Name: Isolement de leucocytes des tissus murins à linterface materno-foetale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Apprenez à isoler les leucocytes infiltrant l'interface materno-foetale chez la souris par dissociation mécanique et digestion enzymatique. Cette méthode préserve les marqueurs de surface pour l'immunophénotypage.

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NGL a été soutenu par l&#39;Initiative de l&#39;Université Wayne State périnatale en maternelle, périnatale et santé de l&#39;enfant. Nous tenons à remercier Maureen McGerty et Amy E. Furcron (Wayne State University) pour leur lecture critique du manuscrit.

Avant de travailler avec les échantillons mentionnés dans le présent protocole, l&#39;approbation éthique animale doit être donné par le Comité d&#39;éthique de la recherche locale et les Institutional Review Boards. Lorsque vous travaillez avec du sang animal, cellules, ou des agents dangereux tel que mentionné dans ce protocole, les actions appropriées en matière de biosécurité et de sécurité de laboratoire doivent être respectées. 1. Manipulation Mouse et collecte de tissus <ol><li> Préparer un poste de travail stérile et obtenir des outils stériles pour la collecte de tissus. Ces outils incluront des grands et petits ciseaux chirurgicaux, pinces et pinces à pointe fine. Inclure de petites boîtes de Petri marquées avec les noms des tissus appropriés, remplis de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) solution (3-5 ml) équilibrée à la température ambiante (20-22 ° C). Inclure aussi une grande boîte de Pétri, sans étiquette, rempli de solution 1x PBS (10 - 15 ml). </li><li> Euthanasier une souris enceinte (de 10,5 à 19,0 jours après le coït (DPC) ou avant la livraison) en utilisant du dioxyde de carbone (CO 2). Pour veiller à ce que la souris est euthanasié, utiliser la technique de la dislocation cervicale. Remarque: Avant 10,5 dpc, il est difficile de séparer manuellement les tissus déciduales à partir des tissus utérins. Si l&#39;isolement des leucocytes déciduales est pas nécessaire, leucocytes à partir des tissus de l&#39;utérus de souris non enceintes ou à partir de souris &lt;10,5 dpc peuvent également être effectuées en suivant le protocole. </li><li> En utilisant une paire de ciseaux chirurgicaux stériles, supprimer complètement la partie inférieure de l&#39;abdomen de la peau et du tissu musculaire. Avec des pinces, écarter tous les autres organes que l&#39;utérus et les ovaires sont visibles. Avec l&#39;utérus encore attaché, utilisez la pince pour le déplacer à l&#39;extérieur de la cavité péritonéale (figure 1A). </li><li> Repérez les ovaires distales à l&#39;oviducte et utéro jonction de chaque corne utérine. En utilisant les petits ciseaux chirurgicaux, faire une incision à la jonction utéro et séparer les cornes utérines de la mésentère contenant les vaisseaux utérins; puis,accise au niveau du col de détacher les cornes utérines de la cavité péritonéale (figure 1B). </li><li> Avec de petits ciseaux chirurgicaux, faire une incision entre le col et le segment inférieur des cornes utérines. Congé attaché une partie du col de l&#39;utérus au cours de ce processus (figure 1C) pour éviter d&#39;ouvrir la corne utérine. </li><li> Immerger les cornes utérines (y compris le col de l&#39;utérus) dans une grande boîte de Pétri remplie de solution PBS 1x (10-15 ml) pour hydrater les sites d&#39;implantation. </li><li> Alors qu&#39;il était encore plongé dans une solution PBS 1x, couper tout le gras des cornes utérines avec les petits ciseaux chirurgicaux. Gardez les tissus immergés dans une solution de PBS 1x long de la dissection. </li><li> En tenant les cornes utérines en place avec la pince, retirer l&#39;un des sites d&#39;implantation de l&#39;utérus avec une coupe transversale à travers la région inter-implantation, en utilisant les petits ciseaux chirurgicaux (figure 1D). Le site d&#39;implantation contient le foetus, entouré par lamembrane chorioallantoïque, et l&#39;utérus, décidual, et des tissus placentaires. </li><li> Utilisation de la pince, maintenez le site en place et de faire une petite incision dans la paroi utérine à côté de la barrière placentaire et les tissus déciduales (figure 1E). Garniture autour du périmètre du placenta / caduque jusqu&#39;à ce que ceux-ci sont séparés de tous les deux la paroi utérine et de la membrane chorio-allantoïde qui comprend le fœtus (figure 1F). </li><li> Retirez le placenta et les tissus déciduales attachés et le placer dans une solution de PBS 1x (3 - 5 ml; voir l&#39;étape 1.12). </li><li> Placez le fœtus entouré par la membrane chorio-allantoïde fixé aux tissus de l&#39;utérus dans une boîte de Pétri remplie de solution 1 x PBS (3-5 ml). L&#39;hydratation de ces tissus facilite la séparation de la membrane chorio-allantoïde de la paroi de l&#39;utérus (voir l&#39;étape 1.14). </li><li> En utilisant une paire de pinces à pointe fine, retirez délicatement le tissu décidual (couche gris-blanc) à partir de la surface placentaire. Effectuez cetteétape avec soin pour maintenir l&#39;intégrité de la barrière placentaire et les tissus déciduales (figure 1G). </li><li> Placez le placenta et les tissus déciduales dans deux boîtes de Petri marquées séparément remplis de solution de PBS 1x (3 - 5 ml chacune). </li><li> Retirez délicatement la paroi utérine de la membrane chorioallantoïque avec des pincettes à pointe fine. Ce sont les tissus utérins. </li><li> Placer les tissus utérins dans une boîte de Pétri remplie de solution 1 x PBS (3-5 ml). </li><li> Répéter les étapes à travers 1,8 1,15 jusqu&#39;à ce que tous les sites d&#39;implantation ont été traitées. </li><li> Recueillir plusieurs