Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

L’objectif général de l’expérience suivante est d’imager et de sonder les propriétés physiques des membranes de séparation de phase à l’aide de la microscopie à force atomique. Ceci est réalisé en mélangeant d’abord le dilio, la phosphatidylcholine, la fgo, la myéline et le cholestérol dans un rapport de deux à deux pour un pour former un mélange de lipides séparant la phase. Ensuite, les bicouches lipidiques supportées sont préparées en déposant la suspension de liposomes dans une surface MICA à l’aide de la microscopie à force atomique.

La surface de la bicouche est ensuite scannée, produisant une image topographique où les caractéristiques structurelles telles que la hauteur peuvent être mesurées. La spectroscopie de la force suivante est effectuée sur des zones spécifiques de la bicouche pour sonder les propriétés physiques de la bicouche, notamment la force de percée et l’épaisseur de la membrane. En fin de compte, les résultats montrent des différences de propriétés entre les différentes phases lipidiques sur la base d’images FM et de courbes de force.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la microscopie à fluorescence est l’augmentation de la résolution et les propriétés supplémentaires qu’un FM peut sonder sur l’échantillon. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biophysique, telles que la structure des membranes biologiques et des protéines intégrées sur ces membranes. De plus, nous pouvons également examiner les propriétés physiques de la membrane et surveiller comment les changements dans la composition ou l’ajout d’agents actifs membranaires peuvent modifier ces propriétés.

En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront des difficultés en raison de la nature fragile de l’échantillon. Cela a des implications sur la préparation de l’échantillon, la manipulation, le choix des cantilevers et les conditions d’imagerie et de spectroscopie FM. Commencez par dissoudre le DOPC, le spino, la myéline et le cholestérol dans le chloroforme aux concentrations souhaitées. Combinez ensuite 18,38 microlitres de DOPC, 17,1 microlitres de myéline et 11,3 microlitres de cholestérol pour obtenir une solution avec un milligramme de lipides totaux et un rapport molaire de deux à deux pour un respectivement.

Mélangez une solution par vortex, séchez le mélange à l’aide d’un gaz inerte tel que l’azote, puis séchez-le davantage sous vide pendant au moins une heure. Ensuite, dissolvez les lipides séchés dans 100 microlitres de PBS à une concentration de 10 milligrammes par millilitre. Agiter vigoureusement pendant environ une minute.

Pour obtenir une suspension trouble contenant des vésicules multilaminaires. Assurez-vous qu’aucun film lipidique n’est attaché aux côtés du flacon. Prenez 10 microlitres de suspension lipidique multilaminaire et ajoutez 150 microlitres de tampon bicouche lipidique soutenu.

Ensuite, mélangez une solution et transférez-la dans un petit flacon en verre bouché de deux millilitres et fermez-le avec du para film sonicate. Le mélange à température ambiante dans un bain sonicate pendant 10 minutes. Pendant ce temps, la solution devrait devenir claire et produira de petites uni ou vésicules d’un diamètre d’environ 50 nanomètres.

Laver les glissements du couvercle en verre dans de l’eau puis de l’éthanol, puis laissez-les sécher à l’air. Ensuite, prenez des disques Micah et décollez la couche extérieure à l’aide de ruban adhésif. Fixez le disque MICA à une lamelle à l’aide d’une goutte de colle transparente optiquement transparente.

Fixez ensuite les bouteilles en plastique au MICA à l’aide de graisse sous vide et assurez-vous qu’il n’y a pas de fuites. Versez toute la solution liposomique directement sur le mica et ajoutez 140 microlitres supplémentaires de tampon bicouche lipidique soutenu pour atteindre un volume de 300 microlitres. Ensuite, ajoutez 0,9 microlitre d’une solution molaire de chlorure de calcium pour atteindre une concentration finale de trois millimolaires de calcium, incubez les échantillons pendant deux minutes à 37 degrés Celsius, puis pendant au moins 10 minutes à 65 degrés Celsius au cours de cette étape, préchauffez également le tampon bicouche lipidique soutenu à 65 degrés Celsius.

