Name: Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Découvrez la microscopie à force atomique pour imager et caractériser les propriétés mécaniques des bicouches lipidiques supportées. Cette méthode permet d'étudier la structure membranaire à haute résolution.

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Ce travail a été soutenu par la Société Max Planck, le cancer Centre allemand de recherche, l&#39;Université de Tübingen, et le Bundesministerium für Bildung und Forschung (accorder. Pas 0312040). Nous remercions Eduard Hermann de nous aider à automatiser l&#39;analyse des données de la courbe de la force et le Dr Jakob Suckale la lecture attentive de ce manuscrit.

1. Préparation de bicouches lipidiques supportées (SLB) 11,12,21 <ol><li> Préparation de lipides Mélange vésicules multilamellaires et Suspensions <ol><li> Préparer les tampons suivants à l&#39;avance. <ol><li> Préparer tampon PBS à des concentrations de 2,7 mM de KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4 et NaCl 137 mM, pH 7,2. </li><li> Préparer SLB (soutenu bicouche lipidique) à des concentrations de tampon NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4. </li><li> Préparer une solution de 1 M de CaCl2. </li></ol></li><li> Dissoudre les lipides suivants dans le chloroforme à une concentration désirée: par exemple, la di-oléyl-phosphatidylcholine (DOPC) à 25 mg / ml, la sphingomyéline (SM) à 25 mg / ml et le taux de cholestérol (Chol) à 10 mg / ml. </li><li> Prenez 18,38 pi de DOPC, 17,10 pi de SM et 11,30 pi de Chol pour faire une solution avec 1 mg de lipides totaux dans un 2: 2: 1 DOPC: rapport molaire Chol: SM. Variez les volumes en conséquence sur la base du concentrations des lipides préparés en 1.1.2. Cependant, maintenir le rapport molaire de 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, que de changer le rapport molaire va changer les caractéristiques de phase de la membrane 25. </li><li> Mélanger la solution complètement au vortex. Ajouter un colorant fluorescent lipidique à 0,05% en moles si l&#39;on veut visualiser la bicouche par un microscope à fluorescence. Remarque: La famille de dialkylcarbocyanines à longue chaîne, comme l&#39;a fait, Dil et DiO couvrent un large éventail de longueurs d&#39;onde et peuvent être idéalement utilisés pour marquer des membranes lipidiques. En variante, des lipides marqués par fluorescence, tels que la phosphatidyléthanolamine ou la rhodamine-BODIPY-cholestérol peuvent être utilisés. Dans tous les cas, la concentration du colorant doit être optimisée en fonction du réglage de la microscopie, en gardant à l&#39;esprit que des concentrations élevées du fluorophore lié au lipide peuvent modifier le comportement des lipides 19. </li><li> Séchez le chloroforme en utilisant du gaz N 2 (ou tout gaz inerte disponibles tels que Ar et He). </li><li> En outre t secil lipide mélange sous vide pendant au moins 1 heure. Note: Si vous rangez ce mélange lipidique, purger l&#39;air avec un gaz inerte (N 2, Ar ou He) et conserver à -20 ° C. Aliquoter excès de lipides-en-chloroforme dans de petits flacons bruns. Séchez-les d&#39;une manière similaire à celle du mélange de lipides, déplacer l&#39;air avec un gaz inerte (N 2, Ar ou He) et conserver à -20 ° C. </li><li> Dissoudre les lipides séchés dans du tampon PBS à une concentration de 10 mg / ml. </li><li> Vortex vigoureusement le mélange pendant environ 20 sec à 1 min pour obtenir une suspension trouble, contenant des vésicules multilamellaires. Assurez-vous que la il n&#39;y a pas de films lipidiques coller aux parois de la fiole. </li><li> Distribuer cette suspension dans 10 aliquotes (1 mg de lipides fait 10 aliquotes). </li><li> Stocker à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol></li><li> Préparation de vésicules unilamellaires Remarque: Les diverses tailles des vésicules unilamellaires peuvent être préparés en utilisant le procédé de sonication ou le procédé d&#39;extrusion. Sonication utilise sound