utérine, décidual, et des tissus placentaires pour améliorer le rendement des cellules pendant la digestion enzymatique. La quantité de tissus dépend de la taille de la portée; Cependant, l&#39;isolement des leucocytes nécessite&gt; 2 morceaux de tissu. Remarque: Pour des informations plus détaillées sur la dissection des sites d&#39;implantation sur les différents jours de gestation, voir les images trouvées dans le chapitre deux du Guide de Investigatisur la grossesse de la souris 42. </li></ol> 2. utérin, déciduale, et de dissociation des tissus placentaires <ol><li> Étiqueter plusieurs 2 ml stériles tubes coniques avec le nom de tissu approprié, et placer un flacon avec 1 000 pi de solution enzymatique sur la glace. </li><li> De la boîte de Pétri remplie de solution PBS 1x, transférer deux pièces (100 - 150 mg) de l&#39;utérus, déciduale, tissus placentaires ou à un tube conique de 2 ml étiqueté. </li><li> Ajouter 500 pi de solution enzymatique froid dans chacune 2 ml tube conique. </li><li> Avec des ciseaux stériles fines, commencent à dissocier le tissu plongé dans la solution enzymatique jusqu&#39;à ce qu&#39;il soit finement hachée. Au fil du temps, la suspension sera de développer un aspect laiteux. Cette étape ne doit pas dépasser de plus de 2 min pour éviter une sur-manipulation de l&#39;échantillon. </li><li> Une fois que le tissu a été dissocié, ajouter un supplément de 500 ul de solution enzymatique à froid le tube conique de 2 ml. </li><li> Placer le tube conique de 2 ml sur la glace. </li><li> Répétez les étapes 2.2 à 2.6 avec chaque tissu personne jusqu&#39;à ce que tous les tissus ont été traités. </li><li> Transférez tous les 2 ml tubes coniques avec tissu homogénéisé (tissu haché + solution enzymatique) des échantillons de la glace dans un incubateur à 37 ° C et effectuer une agitation orbitale douce (80 rpm). Incuber pendant 30 - 35 min. Assurez-vous que la température de l&#39;incubateur est stabilisé avant de commencer le temps d&#39;incubation. </li><li> Après incubation, enlever les 2 ml tubes coniques avec des tissus dissociées de l&#39;incubateur et les placer sur la glace pour empêcher toute nouvelle digestion. </li><li> Étiquette stériles de 50 ml tubes coniques en fonction du type de tissu. Enlever les couvercles et les remplacer par un tamis cellulaire stérile (100 um de taille de pores). </li><li> Pour les tissus dissocié du 2 ml tubes coniques à travers le tamis cellulaire en utilisant ~ 20 ml de solution PBS 1x. Les fragments de tissu restent dans le filtre de la cellule et la suspension de cellules passeront à travers elle. </li><li> Laver le dissociated tissus dans le tamis cellulaire 2 - 3 reprises avec 20 ml d&#39;une solution 1 x PBS à l&#39;aide d&#39;une pipette de transfert. </li><li> Rincer les vides 2 ml tubes coniques avec une solution PBS 1x (1 ml) et verser le contenu à travers les filtres de cellules. </li><li> Retirez les crépines de cellules de 50 ml tubes coniques et remplacer les couvercles. Centrifuger les tubes à 1250 g pendant 10 min à 4 ºC. </li><li> Avec précaution, aspirer le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Le culot cellulaire contenant les leucocytes et les cellules stromales isolées. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 ml de milieu de culture RPMI sans sérum bovin fœtal (FBS). Mélanger délicatement. Ne pas utiliser vortex. </li><li> Ajouter 500 pl de FBS ordonnées dans un tube en plastique de polystyrène de 5 ml et recouvrir lentement la suspension cellulaire. </li><li> Centrifuger pendant 10 min à 1100 x g sans le frein à la température ambiante pour obtenir un culot de cellules viables tout débris cellulaire est retenue à l&#39;interface PBS / FBS. </li><li> Aspirer le surnageant sans toucher le culot cellulaire. Le cell pastille contient principalement des cellules viables. </li><li> Optionnellement: Pour concentrer les cellules mononucléaires, utiliser une solution de polysaccharide saturée à 20%, comme décrit ci-dessous. <ol><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 000 ul de milieu de culture RPMI sans SVF. </li><li> Ajouter 1 ml de solution à 20% de polysaccharide saturée à un tube de 5 ml en matière plastique et polystyrène superposer lentement la suspension cellulaire au-dessus de cette solution, conformément aux instructions du fabricant. Bien que la stratification de l&#39;échantillon, éviter de mélanger la solution de polysaccharide saturée à 20% avec la suspension de cellules. </li><li> Centrifugeuse avec un rotor swing-out à 500 g pendant 30 min à température ambiante sans frein. Il est très important pour désactiver le frein pour éviter de mélanger les cellules et de perdre le gradient. Les cellules mononucléaires se trouvent dans l&#39;interface entre la solution de polysaccharide saturée à 20% et la solution PBS 1x. </li><li> Aspirer et jeter le surnageant. Le culot cellulaire contenant des cellules mononucléaires principalement. NonTE: Pour effectuer la viabilité coloration et une coloration intracellulaire, voir l&#39;étape 3. Pour effectuer immunophénotypage, voir l&#39;étape 4. Pour effectuer la viabilité coloration et une coloration extracellulaire seulement, voir l&#39;étape 5. Pour effectuer une culture de cellules de leucocytes isolés, voir l&#39;étape 6. Pour effectuer tri magnétique de cellules, voir l&#39;étape 7. </li></ol></li></ol> 3. Viabilité coloration pour les cellules fixable <ol><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 100 ul de solution PBS 1x. Mélanger délicatement à l&#39;aide d&#39;une micro-pipette. </li><li> Transférer 100 pl de la suspension cellulaire dans un tube de 5 ml en matière plastique de polystyrène. Ajouter 400 ul