#39;interface materno-fœtale représente une zone de contact direct entre la mère (caduque) et foetale (chorion ou trophoblaste) tissus. Cette interface comprend: 1) la caduque pariétale qui tapisse la cavité utérine ne sont pas couverts par le placenta et est en juxtapositionau laeve de chorion; et 2) les caduque basale, situé dans la plaque basale du placenta où il est envahi par les trophoblastes interstitiels 10 (Figure 1). L&#39;intimité de ces zones de contact crée les conditions pour l&#39;exposition du fœtus à l&#39;antigénique immunitaire 11-13 du système maternelle. Sans surprise, les leucocytes comprennent jusqu&#39;à 30 à 40% des cellules déciduales 8,9,14,15 en plus des cellules de type stromal typiques et les cellules glandulaires 8,14,16. Le rôle des leucocytes à l&#39;interface materno-fœtale englobe de multiples processus qui incluent la limitation de l&#39;invasion trophoblaste 17, le remodelage des artères spiralées 18,19, maintien de la tolérance maternelle 12,20, et l&#39;initiation du travail 21-26. Les leucocytes à la fois de l&#39;adaptation et des membres innée du système immunitaire, à savoir, les cellules T, les macrophages, les neutrophiles, les lymphocytes B, les cellules dendritiques et les cellules NK, ont été identifiés dans les tissus déciduales, et leurIl a été démontré proportions et l&#39;état d&#39;activation de varier spatialement et temporellement pendant toute la gestation 6-10,12,14,24,27-30. Perturbations dans la population et / ou de la fonction des leucocytes sont associés à un avortement spontané 31, 32 pré-éclampsie, une restriction de croissance intra-utérin 32,33 et 7,24 travail prématuré. Par conséquent, l&#39;étude des caractéristiques phénotypiques et la fonctionnalité des leucocytes à l&#39;interface materno-fœtale humaine facilitera l&#39;élucidation des voies immunologiques surexprimés dans les troubles de la grossesse. Un des outils les plus puissants utilisés pour déterminer le phénotype et les propriétés fonctionnelles de leucocytes est la cytométrie de flux, une technologie qui permet l&#39;analyse quantitative de plusieurs paramètres simultanément 34-36. Pour analyser les leucocytes par cytométrie de flux, l&#39;isolement des leucocytes dans une suspension à cellule unique est nécessaire. Par conséquent, un procédé pour séparer l&#39;infiltration leukocytes de l&#39;interface materno-fœtale est nécessaire pour étudier leur propriétés phénotypiques et fonctionnels. Plusieurs méthodes ont été décrites pour isoler les leucocytes de l&#39;interface materno-fœtale humaine 10,14,25,27,37-39. Alors que certains appliquent désagrégation mécanique 10,25,27,38, d&#39;autres utilisent la digestion enzymatique 37,40 pour la dissociation des tissus. Parce que la désagrégation mécanique produit un rendement plus faible et la viabilité réduite 41, et la dissociation enzymatique peut affecter la viabilité et la surface de la cellule marqueur rétention 42, le procédé décrit ici combine dissociation mécanique douce avec prétraitement enzymatique pour augmenter le rendement des leucocytes isolés sans compromettre la viabilité des cellules. Une combinaison de méthodes similaire a été démontrée comme étant efficace dans la séparation de leucocytes à partir des tissus déciduales à l&#39;interface materno-fœtale 39. Par conséquent, le protocole décrit ici implique mécadésagrégation nique avec un dissociateur automatique de tissu qui augmente la cohérence tout en économisant du temps et de la main-d&#39;œuvre par rapport à hachage traditionnel avec des scalpels opposées, lames de rasoir, des ciseaux chirurgicaux ou 10,28. L&#39;enzyme choisie pour la dissociation des tissus était Accutase. Contrairement à la collagénase utilisée par 43, 44 dispase, la trypsine et 45, Accutase (une solution de détachement cellulaire) combine à la fois des activités protéolytique et collagénolytiques général qui contribuent à la dissociation efficace et doux 46,47. Après dissociation, les leucocytes sont enrichies à partir de la population totale des cellules déciduales par centrifugation en gradient de densité. Différents milieux de gradient de densité ont été utilisés précédemment, le plus commun qui sont Percoll (une suspension de particules de silice colloïdale) 48 et Ficoll (un polymère de saccharose avec un poids moléculaire synthétique de haute) 49. L&#39;efficacité supérieure de l&#39;isolement par le polymère de saccharose a été previoisa nt montré 50, et le protocole décrit ici encore prouve que ce média de gradient de densité produit une pureté suffisamment élevé de leucocytes mononucléaires. Par conséquent, le protocole décrit ici combine la désagrégation du tissu mécanique avec un dissociateur automatique de tissu, la digestion enzymatique avec une solution de détachement de la cellule, et la séparation des leucocytes avec un milieu de gradient de densité (1,077 + 0,001 g / ml) pour isoler les leucocytes à partir de tissus déciduales humaines. Ce protocole a été prouvé pour préserver les antigènes de surface des cellules ainsi que la viabilité des cellules. Les leucocytes isolés peuvent être utilisés pour de multiples applications qui comprennent immunophénotypage avec la cytométrie de flux et des études fonctionnelles in vitro.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Dissection</td></tr><tr><td>Outils de dissection stériles : ciseaux chirurgicaux, pinces et pince à épiler à pointe fine&nbsp ;</td><td>Tout fournisseur</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>1X solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>(1X PBS)</td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri grandes et petites</td><td>N’importe quel fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Dissociation</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Life Technologies</td><td>A11105-01</td><td>(solution de détachement cellulaire)</td></tr><tr><td>Tubes coniques stériles de 2 ml à verrouillage sûr</td><td>N’importe quel </td><td></td><td></td>fournisseur</tr><tr><td>50 ml tubes à centrifuger coniques</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 & micro ; Filtres à cellules m</td><td>FALCON/Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>5 ml tubes à essai en polystyrène à fond rond</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes de transfert</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes C</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-237</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Cell Culture</td></tr><tr><td>RPMI milieu de culture 1640&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>22400-089</td><td>(1X) (10 % FBS et 1 % P/S)</td></tr><tr><td>Lames de chambre en plastique</td><td>Thermo Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Thermo Scientific Corporation</td><td>HEPA Classe 100</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Fisher Scientific</td><td>ISOTEMP 110</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules</td><td>Nexelcom</td><td>Cellomètre Auto2000</td><td></td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>Olympus CKX41</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Séparation cellulaire</td></tr><tr><td>MS colonnes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur de cellules</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu ; m filtres de pré-séparation</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-40</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml safe-lock tubes coniques</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampon MACS&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>(0,5 % d’albumine sérique bovine, 2 mM d’EDTA et 1X PBS)</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>FcR Blocking</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td>(Fc Block)</td></tr><tr><td>Anticorps antigéniques antigéniques de surface des cellules humaines&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>(Tableau 1)</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD viability colorant</td><td>BD Biosciences</td><td>564406</td><td></td></tr><tr><td>Lyse/Fix buffer&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>346202</td><td></td></tr><tr><td>tampon FACS&nbsp ;</td><td></td><td></td><td>(0,1 % BSA, 0,05 % d’azoture de sodium et 1X PBS, pH = 7,4)</td></tr><tr><td>Tampon de coloration&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>554656</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue solution 0,4</td><td> %Life Technologies</td><td>15250-011</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>Milieu à gradient de densité de 20 % (1,077 + 0,001 g/ml)</td></tr><tr><td colspan="4">Additional Instruments</td></tr><tr><td>Incubateur avec agitateur</td><td>Thermo Scientific</td><td>MAXQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux</td><td>Centrifugeuse BD Biosciences</td><td>LSR-Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Beckman Coulter</td><td>SpinChron DLX</td><td></td></tr><tr><td>Système d’aspiration</td><td>Tout fournisseur</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dissociateur automatique des tissus&nbsp ;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>gentleDissociateur</td><td></td> MACS</tr></tbody></table>