énergie pour agiter le mélange et séparer les couches de la suspension multilamellaire. Ceci est indiqué par le nettoyage de la suspension brumeux. Extrusion force les vésicules multilamellaires de passer à travers un filtre à membrane ayant une taille de pore définie. <ol><li> Méthode de Sonication <ol><li> Prenez les 10 pi de suspensions lipidiques multilamellaires et ajouter 150 pi de tampon SLB. </li><li> Transférer le mélange dans de petits (2 ml) flacons de verre plafonnés et sceller avec du Parafilm. </li><li> Soniquer le mélange à la température ambiante dans un bain sonique pendant 10 min ou jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne clair pour donner de petites vésicules unilamellaires (SUV, en dessous de 50 nm de diamètre). </li></ol></li><li> Extrusion Méthode <ol><li> Prenez les 10 pi de suspensions lipidiques multilamellaires et ajouter 150 pi de tampon SLB. </li><li> Transférer la suspension dans un tube cryogénique. </li><li> Geler la suspension de lipides en immergeant le tube cryogénique pour quelques secondes dans de l&#39;azote liquide. </li><li> Décongeler lesuspension lipidique en immergeant le tube cryogénique dans un bain d&#39;eau à température ambiante ou 37 ° C pendant quelques minutes. Répétez les étapes de gel-dégel au moins 10 fois. </li><li> Pour extruder la suspension de lipides, en utilisant une membrane de polycarbonate de 200 nm de taille de pores (d&#39;autres tailles de pores sont disponibles comme, 100 nm ou 400 nm) et un dispositif d&#39;extrusion 26 commerciale. Remarque: Actuellement, il existe deux dispositifs d&#39;extrusion disponibles dans le commerce: une extrudeuse manuel est disponible pour de petits volumes (200 pi à quelques ml). Dans ce cas, l&#39;échantillon est extrudé à travers la membrane en poussant manuellement la suspension avant et en arrière entre deux seringues. Selon le fabricant, devraient être combinées pour atteindre son volume minimum de la mise en place des aliquotes lipidiques. Pour de plus grands volumes (jusqu&#39;à 50 ml) dispositifs plus sophistiqués qui sont utilisés dans la suspension est forcée à travers la membrane de polycarbonate à l&#39;aide de gaz comprimé. SET-UP et extrusion conditions peuvent changer selon le model. Reportez-vous aux instructions du fabricant avant de l&#39;utiliser. Ce protocole se réfère à l&#39;extrudeuse manuelle pour les petits volumes. </li><li> Equilibrer l&#39;extrudeuse dans l&#39;eau en faisant passer l&#39;eau à travers l&#39;extrudeuse. Plonger la membrane dans l&#39;eau. </li><li> Placer la membrane entre les deux pistons, l&#39;assemblage du dispositif et équilibrer dans du tampon, en faisant passer le tampon à travers l&#39;extrudeuse, d&#39;une seringue à l&#39;autre. Cette étape permet de tester en outre la perméabilité du système. En cas de fuite, démonter et le remonter à nouveau changer la membrane. </li><li> Prendre la suspension de lipides en utilisant une seringue de l&#39;extrudeuse («côté sale &#39;). </li><li> Fixer la seringue contenant la suspension de lipides sur une chambre et la seringue vide sur la chambre adverse. </li><li> Poussez la seringue sur une extrémité. Filtrer la solution à travers la membrane et dans la seringue opposée. Ceci est la passe 1 er. </li><li> Passer à travers la membrane pour un total de 31 fois cesque la solution se termine sur la seringue opposée («côté propre»). Remarque: Vérifiez la membrane après extrusion. Si elle a été rompue, puis procédé d&#39;extrusion a échoué et doit être répétée. </li><li> Vider la seringue dans un petit tube. Grandes vésicules unilamellaires (LUV) sont stables pendant 1-2 jours si elles sont conservées à 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Préparation de Mica et Lamelles <ol><li> Laver lamelles de première dans l&#39;eau puis dans l&#39;éthanol. Sécher à l&#39;air. </li><li> Prenez disques de mica et de décoller la couche externe avec du ruban adhésif. </li><li> Fixez le disque de mica sur la