Ajouter un tampon si nécessaire pour s’assurer que l’échantillon ne se dessèche pas. Couvrir la chambre d’échantillonnage avec une lamelle de protection permettra également de garder l’échantillon hydraté. Ensuite, rincez doucement l’échantillon avec le tampon lipidique par couche soutenu par le préchauffage 10 à 15 fois pour éliminer le calcium et les vésicules non fusionnées.

Faites très attention pendant les étapes de lavage pour éviter que la bicouche ne se dessèche après les étapes de lavage. Refroidissez les bicouches supportées à température ambiante. Avant les mesures sur le microscope à force atomique, configurez le microscope à force atomique ou un FM pour effectuer l’imagerie des bicouches lipidiques dans une solution.

En utilisant le mode de contact conformément aux spécifications du fabricant, ajoutez du tampon à l’échantillon pour le maintenir immergé dans le tampon pendant toute la durée de l’expérience. Montez l’échantillon sur la platine A FM et assurez-vous que tous les modules d’isolation des vibrations sont allumés. Attendez au moins 15 minutes que le système s’équilibre et réduise la dérive thermique.

Ensuite, approchez l’échantillon en mode contact avec une pointe en porte-à-faux FM souple jusqu’à ce que le contact soit établi. Comme les bicouches sont très fragiles, minimisez le point de consigne de la pointe A FM lors de l’imagerie en mode contact pour maintenir la force au minimum et corriger la dérive thermique tout en maintenant le contact avec l’échantillon. Une fois l’imagerie terminée, traitez les images en ajustant chaque ligne de balayage aux fonctions de nivellement polynomial.

Effectuez l’ablation de la ligne pour les balayages qui perdent le contact avec la membrane. À l’aide du logiciel propriétaire de l’entreprise de fabrication A FM, calibrez le porte-à-faux en suivant le protocole du fabricant afin de déterminer la conversion correcte du signal électrique en une mesure de force. Après avoir imagé une zone de la bicouche, sélectionnez une région de cinq microns sur cinq microns dans la bicouche pour effectuer une spectroscopie de force.

Configurez les AFM de manière à ce qu’il prenne des courbes de force dans une grille de 16 par 16 de cette région, ce qui donne 256 courbes de force par région. Réglez ensuite le déplacement Z piso à 400 nanomètres. Cela détermine l’amplitude de mouvement maximale du piézo z et garantit que le cantilever s’est complètement rétracté de l’échantillon entre les mesures.

Ensuite, réglez la vitesse d’approche à 800 nanomètres par seconde et la vitesse de rétractation à 200 nanomètres par seconde. Définissez également la force cible maximale pour chaque courbe de force dans ce cas, 12 nano Newton. Après avoir configuré tous les paramètres, acquérez les courbes de force en appuyant sur le bouton de course du logiciel A FM.

Acquérez au moins 500 courbes de force pour chaque condition afin d’assurer de bonnes statistiques, tracez un histogramme des valeurs, puis ajustez les histogrammes à une distribution gaussienne afin d’obtenir le pic et la largeur de la distribution. En raison de la composition lipidique utilisée dans cette étude, deux régions membranaires principales se forment. Il existe une région ordonnée liquide composée de fing, de myéline et de cholestérol, et une région désordonnée liquide composée principalement de DOPC.

Le profil de hauteur de l’imagerie A FM peut fournir des informations importantes sur la structure de la membrane en regardant le profil de hauteur. L’épaisseur de la bicouche peut être mesurée en utilisant la présence de défauts de la membrane. La carte de hauteur peut également être utilisée pour mesurer la différence de hauteur entre les phases ordonnées et désorganisées.

Les courbes de force dérivées du mode de spectroscopie de force sont utilisées pour mesurer la force de percée en calculant la valeur de la force au sommet de la courbe de force, comme indiqué ici. De plus, l’épaisseur de la membrane peut être dérivée en soustrayant la valeur de distance du pic de la courbe de force à la valeur de distance. Lorsque la courbe de force recommence à augmenter, tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de conserver la solution de stratification B et de surveiller constamment l’assemblage FM pour corriger les effets de la dérive thermique et de l’accumulation de D sur la pointe Après cette procédure.

D’autres méthodes comme la microscopie confocale à fluorescence peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la dynamique membranaire. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer les calques soutenus par des couches et d’utiliser un FM pour imager et étudier les propriétés physiques de ces bicouches.