isolement des leucocytes à partir de l&#39;interface humaine materno-fœtale

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

La grossesse est caractérisée par l&#39;infiltration de leucocytes dans les tissus reproducteurs et à l&#39;interface materno-fœtale (caduque basale et caduque pariétale). Cette interface est le site anatomique de contact entre la mère et de tissus foetaux; par conséquent, il est un site d&#39;action immunologique au cours de la grossesse. Infiltrant leucocytes à l&#39;interface materno-fœtale jouent un rôle central dans l&#39;implantation, l&#39;entretien de la grossesse, et le calendrier de livraison. Par conséquent, les caractérisations phénotypiques et fonctionnelles de ces leucocytes fourniront des renseignements sur les mécanismes qui conduisent à des troubles de la grossesse. Plusieurs protocoles ont été décrits dans le but d&#39;isoler leucocytes infiltrant des caduque basale et parietalis caduque; Cependant, le manque de cohérence dans les réactifs, les enzymes, et les temps d&#39;incubation, il est difficile de comparer ces résultats. Décrit ici est une nouvelle approche qui combine l&#39;utilisation de diss mécaniques et enzymatiques doucestechniques de ociation de préserver la viabilité et l&#39;intégrité des marqueurs intracellulaires et extracellulaires dans les leucocytes isolés à partir de tissus humains à l&#39;interface materno-fœtale. Mis à part l&#39;immunophénotypage, culture cellulaire, et le tri de cellules, les applications futures de ce protocole sont nombreuses et variées. À la suite de ce protocole, les leucocytes isolés peuvent être utilisés pour déterminer la méthylation de l&#39;ADN, l&#39;expression de gènes cibles, de fonctionnalité in vitro de leucocytes (par exemple, la phagocytose, la cytotoxicité, la prolifération des cellules T, et de la plasticité, etc.), et la production d&#39;espèces réactives de l&#39;oxygène à l&#39;interface materno-fœtale. En outre, en utilisant le protocole décrit, ce laboratoire a été en mesure de décrire les leucocytes nouvelles et rares à l&#39;interface materno-fœtale.