lamelle. Colles optiques transparents est optimisé de manière que l&#39;on peut vérifier les bicouches avec un microscope à fluorescence. </li><li> Attacher des cylindres en plastique (diamètre extérieur 2,5 cm, 2 cm de diamètre intérieur et 0,5 cm de hauteur) en utilisant de la colle optique / graisse. Assurez-vous que tout est scellé et qu&#39;il n&#39;y a pas de fuites. Utiliser de la graisse quand on veut réutiliser les bouteilles, car ils peuvent être facilement détachés de ee lamelle et lavé. Les dimensions des cylindres en plastique dépendent de la taille du support de cantilever AFM et doivent être ajustés en conséquence. </li></ol></li><li> Dépôt de vésicules unilamellaires sur support solide <ol><li> Pipeter l&#39;ensemble de la solution de liposome directement sur le mica. Ajouter davantage de tampon SLB pour atteindre un volume de 300 pi. </li><li> Ajouter 0,9 pl d&#39;une solution de chlorure de calcium M pour atteindre une concentration finale de 3 mM de Ca 2+. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 2 minutes et ensuite à 65 ° C pendant au moins 10 min. Toujours couvrir les bicouches avec le tampon. Le contact avec les bulles d&#39;air et aériennes détruire. Pendant l&#39;incubation, ajouter plus de mémoire tampon si nécessaire, surtout si incubation à des températures plus élevées. Remarque: Les températures d&#39;incubation varient en fonction des mélanges lipidiques et les phases nécessaires. Le temps d&#39;incubation d&#39;au moins 10 min est nécessaire pour former des bicouches en charge, mais il pourrait être plus long, en fonction de la température et de la composition. </li><li> Lavageavec la bicouche chaude (65 ° C) de 15 à 20 fois SLB tampon pour éliminer le calcium et les vésicules non fusionnées. Prenez soin supplémentaire pendant les étapes de lavage pour garder la bicouche sous tampon et pipeter doucement la solution de lavage pour éviter de détruire la bicouche. </li><li> Bicouches frais pris en charge à la température ambiante avant les mesures de l&#39;AFM. Cela est nécessaire pour former les différentes phases de la membrane ainsi que de minimiser la dérive thermique dans l&#39;instrument. </li></ol></li></ol> 2. microscopie à force atomique Mesures 11,12 <ol><li> Imagerie Remarque: Effectuez imagerie par microscopie à force atomique en mode contact ou en mode taraudage. Image supportés bicouches en solution; ne permettent pas de solution à évaporer complètement car cela va détruire les bicouches. Comme on pouvait travailler avec tampon, s&#39;il vous plaît respecter les consignes de sécurité à faire en sorte qu&#39;une partie de l&#39;AFM est protégée contre les déversements de liquides. <ol><li> Sélectionnez un cantilever douce (inférieure à 0,2 N / m constante de ressort est conseillé) et le monter à til AFM. Le choix de la raideur en porte à faux est plus critique pour la spectroscopie de force (et cela sera discuté plus tard). </li><li> Monter l&#39;échantillon sur la scène de l&#39;AFM et assurez-vous que tous les modules de vibration-isolement sont allumés. Attendez au moins 15 minutes pour équilibrer et de réduire la dérive thermique du système. Selon l&#39;AFM set-up, tuning et d&#39;imagerie spécifications peuvent varier. Consultez le manuel du fabricant. </li><li> Approchez l&#39;échantillon avec la pointe de l&#39;AFM jusqu&#39;à ce contact. </li><li> Depuis bicouches lipidiques sont habituellement de 4 nm de hauteur, utiliser le Z-gamme de l&#39;instrument qui donnera la plus haute résolution z (par exemple 1,5 um). </li><li> Sélectionnez une région à l&#39;image. Pour avoir un aperçu de la bicouche lipidique, 50 um x 50 um ou 25 um x 25 um région sera un bon point à l&#39;image de départ. Si les petites fonctionnalités apparaissent, on peut image dans des zones plus petites (10 um x 10 um, ou 2 x 2 pm pm). Le choix de la zone de formation d&#39;image dépend également de la r travailange du scanner piézoélectrique. S&#39;il vous plaît consulter le manuel de