de solution PBS 1x au tube de polystyrène de 5 ml. Ce tube est un contrôle pour le tissu auto-fluorescence. Stocker à 4 ° C jusqu&#39;à l&#39;étape 3.5. </li><li> Transférer les 1000 ul restants de la suspension de cellules dans un nouveau tube de plastique polystyrène de 5 ml. Ajouter 1 pi de colorant de la viabilité et homogénéiser doucement. Incuber pendant 30 min à l&#39;obscurité à 4 ºC. </li><li> Après incubation, ajouter &amp; # 1000181; l de solution PBS 1x. Mélanger délicatement à la main. </li><li> Centrifugeuse deux 5 ml Les tubes en plastique polystyrène (étapes 3.2 et 3.3) à 1250 g pendant 10 min à 4 ºC. Aspirer et jeter le surnageant. Remarque: le culot de cellules (étape 3.3) est utilisé dans l&#39;étape 4. Le culot de cellules (étape 3.2) servira de contrôle de tissu auto-fluorescence. </li></ol> 4. Immunophénotypage <ol><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 50 ul d&#39;anti-souris CD16 / CD32 (dilué 1: 100 dans du tampon FACS [0,1% de BSA, de l&#39;azide de sodium à 0,05%, solution 1 x PBS, pH 7,4]). Mélanger délicatement la suspension cellulaire. Ne pas utiliser le vortex. </li><li> Incuber la suspension de cellules dans le tube de polystyrène de 5 ml dans l&#39;obscurité à 4 ° C pendant 10 min. </li><li> Après l&#39;incubation, ajouter 50 ul de chaque anticorps monoclonal anti-leucocyte réagir avec les marqueurs de la surface cellulaire ou extracellulaire anticorps de contrôle correspondant à l&#39;isotype (dilutions d&#39;anticorps doivent être validées). Par exemple, pour analyser les sous-populations de leucocytes, en utilisant anti-moutiliser des anticorps réagissant avec les marqueurs de surface des leucocytes CD45 suivants: cellule, Ly6G, F4 / 80, CD11c, CD49b, B220, CD3, CD4, et CD8 (Tableau 1). </li><li> Une fois que des anticorps dirigés contre des marqueurs extracellulaires ont été ajoutés au tube plastique polystyrène de 5 ml, mélanger délicatement. Incuber dans l&#39;obscurité pendant 30 min à 4 ° C. </li><li> Au cours de cette incubation, préparer et préchauffer la solution de tampon de fixation (dilué avec de l&#39;eau désionisée, 1: 5) à 37 ° C, si nécessaire. Gardez le tampon à 37 ° C dans l&#39;obscurité jusqu&#39;à ce que son utilisation est nécessaire. </li><li> Après 30 minutes d&#39;incubation, ajouter 500 pi de tampon FACS dans le tube plastique polystyrène de 5 ml et mélanger délicatement. Cette étape est nécessaire pour laver les cellules et enlever tout excès d&#39;anticorps non lié. </li><li> Centrifuger les échantillons à 1250 g à 4 ° C pendant 10 min. Aspirer et jeter le surnageant. Remarque: Si une coloration intracellulaire est pas nécessaire, voir l&#39;étape 5. Si une coloration intracellulaire est nécessaire, effectuer perméabilisation et intracellulairecoloration parti- ici, et puis procéder à la fixation (étape 4.8). </li><li> Ajouter 500 ul de la solution tampon préchauffé de fixation pour le culot de cellules et incuber dans l&#39;obscurité pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Distribuer 500 pl de tampon FACS dans le tube en matière plastique de polystyrène de 5 ml. Mélanger délicatement. </li><li> Centrifuger les échantillons à 1250 g à 4 ° C pendant 10 min. Aspirer et jeter le surnageant. </li><li> Ajouter 500 pl de tampon FACS à chaque échantillon. Ces échantillons peuvent maintenant être analysées par cytométrie de flux. Acquérir les échantillons immédiatement pour de meilleurs résultats. </li></ol> 5. Viabilité coloration pour les cellules unfixable <ol><li> Après immunophénotypage extracellulaire, remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de tampon FACS. </li><li> Ajouter 1 pi de 4 &#39;, 6-diamidino-2-phénylindole dihydrochlorure (DAPI, 200 ug / ml) juste avant l&#39;acquisition de l&#39;échantillon. </li><li> Visualisez les échantillons dans 1 - 2 min après l&#39;ajout DAPI l&#39;aide d&#39;un cytomètre de flux. </li></ol><ol><li> Préparer un poste de travail sous une hotte stérile. Pré-réchauffer le milieu de culture RPMI à 37 ° C en utilisant un bain d&#39;eau. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 1 000 ul de tampon pour FACS pour le comptage des cellules. </li><li> Comptez le nombre de cellules viables à l&#39;aide d&#39;un compteur automatique de cellules ou hémocytomètre et solution de bleu trypan 0,4%, suivant les instructions du fabricant. Enregistrez le nombre total de cellules vivantes. </li><li> Centrifuger les cellules à 1250 x g à 4 ° C pendant 10 min pour éliminer le tampon FACS. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de milieu de pré-culture RPMI chauffé en pipettant doucement 2 à 3 fois. </li><li> Plaque le nombre désiré de cellules dans une plaque de 24 puits stérile et incuber à 37 ° C. Le temps d&#39;incubation est déterminée par la question de recherche. </li></ol> 7. magnétique Tri cellulaire <ol><li> Mettre en place un poste de travail propre avec les matières suivantes: colonnes MS, séparateur magnétique de cellules, 15ml tubes coniques, 30 um filtres de pré-séparation, et un multi-support. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 500 pi de tampon MACS (0,5% de BSA, 2 mM d&#39;EDTA, solution 1 x PBS, pH 7,2). </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un compteur de cellules automatique ou hémocytomètre et solution de bleu de trypan 0,4%, compter et enregistrer le nombre total de cellules vivantes. </li><li> Centrifuger les cellules à 1250 x g à 4 ° C pendant 10 min. Aspirer et jeter le surnageant. Ajouter un autre 500 pi de tampon MACS. </li><li> Passez à effectuer la séparation magnétique suivant les recommandations du fabricant. </li><li> Déterminer la pureté par cytométrie en flux ou microscopie. </li></ol>