. La dissection de tissus humains à l&#39;interface materno-fœtale (caduque basale et caduque parietalis) est représenté en figure 1 Cette procédure comprend la dissection de la plaque de base, qui comprend les caduque basale (Figure 1A - D). Le basalis caduque est obtenue en enlevant la villosités placentaires (côté fœtal) à partir de la plaque de base (Figure 1C). Le parietalis caduque est recueilli par grattant doucement la membrane chorionique <stro...

décrit ici un protocole pour isoler et approfondir l’étude des leucocytes infiltrants de la décidua basalis et de la decidua parietalis - l’interface mère-fœtus humaine. Ce protocole maintient l’intégrité des marqueurs de surface cellulaire et produit suffisamment de cellules viables pour les applications en aval, comme le prouve l’analyse par cytométrie en flux.

Isolement des leucocytes à partir de l&#39;interface humaine materno-fœtale

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les leucocytes à partir de la décidua humaine, du baus et de la décidua paral. Cela est réalisé en disséquant d'abord les tissus déciduaux humains du placenta. Ensuite, le tissu décidual est dissocié par désagrégation mécanique et digestion enzymatique.Ensuite, la suspension cellulaire est filtrée à l’aide d’un tamis cellulaire de 100 micromètres lavé avec un XPBS, puis centrifugée à 300 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius afin d’obtenir un culot cellulaire. Enfin, la suspension cellulaire est déposée au-dessus de la solution de gradient de densité et centrifugée, puis l’interface contenant les leucocytes est récupérée. En définitive, les leucocytes isolés peuvent être utilisés pour des études d’immunophénotypage, de culture cellulaire et fonctionnelles.L'avantage cérébral de cette technique par rapport aux méthodes existantes, telles que la dissociation mécanique ou la digestion enzymatique, réside dans le fait qu'elle combine la désagrégation mécanique des tissus avec un associeur tissulaire automatique, la digestion thématique à l'aide d'Accutase et l'isolement des leucocytes en utilisant un gradient de Ficoll. Ce protocole s'est révélé efficace pour préserver les antigènes de surface cellulaire tout en maintenant la viabilité cellulaire, et ses implications s'étendent à la compréhension des propriétés fonctionnelles et phénotypiques des leucocytes infiltrants à l'interface mère-fœtus, en lien avec la pathogenèse des complications prénatales. La collecte et l'utilisation d'échantillons humains à des fins de recherche ont été approuvées par les comités d'éthique de l'Eunice Kennedy Shriver, du National Institute of Child Health and Human Development, des National Institutes of Health, du Department of Health and Human Services, ainsi que de l'Université Wayne State.Un consentement éclairé écrit a été obtenu auprès de toutes les femmes enceintes avant la collecte des échantillons de tissu. Pour commencer, le découpé basal prélève un morceau de la plaque basale à partir d'un des pôles du placenta. Placez-le sur une planche à découper stérile avec le côté du tissu placentaire, qui apparaîtra rouge sang et avec un aspect duveteux, tourné vers le haut.La plaque basale est lisse et de couleur rouge pâle ; tout en maintenant le tissu imbibé dans du XPBS, utilisez des ciseaux à pointe fine et précise ainsi que des pinces pour retirer le tissu villique et les vaisseaux sanguins. Prélevez deux à trois fragments et rincez-les soigneusement au PBS afin d'éliminer le sang. Pour isoler le tissu décidual, disséquez un morceau carré de 10 centimètres sur 10 centimètres.Placez-le sur la lame avec le chorion, qui contient des caillots sanguins et est généralement de couleur jaune pâle, tourné vers le haut. Ensuite, utilisez une pince fine pour retirer autant que possible les caillots sanguins. Puis, à l’aide d’un PBS stérile, rincez la membrane jusqu’à ce que le PBS devienne limpide.