l&#39;instrument pour cela. </li><li> Comme bicouches sont très fragiles, régler le point de la pointe AFM de jeu lors de l&#39;imagerie de garder la force au minimum et corriger la dérive thermique, tout en maintenant le contact avec l&#39;échantillon. En mode de contact, de minimiser le point de consigne. En mode tapping, maximiser le point de consigne. </li><li> Traiter les images en ajustant chaque ligne de balayage à des fonctions de mise à niveau de polynômes. Effectue la suppression de la ligne pour les scans qui perdent contact avec la membrane en utilisant le logiciel propriétaire de l&#39;entreprise de fabrication de l&#39;AFM. </li></ol></li><li> Spectroscopie de force <ol><li> Calibrer le cantilever en suivant les instructions selon le protocole du fabricant. L&#39;étalonnage permet la conversion du signal électrique des photodiodes de force (Figure 1B). <ol><li> Calibrer la sensibilité de la pointe pour mesurer la déviation que le mouvement z-piézo (en unités de longueur) à la place du signal électrique en volts. <br /&gt; Remarque: AFM détecte les variations de la déviation du cantilever l&#39;aide d&#39;un laser réfléchi à l&#39;arrière du cantilever. Le laser atteint une photodiode qui peut spatialement détecter la position de la tache laser. Une modification de la déviation du cantilever tel qu&#39;il se plie lors d&#39;un contact avec l&#39;échantillon est détectée par la photodiode en tant que cette &quot;déviation verticale&quot;, ce qui est dans les unités de tension. Étant donné que le cantilever est proposé par l&#39;élément piézo-z, la déviation verticale est en relation avec le mouvement dans la piézo-z. Le rapport entre la déviation verticale et z-mouvement est appelé la sensibilité et la conversion de la tension à la distance. </li><li> Calculer la constante de ressort en porte à faux en utilisant la méthode de fréquence de bruit thermique, habituellement incorporé dans le logiciel de l&#39;AFM. Dans ce procédé, tracer l&#39;amplitude de vibration de bruit par rapport à la fréquence d&#39;oscillation, la création d&#39;un diagramme de densité spectrale de puissance. Cette parcelle se montrer un pic autour de la fréquence de résonance. La fréquence où l&#39;amplitude is la plus grande est la fréquence de résonance. Monter une fonction lorentzienne autour du pic de calculer automatiquement la constante de rappel par le logiciel. Certaines des ressources utiles pour la théorie de la méthode de bruit thermique sont données dans les références 27-30. </li></ol></li><li> Après imager une zone de la bicouche, sélectionner une région de 5 x 5 pm pm dans la bicouche à effectuer la spectroscopie de force. </li><li> Mettre en place l&#39;AFM afin qu&#39;il prenne courbes de force dans une grille de cette région 16 x 16. Cela se traduit par 256 courbes de force par région. L&#39;espace entre deux points voisins devrait être suffisant pour éviter que la surface de la membrane est sondée par un point coïnciderait avec le point suivant. Cela dépend sur le rayon de la pointe. Une distance de 100 nm entre deux points serait idéal. Diviser la région x 5 pm 5 pm en 16 x 16 grille. Selon la taille de la phase, on peut sélectionner une région plus ou moins grande, et ensuite ajuster la taille de la grille en conséquence. </li><li> Ensemble piézo-z de déplacement400 nm. Cela détermine la portée maximale de mouvement de la z-piézo. Il devrait être assez grand pour faire en sorte que le cantilever a complètement rétractée loin de l&#39;échantillon entre les deux mesures. </li><li> Réglez la vitesse d&#39;approche de 800 nm / s et se rétracter vitesse à 200 nm / sec. Utiliser une vitesse d&#39;approche entre 400 à 6000 nm / s en fonction de la composition de la bicouche lipidique et de la phase à étudier 6,16. </li><li> Après la mise en place de tous les paramètres, acquérir courbes de force, en appuyant sur le bouton &quot;run&quot; du logiciel de l&#39;AFM. </li><li> Enregistrer courbes de force que la force