Les auteurs décrivent aucun conflit d&#39;intérêt.

La collecte de données cohérentes qui enregistre les caractéristiques de l&#39;abondance et phénotypiques de leucocytes infiltrants à l&#39;interface materno-fœtale est essentielle pour comprendre la pathogenèse des complications liées à la grossesse. Plusieurs techniques ont été décrites qui facilitent l&#39;isolement de l&#39;infiltration des leucocytes à partir des tissus murins à l&#39;interface materno-fœtale pendant la grossesse 31,38,39,43-46. Cependant, chacune de ces techniques est différente, met en...

La tolérance immunitaire à la grossesse est une période pendant laquelle se produisent les changements distincts dans le système immunitaire de la mère. Ces changements permettent à la mère de tolérer le fœtus, une greffe allogénique semi-1. Le fœtus exprime paternelle complexe majeur d&#39;histocompatibilité (CMH) 2, et les cellules foetales ont été trouvés dans la circulation maternelle 3; Cependant, le fœtus ne soit pas rejeté 4,5. Cette énigme est pas entièrement comprise. L&#39;hypothèse la plus récente indique que la tolérance materno-fœtale est créé pendant le coït et la fécondation 6,7 et maintenu pour soutenir une grossesse à terme 8-10. Une ventilation de cette tolérance foeto-maternelle est considéré comme un mécanisme de la maladie au cours des premiers et derniers stades de la grossesse 10-16. La tolérance foeto-maternelle implique la participation de diverses sous-populations de leucocytes, y compris les cellules T (cellules T régulatrices, les cellules Th1, Th2, et les cellules Th17), Macrophages, les neutrophiles, les mastocytes, les cellules NK et les cellules NKT, les cellules dendritiques et les cellules B, que le changement de la densité et de la localisation pendant la grossesse 15,17-19. La tolérance materno-fœtale est enrichi à l&#39;interface materno-fœtale 20 - le site anatomique où le système immunitaire de la mère interagit avec les antigènes foetaux 20,21. L&#39;interface materno-fœtale est créé lors de la placentation lorsque les cellules du trophoblaste extravilleux fœtales envahissent la muqueuse utérine 22-24. Sur le côté fœtal de cette interface, les membranes entourant le fœtus créer une surface épithéliale spécialisé du placenta, et les cellules syncytiotrophoblaste contrôler l&#39;échange des nutriments par leur contact direct avec le sang maternel 22. Du côté de la mère de l&#39;interface, la caduque recrute une piscine hétérogène de leucocytes chez les souris qui représentent 30% à 50% de toutes les cellules déciduales. En plus de leur participation à Materntolérance immunitaire al, ces cellules sont les principaux contributeurs à différents processus pendant la grossesse, par exemple., la protection de l&#39;appareil reproducteur des infections, la fécondation, l&#39;implantation d&#39;embryons 7,25, l&#39;angiogenèse décidual 26, le remodelage vasculaire 24,27, l&#39;invasion du trophoblaste 28, placentaire 24,25 développement, et, finalement, le travail et la livraison 15,17. Par conséquent, l&#39;étude des leucocytes impliqués dans la tolérance foeto-maternelle est essentielle pour élucider la pathogenèse des complications liées à la grossesse. Bien que l&#39;utilisation de l&#39;immunohistochimie et l&#39;immunofluorescence a généré des données pour la visualisation directe et la localisation de l&#39;utérus, déciduale, ou leucocytes 29,30 placentaires, l&#39;analyse par cytométrie en flux a révélé en outre des sous-ensembles spécifiques de leucocytes dans chacun de ces tissus 31,32. En outre, la cytométrie en flux a été utilisée pour déterminer la densité et la proportion de materInterface nal-fœtale leucocytes 33 et d&#39;expression des niveaux de protéines extracellulaires et intracellulaires 8-10,34. Analyse des flux cytométrique des leucocytes à l&#39;interface materno-fœtale nécessite une suspension à cellule unique. Afin d&#39;isoler les leucocytes infiltrants du déciduale, de l&#39;utérus et les tissus placentaires, deux méthodes de dissociation de tissus ont été utilisées: mécanique et enzymatique. Les deux procédés permettent la séparation des leucocytes infiltrés de la matrice extracellulaire (ECM) de ces tissus. Dissociation enzymatique du tissu est supérieure à la dissociation mécanique de tissu, car elle permet un rendement plus élevé de leucocytes avec des dommages moins cisaillement de force associé 35. Par conséquent, la dissociation de tissu mécanique nécessite la mise en commun des tissus 36, ce qui peut augmenter la variabilité et l&#39;hétérogénéité des échantillons. Cependant, la dissociation mécanique peut être le choix lorsque l&#39;antigène d&#39;intérêt peut être modifiée par dissociation enzymatique ou lorsque la fonctionnalité de la cellules d&#39;intérêt doivent être préservées (par ex., la cytotoxicité des cellules NK) 35. L&#39;utilisation de la protéolyse avec des enzymes spécifiques à dégrader l&#39;ECM