À l’aide d’un grattoir à cellules stérile jetable et tout en appliquant du PBS sur la membrane, détacher délicatement la couche décidueuse. Recueillir les tissus décidueux et les placer dans un tube en plastique de 50 millilitres contenant du PBS stérile afin de dissocier mécaniquement la decidua Bali ou la deci paral. Commencer par utiliser du PBS 1X stérile pour laver le tissu dans un tube de 50 millilitres.Ensuite, centrifuger le tissu à 300 G et à température ambiante pendant cinq minutes. Aspirer soigneusement le surnageant sans perturber le culot. Puis, après avoir resuspendu le tissu et la solution de détachement conformément au protocole indiqué, transférer les tissus homogénéisés dans un tube C.Placer le tube dans le dissociateur automatique et exécuter le programme correspondant après la dissociation à l’aide d’une solution de détachement cellulaire disponible dans le commerce, telle que l’Accutane, appliquée aux tissus. Incuber à 37 degrés Celsius avec agitation douce pendant 45 minutes pour effectuer la digestion. Après l’incubation, ajouter 10 millilitres de PBS au mélange de digestion et le faire passer à travers un tamis cellulaire de 100 micromètres dans un tube de 50 millilitres. Selon le degré d’adhérence, plusieurs tamis peuvent être nécessaires pour filtrer une seule digestion.Utiliser du PBS pour remplir le tube et centrifuger à 300 G et à température ambiante pendant cinq minutes. Retirer soigneusement le surnageant S et utiliser cinq millilitres de tampon fax froid pour resuspendre le culot cellulaire. Pour étudier les leucocytes mononucléés, ajouter cinq millilitres de milieu de gradient de densité 20 % dans un tube en plastique de 15 millilitres.Ensuite, déposez lentement la suspension cellulaire par-dessus, en prenant soin de ne pas mélanger les couches, dans un centrifugeuse à rotor oscillant à 500 G, à quatre degrés Celsius et sans frein pendant 30 minutes ; les leucocytes se trouveront à l'interface entre le milieu de gradient de densité et le tampon fax. Ensuite, prélève délicatement par pipette la couche supérieure contenant le tampon fax et les débris cellulaires. L'interface contient les cellules mononucléées résiduelles ainsi qu'une partie des leucocytes polymorphonucléés.Transférez cette couche dans un nouveau tube de 15 millilitres. Ajoutez au moins trois volumes de tampon fax au tube, puis centrifugez à 300 G pendant cinq minutes. Pour récupérer les cellules, aspirez le surnageant S et lavez les cellules avec du tampon fax une deuxième fois avant de procéder à la culture cellulaire.Tri et immunophénotypage conformément au protocole écrit, cette figure montre la morphologie de macrophages isolés prélevés à partir de la décidue pariétale lors d'une grossesse à terme, à l'aide d'un tri cellulaire magnétique. Les macrophages isolés conservent la capacité de libérer des cytokines après trois jours de culture. Le rendement de cellules viables isolées à partir de la décidue, du baus et de la décidue paral a été déterminé après séparation par gradient de densité.À l'aide d'un marqueur de viabilité fixable comme indiqué ici, celle-ci était supérieure à 90 % pour chaque population de cellules décimales. La stratégie de tri est présentée ici pour analyser les leucocytes polymorphonucléés et mononucléés dans le cadre du tri visible, incluant les cellules T, les neutrophiles, les macrophages, les cellules NK, les cellules T NK et les cellules B. À terme de la grossesse, cette figure montre les neutrophiles, les macrophages, les cellules T et les cellules B issues des cellules résiduelles isolées d'une grossesse à terme.Enfin, les cellules NK, NKT et T issues des cellules résiduelles isolées d'une grossesse à terme sont représentées dans ce jeu de graphiques. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en trois heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de bien nettoyer le tissu afin d'éviter toute contamination par le sang, et de surveiller attentivement le tissu et le mélange enzymatique tout au long de la procédure.

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Une méthode rapide pour obtenir leucocytes infiltrants du cerveau murin est décrite. Cette méthode utilise un gradient de Percoll continue et gradient de Ficoll discontinu pour sélectionner et purifier la couche leuco-enrichi. Leucocytes isolés peuvent alors être caractérisées par des mesures de cytométrie en flux.

Isolement du cerveau infiltrant Leucocytes

Nous décrivons ici un protocole pour isoler des sous-ensembles de précurseurs des lymphocytes B du sang de cordon ombilical. Une quantité suffisante et de qualité des acides nucléiques peut être extrait des cellules et utilisées dans des essais ultérieurs en utilisant l'ADN ou de l'ARN.