en fonction des courbes de hauteur (une mesure de mouvement z-piézo). Ceci ne tient pas compte de la flexion de la poutre lors du contact avec l&#39;échantillon. Lors de l&#39;étape de traitement de données, le logiciel de l&#39;AFM permet correction pour cantilever pliage pour obtenir la force en fonction des courbes de séparation pointe de l&#39;échantillon (figure 1C), ce qui donnera des valeurs correctes pour l&#39;épaisseur de la bicouche. Les valeurs de correction sont habituellement incorporés dans le calibration, qui est enregistré avec chaque courbe de force. Calculer la séparation pointe-échantillon en soustrayant la déviation verticale du mouvement piézoélectrique à un moment donné. Remarque: Le pic de la courbe de force d&#39;approche (la valeur de la force descend même si le mouvement en porte à faux est toujours sur le cycle d&#39;approche) est la force de rupture de la membrane, tandis que la différence entre la position de ce pic et la position du point où la force commence à se lever à nouveau fournit l&#39;épaisseur de la membrane. </li><li> Acquérir au moins 500 courbes de force pour chaque condition d&#39;obtenir de bonnes statistiques. Tracer un histogramme des valeurs en utilisant des programmes comme origine ou de MatLab, et monter les histogrammes pour une distribution gaussienne pour obtenir le pic et la largeur de la distribution. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

SLBS composés de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ont été formés sur mica vésicule après adsorption et de la rupture induite par le chlorure de calcium. Cette composition lipidique séparé en L D et L o phases. La phase L o est enrichi en sphingomyéline et cholestérol est moins fluide et / plus visqueux (figure 1A) de la phase de 11 Ld. La séparation de la L o L d à partir de la phase se manifeste en tant que structures circulaires suré...

Microscopie à force atomique (AFM) génère une image d&#39;une surface par balayage sur une zone de l&#39;échantillon en utilisant une console avec une pointe très fine 1. Le mouvement de la sonde en porte à faux de la topologie de surface de l&#39;échantillon. AFM a été largement appliquée à des molécules biologiques - y compris les protéines, l&#39;ADN et les membranes, en raison de sa polyvalence dans l&#39;analyse des échantillons fixés dans l&#39;air ou de l&#39;état quasi-native dans un liquide 2-5. Outre sa capacité d&#39;imagerie à haute résolution dans l&#39;ordre du nanomètre, le cantilever AFM agit comme un ressort pour sonder les forces d&#39;interaction (d&#39;adhérence et de répulsion) et les propriétés mécaniques de l&#39;échantillon 5,6. Ceci est connu comme la spectroscopie de force. Dans ce mode, la sonde se rapproche de la première de l&#39;échantillon et exerce une force sur elle, puis est rentré jusqu&#39;à ce qu&#39;il perd le contact avec l&#39;échantillon (figure 1A). Les courbes montrent générés force en fonction de la distance du levier à la fois pour l&#39;applicationle gardon et la rétraction. Plusieurs propriétés, y compris le module d&#39;élasticité pour mesurer la rigidité d&#39;un matériau, et les forces d&#39;adhérence peuvent être obtenues. Bicouches lipidiques supportées sont des membranes modèles biologiques situées sur le dessus d&#39;un support solide - habituellement le mica, le verre borosilicate, silice fondue, ou de silicium 7 oxydé. Ils sont préparés en utilisant différentes techniques comme le dépôt de la vésicule, de méthode et de Langmuir-Blodgett spin-coating 8,9. Imagerie AFM a été utilisée pour suivre la formation de ces bicouches supportées 10, et sonder différentes structures formées par des membranes de différentes compositions 11 à 15. Effectuer la spectroscopie de force sur les résultats bicouches pris en charge dans un pic dans la courbe d&#39;approche. Ce pic indique la force nécessaire pour percer la bicouche, et est appelée force de percée. L&#39;épaisseur de la double couche peut également être