élimine les faibles rendements observés avec dissociation mécanique. Plusieurs études ont rapporté l&#39;utilisation de la trypsine 32, 37 collagénase, DNase 31, Dispase 38, et des cocktails commerciales de divers enzymes 32,39. Cependant, la nature et la concentration des différentes enzymes et la durée de digestion doivent être soigneusement définies et validées en vue d&#39;assurer le maintien de l&#39;intégrité des epitopes antigéniques de la surface des cellules requises pour l&#39;immunophénotypage. Les différentes structures de surface sont différentiellement sensibles à la destruction par différentes enzymes, avec des enzymes telles que la trypsine, qui est connu pour le décapage des épitopes de surface des leucocytes reconnus par de nombreux anticorps monoclonaux. Introduit le présent mémoire est un procédé utilisant un proteolytic et cocktail enzymatique collagénolytique, appelé Accutase. Cette solution enzymatique est assez doux tout en performant à dissocier tissus murins à l&#39;interface materno-fœtale, et ne nécessite pas l&#39;ajout d&#39;autres réactifs ou du sérum de dissociation de mettre fin à la réaction de dissociation. En outre, il est prêt à être utilisé tel que fourni et, bien que le temps de dissociation doit être validé, il est plus robuste que les enzymes mentionnées ci-dessus 40,41. L&#39;utilisation d&#39;une combinaison des deux types de désagrégation du tissu améliore la qualité et la quantité de cellules obtenues; Ainsi, plusieurs études ont mis en œuvre l&#39;utilisation combinée de dissociation mécanique et enzymatique avec des résultats satisfaisants 31,32,37. Le protocole décrit ici a été établie et validée dans notre laboratoire; il utilise une combinaison d&#39;une dissociation mécanique douce suivie d&#39;une décomposition enzymatique solide. Ce protocole permet l&#39;étude d&#39;isolement et continue desles leucocytes infiltrants dans les tissus murins à l&#39;interface materno-fœtale (utérus, caduque, et le placenta). Le protocole suivant maintient également l&#39;intégrité des marqueurs de surface cellulaire et des rendements de cellules viables suffisant pour les applications en aval tel que démontré par une analyse par cytométrie de flux. Enfin, ce protocole maintient la cohérence de préparation de cellules pour l&#39;analyse et la comparaison des différents tissus murins composant l&#39;interface materno-fœtale.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Séparation cellulaire magnétique</td></tr><tr><td>MS Columns</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur de cellules</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td></td></tr><tr><td>30 &mu ; m filtres de pré-séparation</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Multistand</td><td>Militenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubes coniques</td><td>Thermo Fisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>MACS Buffer</td><td>Militenyi Biotec</td><td>Préparation de laboratoire</td><td>(0,5 % d’albumine sérique bovine, 2mM EDTA et 1x PBS, pH 7,2)</td></tr><tr><td colspan="4"><fort>réactifs</fort></td></tr><tr><td>Solution enzymatique d’accutase</td> Life <td>Technologies</td><td>A11105-01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>533142</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps extracellulaires anti-souris</td><td>BD Bioscences/eBiosciences</td><td></td><td>Tableau 1</td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Fisher</td><td>S227-500</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G Colorant de</td> viabilité LIVE/DEAD <td></td></tr><tr><td></td> Life <td>Technologies</td><td>L23105</td><td></td></tr><tr><td>Solution tampon de fixation</td><td>BD Biosciences</td><td>558049</td><td></td></tr><tr><td>Tampon FACS</td><td>BD Biosciences</td><td>Préparation de laboratoire</td><td>0,1 % BSA, 0,05 % azoture de sodium, 1x PBS, pH 7,4</td></tr><tr><td>Solution de bleu de trypan 0,4</td> % <td>BIO-RAD</td><td>145-0013</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Additional Instruments</td></tr><tr><td>Incubateur avec agitateur</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4450</td><td></td></tr><tr><td>Cytomètre en flux</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Thermo Scientific</td><td>Legend LXTR</td><td></td></tr><tr><td>Système de</td><td></td><td></td><td>vide construit en laboratoire</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Thermo Scientific</td><td>Incubateur 3307</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>Compteur de cellules 51221035</td><td></td><td>de précision</td></tr><tr><td></td><td>BIO-RAD</td><td>TC20 Compteur</td><td></td>de cellules automatisé</tr><tr><td>Microscopes optiques et à fluorescence</td><td>Zeiss et Olympus Zeiss</td><td>LSM780 et Olympus CKX41</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement de leucocytes des tissus murins à l&#39;interface materno-foetale