Isolement des précurseurs des cellules B des sous-ensembles à partir de sang de cordon ombilical

décrit ici est un protocole permettant d’isoler et d’analyser les leucocytes infiltrants des tissus à l’interface mère-fœtus (utérus, décidua et placenta) des souris. Ce protocole maintient l’intégrité de la plupart des marqueurs de surface cellulaire et produit suffisamment de cellules viables pour les applications en aval, y compris l’analyse par cytométrie en flux.

Isolement de leucocytes des tissus murins à l&#39;interface materno-foetale

Nous décrivons ici des procédés pour la dissection de tissus foetaux et maternels à partir de placenta humain à terme, suivie par l'isolement et l'expansion des cellules souches / cellules stromales (MSC) à partir de ces tissus.

Isolement et expansion de mésenchymateuses cellules souches / stromales dérivées de placenta humain Tissue

Une méthode simple pour établir placentaire primaire humain (villosités) et des cultures d'organes déciduales est décrit. cultures d'organes villosités et déciduales sont des outils précieux pour l'étude de la pathogenèse à l'interface materno-fœtale humaine. L' infection par la bactérie Listeria monocytogenes intracellulaire facultative est démontrée.

Cultures placentaire et déciduale organe humain pour l&#39;étude des infections à l&#39;interface materno-fœtale

Ici, nous présentons un protocole pour la dissection du cordon ombilical humain (UC) et l'échantillon de placenta fœtal en alignant le cordon (CL), la gelée de Wharton (WJ), de la jonction de cordon placenta (CPJ), et le placenta fœtal (FP) pour l'isolement et la caractérisation des cellules souches mésenchymateuses (CSM) en utilisant la technique de culture des explants.

Isolement et caractérisation de cellules mésenchymateuses stromales du cordon ombilical humain et fœtale Placenta

Ce protocole présente une méthode pour l’isolement de cellules primaires de decidual humains prélevés dans les membranes foetales du placenta à terme qui peut être utilisé pour une variété d’applications (c'est-à-dire l’immunocytochimie, cytométrie en flux, etc.) visant pour étudier le rôle des différentes populations cellulaires dans les complications de la grossesse.

Isolement de cellules primaires de Decidual humaines des Membranes fœtales des placentas à terme

Le lait maternel transmet le virus de l'immunodéficience humaine (VIH), bien que seulement 15 % des nourrissons allaités par des mères infectées par le VIH soient infectés. Les nourrissons allaités ingèrent 105à 108 leucocytes maternels par jour, bien que ces cellules soient sous-étudiées. Ici nous décrivons l'isolement des leucocytes de lait maternel et une analyse de leur capacité phagocytic.

Isolement des leucocytes du lait maternel humain pour une utilisation dans une essai de phagocytose cellulaire dépendante des anticorps des cibles de VIH

Il s’agit d’une méthode pour isoler les cellules lymphoïdes utérines de souris gestantes et non enceintes. Cette méthode peut être utilisée pour de multiples applications en aval telles que le phénotypage FACS, le tri cellulaire, les tests fonctionnels, la séparation de l’ARN et la protéomique. Le protocole montre ici comment phénotyper les cellules lymphoïdes innées utérines du groupe 1 par cytométrie en flux.

Isolement des cellules lymphoïdes innées utérines pour analyse par cytométrie en flux

Ce protocole détaille l’isolement de populations immunes et non immunes vivantes du poumon de souris à l’état d’équilibre et après une infection grippale. Il fournit également des stratégies de contrôle pour identifier les sous-ensembles de cellules épithéliales et myéloïdes.

Isolement de populations de cellules myéloïdes et épithéliales vivantes à partir du poumon de souris

Ce protocole permet la purification, la caractérisation et la culture des trophoblastes extravilleux primaires HLA-G+ (EVT) à partir de la base de la déduite basale et de la membrane chorionique des placentas humains à terme. Les cultures primaires d’EVT maintiennent leur viabilité pendant 96 heures, permettant la coculture avec des cellules immunitaires maternelles correspondantes à l’échantillon et l’analyse cytométrique et moléculaire de leurs interactions en flux subséquente.

Purification des trophoblastes extravilleux HLA-G+ à partir de tissus placentaires humains pour le phénotypage et l’analyse fonctionnelle

Découvrez l'isolement des leucocytes de la décidue humaine par dissociation mécanique, digestion enzymatique et gradient de densité. Cette méthode préserve les marqueurs de surface pour l'immunophénotypage et les études fonctionnelles.

Isolement des leucocytes à partir de l'interface humaine materno-fœtale

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