mesurée en utilisant la courbe de force 6. La force typique de percée de bicouchescomprise entre 1-50 nN 6. Ces propriétés dépendent de lipide emballage (liquide ou gel de phase) et la structure (longueur de chaîne acyle et le degré d&#39;insaturation) et modifié par des agents de la membrane 16 actif. La théorie derrière la rupture a été expliqué 17 et d&#39;autres paramètres expérimentaux tels que cantilever douceur, rayon de la pointe et de la vitesse d&#39;approche affectent également la force de percée 15,16,18. la spectroscopie de force a été utilisé pour analyser les propriétés des différentes phases lipidiques 11,19, les changements de composition dépendant 12,20, ainsi que des effets d&#39;autres biomolécules, telles que des peptides, sur la stabilité de la membrane 21. Le plat d&#39;orientation de bicouches supportées est avantageux pour combiner AFM avec d&#39;autres méthodes telles que la résonance plasmonique de surface 22 et la microscopie à fluorescence 11,19 pour mieux caractériser la structure et les propriétés des membranes. Ce proto vidéo détailléecol est destiné à préparer bicouches lipidiques supportées en utilisant le dépôt de la vésicule et les analyser avec l&#39;AFM et spectroscopie de force. Bien que les vésicules de différentes tailles peuvent être utilisés pour préparer des bicouches, ce protocole se concentre sur les petites et grandes vésicules unilamellaires. Bicouches pris en charge cette phase séparer en liquide commandé (L o) et désordonnés (L) d phases liquides ont été caractérisées 11,15. La membrane est constituée de di-oléoyl-phosphatidylcholine (DOPC), la sphingomyéline (SM), et du cholestérol (Chol) à 2: 2: 1. Cette composition modèles les radeaux lipidiques, qui sont proposées à se comporter comme des plateformes importantes pour le trafic de protéines et de tri, la signalisation cellulaire et d&#39;autres processus cellulaires 23,24.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850375P</td><td>Se présente sous forme de poudre lyophilisée dans des flacons scellés. Dissoudre toute la poudre dans le chloroforme à l’ouverture. Stocker l’extra sous forme de films lipidiques séchés, sous atmosphère inerte, à -20&nbsp ; &deg ;C. Visitez <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp ; view=article& id=1679& Itemid=398">ici</a> pour plus d’informations sur le stockage et la manipulation.</td></tr><tr><td>Sphingomyéline (cerveau, porcin)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860062P</td><td>Se présente sous forme de poudre lyophilisée dans de grands récipients en plastique scellés. Dissoudre une pointe de spatule de poudre de poudre dans le chloroforme à l’ouverture. Stocker l’extra sous forme de films lipidiques séchés, sous atmosphère inerte, à -20&nbsp ; &deg ;C. Visite <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp ; view=article& id=1679& Itemid=398">ici</a> pour plus d’informations sur le stockage et la manipulation.</td></tr><tr><td>Cholestérol</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td>Se présente sous forme de poudre lyophilisée dans de grands récipients en plastique scellés. Dissoudre une pointe de spatule de poudre de poudre dans le chloroforme à l’ouverture. Stocker l’extra sous forme de films lipidiques séchés, sous atmosphère inerte, à -20&nbsp ; &deg ;C. Visite <a href="http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp ; view=article& id=1679& Itemid=398">ici</a> pour plus d’informations sur le stockage et la manipulation.</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl), 99,8 %</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl), 88 %</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogénophosphate de sodium (Na2HPO4), >99 %</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrogénphosphate de potassium (KH2PO4), 99 %</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2), qualité biologie moléculaire</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, qualité biologie moléculaire</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Lamelle de verre, 24&nbsp ; x&nbsp ; 60&nbsp ; mm, 1&nbsp ; mm d’épaisseur</td><td>Duran Group</td><td>2355036</td><td></td></tr><tr><td>Punch and Die</td><td>Set Precision Brand Products, Inc</td><td>40105</td><td></td></tr><tr><td>Adhésif optique</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA 88</td><td>Adhésif liquide qui durcit lorsqu’il durcit sous une lumière UV de grande longueur d’onde.