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

La tolérance immunitaire pendant la grossesse nécessite que le système immunitaire de la mère subit des changements distinctifs afin d&#39;accepter et de nourrir le foetus de développement. Cette tolérance est initiée pendant le coït, établi au cours de la fécondation et l&#39;implantation, et maintenu pendant toute la grossesse. Médiateurs actifs cellulaires et moléculaires de la tolérance foeto-maternelle sont enrichis sur le site de contact entre les tissus foetaux et maternels, connus sous le nom de l&#39;interface materno-fœtale, qui comprend le placenta et l&#39;utérus et des tissus déciduales. Cette interface est composée de cellules stromales et leucocytes infiltrants, et leurs caractéristiques d&#39;abondance et phénotypiques changer au cours de la grossesse. Infiltration des leucocytes à l&#39;interface materno-fœtale comprennent les neutrophiles, les macrophages, les cellules dendritiques, les mastocytes, les cellules T, les cellules B, les cellules NK, les cellules NKT et qui créent ensemble le micro-environnement local qui soutient la grossesse. Un déséquilibre entre ces cellules ou tout inappropaltération riée dans leurs phénotypes est considéré comme un mécanisme de la maladie pendant la grossesse. Par conséquent, l&#39;étude des leucocytes qui infiltrent l&#39;interface materno-fœtale est essentiel en vue d&#39;élucider les mécanismes immunitaires qui conduisent à des complications liées à la grossesse. On décrit ici un protocole qui utilise une combinaison de dissociation mécanique douce suivie d&#39;une décomposition enzymatique protéolytique robuste avec un cocktail enzymatique collagénolytique et pour isoler les leucocytes infiltrant des tissus murins à l&#39;interface materno-fœtale. Ce protocole permet l&#39;isolement d&#39;un nombre élevé de leucocytes viables (&gt; 70%) avec des propriétés antigéniques et fonctionnelles suffisamment conservées. Les leucocytes isolés peuvent ensuite être analysés par plusieurs techniques, y compris l&#39;immunophénotypage, tri cellulaire, l&#39;imagerie, immunoblotting, l&#39;expression d&#39;ARNm, une culture de cellules, in vitro et des essais fonctionnels tels que des réactions de leucocytes mixtes, prolifération, ou des essais de cytotoxicité.

La dissection des tissus murins provenant de l&#39;interface materno-fœtale est représenté sur la figure 1; Cette procédure comprend l&#39;ouverture de la cavité peritoneale (figure 1A, B), les cornes utérines (Figure 1C), y compris les sites d&#39;implantation (Figure 1D), et la collecte des tissus utérins (figure 1E), le placenta (Figure 1F), et des tissus déciduales (figure 1G) à 16,5 dpc. La...

décrit ici est un protocole permettant d’isoler et d’analyser les leucocytes infiltrants des tissus à l’interface mère-fœtus (utérus, décidua et placenta) des souris. Ce protocole maintient l’intégrité de la plupart des marqueurs de surface cellulaire et produit suffisamment de cellules viables pour les applications en aval, y compris l’analyse par cytométrie en flux.

Isolement de leucocytes des tissus murins à l&#39;interface materno-foetale

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler les leucocytes infiltrants de l'interface materno-fœtale murine. Cela est réalisé en prélevant d'abord l'utérus, le placenta et l'eua. Les tissus sont dissociés mécaniquement dans une solution enzymatique, suivie d'une digestion enzymatique ultérieure.La suspension cellulaire obtenue est ensuite filtrée et lavée, moment auquel les cellules immunitaires d'intérêt sont séparées des débris cellulaires tels que les cellules non viables par un gradient de sérum de veau fœtal. Enfin, les leucocytes isolés peuvent être utilisés pour l'immunophénotypage, la culture cellulaire ou le tri cellulaire. Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous cherchions à établir un protocole d'isolement des leucocytes à l'interface mère-fœtus, et nous avons réalisé que les méthodes publiées ne facilitaient pas l'isolement des cellules immunitaires rares qui nous intéressaient.Une démonstration sera effectuée par Mile El Sanchez Rodriguez Marcina Hernandez, qui sont des assistants de recherche de mon laboratoire. Pour prélever les tissus de l'interface mère-fœtus, commencez par utiliser une paire de ciseaux chirurgicaux stériles afin de retirer complètement la partie abdominale inférieure de la peau et du tissu musculaire. Ensuite, utilisez une pince pour déplacer tous les autres organes jusqu'à ce que l'utérus et les ovaires soient visibles. Puis, sortez l'utérus de la cavité péritonéale.Localisez les ovaires en position distale par rapport au tube utérin et à la jonction utéro-tubaire de chaque corne utérine. Ensuite, pratiquez une incision au niveau de la jonction utéro-tubaire afin de séparer les cornes du mésentère contenant les vaisseaux utérins. Réalisez une excision au niveau du col pour détacher les cornes utérines de la cavité péritonéale.Ensuite, utiliser des ciseaux chirurgicaux pour pratiquer une incision entre le col de l'utérus et le segment inférieur des cornes, en laissant une partie du col attachée afin d'éviter d'ouvrir la corne utérine. Plonger les cornes et le col dans une grande boîte de Pétri remplie de 10 à 15 millilitres de PBS afin d'hydrater les sites d'implantation. Retirer toute graisse présente sur les tissus.Ensuite, maintenir les cornes en place avec la pince. Effectuer une incision transversale à travers une région inter-implantatoire pour retirer un des sites d'implantation de l'utérus. Maintenir maintenant le site en place et pratiquer une petite incision dans la paroi utérine adjacente aux tissus placentaires et résiduels.Retailler tout autour du périmètre du placenta et des tissus déciduaux jusqu'à ce que les tissus se détachent à la fois de la paroi utérine et de la membrane chorioamniotique. Ensuite, transférer le placenta et les tissus déciduaux associés dans une nouvelle boîte de Pétri contenant trois à cinq millilitres de PBS. Placer le fœtus dans une autre boîte de Pétri avec du PBS et utiliser une pince fine pour retirer délicatement le tissu décidual gris-blanc de la surface placentaire.En prenant soin de préserver l'intégrité des tissus placentaires et des ECI, diviser les tissus placentaires et des ECI en deux boîtes de Pétri étiquetées individuellement et remplies de PBS. Puis, à l’aide de pinces à pointe fine, retirer délicatement la paroi utérine de la membrane chorio-allantoïdienne et placer ces tissus utérins dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de PBS afin de dissocier mécaniquement les tissus.Ensuite, transférez deux échantillons de 100 à 150 milligrammes de tissus discoïdes utérins et placentaires dans des tubes coniques de deux millilitres étiquetés individuellement. Ajoutez 500 microlitres de solution enzymatique froide un à chaque tube. Puis, à l’aide de ciseaux stériles, dissociez mécaniquement chacun des tissus pendant pas plus de deux minutes, jusqu’à obtention des suspensions.Présenter une apparence laiteuse. Ajouter 500 microlitres supplémentaires de solution enzymatique froide, un par tube, et placer les tubes sur de la glace. Incuber ensuite tous les tissus à 37 degrés Celsius avec une agitation orbitale douce à 80 tr/min, en plaçant les tubes sur de la glace après 30 à 35 minutes pour arrêter la digestion.Filtrez maintenant chaque homogénéat de tissu à l’aide d’un tamis de 100 microns dans des tubes coniques de 50 millilitres individuellement étiquetés, puis rincez chaque tube de deux millilitres et chaque tamis deux à trois fois avec 20 millilitres de PBS afin de récupérer toutes les cellules. Une fois que toutes les cellules ont été filtrées, centrifugez-les puis aspirez soigneusement le surnageant sans perturber les culots. Resuspendez délicatement les leucocytes et les cellules stromales isolés dans un millilitre de milieu de culture RPMI, sans vortexer.Ensuite, pour chaque tissu, ajouter 500 microlitres de sérum de veau fœtal dans un tube en polystyrène de cinq millilitres et recouvrir lentement la suspension cellulaire avec le sérum. Enfin, une fois que toutes les cellules ont été recouvertes, centrifuger les cellules sans freinage et aspirer le surnageant sans toucher les culots cellulaires. Sur ces images, la morphologie des macrophages positifs pour F four 80 isolés des tissus déciduaux et utérins.À 16,5 jours post-coum, on observe des cellules provenant des tissus de l'interface maternelle et fœtale. Ces cellules présentent une viabilité supérieure à 70 % après isolation par cette méthode et contiennent des populations de neutrophiles, de macrophages, de lymphocytes T, de cellules NK et de cellules dendritiques, avec une forte proportion de macrophages qui coexpriment les sous-populations de leucocytes CD11c isolées à partir des tissus situés à l'interface materno-fœtale. On y trouve également des lymphocytes B ainsi que des lymphocytes T CD4 positifs, des lymphocytes T CD8 positifs, et des lymphocytes T CD3 positifs, CD4 négatifs, CD8 négatifs, tous isolés comme observé sur ce tracé de densité.Très bien, lors de la réalisation de cette procédure, il est important de garder les tissus et le cocktail d'enzymes sur de la glace, de régler la température correcte dans l'incubateur et de ne pas trop manipuler les tissus pendant la digestion suivant cette procédure. D'autres méthodes telles que l'immunophénotypage, la culture cellulaire, le tri cellulaire et l'isolement d'ADN-ARN peuvent être réalisées. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'isoler les leucocytes infiltrants à l'interface mère-fœtus, c'est-à-dire l'utérus et le placenta.

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JoVE Journal

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Isolation des corticale microglie avec immunophénotype préservée et fonctionnalité De murins nouveau-nés

décrit ici un protocole pour isoler et approfondir l’étude des leucocytes infiltrants de la décidua basalis et de la decidua parietalis - l’interface mère-fœtus humaine. Ce protocole maintient l’intégrité des marqueurs de surface cellulaire et produit suffisamment de cellules viables pour les applications en aval, comme le prouve l’analyse par cytométrie en flux.

Isolement des leucocytes à partir de l&#39;interface humaine materno-fœtale

cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) proviennent de (hemogenic) des cellules endothéliales spécialisées au cours du développement, mais on sait peu sur le processus par lequel certaines cellules endothéliales spécifient pour devenir la formation du sang. Nous démontrons une méthode basée sur la cytométrie de flux permettant l'isolement simultané des cellules endothéliales hemogenic et HSPC de tissus embryonnaires murines.

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Nous décrivons ici un protocole détaillé pour l’isolement des lymphocytes des sites inductives y compris les plaques de Peyer tissu lymphoïde associé au tube digestif et les ganglions lymphatiques mésentériques drainants et les sites d’effecteur notamment la lamina propria et de la épithélium intestinal du petit système immunitaire intestinal.

Isoler des Lymphocytes du système immunitaire Intestinal souris petit

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