</td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td>Mica bloque</td><td>NSC Mica Exports Ltd.</td><td></td><td>Il s’agit de morceaux de mica d’une superficie d’au moins 1 pouce carré et d’une épaisseur allant de 0,006 pouce à 0,016 pouce. Ils sont coupés à une taille spécifique par l’entreprise pour l’expédition. De petits disques de mica peuvent être perforés à partir des blocs de mica à l’aide du jeu de poinçons et de matrices.&nbsp ; Manipulez toujours le mica avec des gants ou une pince à épiler.</td></tr><tr><td>Équipement de laboratoire Foreur de graisse</td><td>Chemie AG</td><td>Extrudeuse de liposomes Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Avestin</td><td>LiposoFast-Basic</td><td>Comme alternative, on peut également consulter les offres de Northern Lipids, Inc.</td></tr><tr><td>Ruban adhésif</td><td>3M</td><td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1 pouce)</td><td></td></tr><tr><td>Sonicateur de bain</td><td>Bandelin Sonorex Digitec</td><td>DT-31</td><td>Pas de chauffage, Fréquence : 35 kHz, Puissance de crête ultrasonique : 160 W, Puissance HF : 40 W. (<a href="http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf">Fiche technique</a>)</td></tr><tr><td>Nitrure de silicium AFM Cantilever&nbsp ;</td><td>Sondes AFM Bruker</td><td>DNP-10</td><td>Chaque porte-à-faux a quatre pointes et leur rayon d’extrémité nominal est de 20 nm (avec un maximum possible de 60 nbsp ; nm). Sur la base des spécifications, nous utilisons la pointe D avec une fréquence de résonance de 18 kHz et une constante de ressort nominale de 0,06 N/m.</td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>JPK Nanowizard II monté sur Zeiss Axiovert 200</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

La microscopie à force atomique (AFM) est une technique d’imagerie polyvalente à haute résolution qui permet de visualiser les membranes biologiques. Il a un grossissement suffisant pour examiner les sous-structures membranaires et même les molécules individuelles. L’AFM peut agir comme une sonde de force pour mesurer les interactions et les propriétés mécaniques des membranes. Les bicouches lipidiques supportées sont conventionnellement utilisées comme modèles membranaires dans les études AFM. Dans ce protocole, nous montrons comment préparer des bicouches supportées et caractériser leur structure et leurs propriétés mécaniques à l’aide de l’AFM. Il s’agit notamment de l’épaisseur de la bicouche et de la force de percée. 
Les informations fournies par l’imagerie AFM et la spectroscopie de force aident à définir les propriétés mécaniques et chimiques des membranes. Ces propriétés jouent un rôle important dans les processus cellulaires tels que le maintien de l’hémostase cellulaire contre le stress environnemental, le rapprochement des protéines membranaires et la stabilisation des complexes protéiques.

Bicouches lipidiques supportées composées de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ont été imagées en AFM (Figure 2 AC). En raison de la composition des lipides, SM / Chol-riche et DOPC L o L d riches en phases ont été observés. Le profil de hauteur de l&#39;imagerie AFM peut fournir des informations importantes sur la structure de la membrane. En regardant le profil de hauteur, l&#39;épaisseur de la bicouche peut être mesurée en présence de défauts dans la membrane (figure 2B),</strong...

Nous décrivons un protocole de préparation de bicouches lipidiques supportées et sa caractérisation à l’aide de la microscopie à force atomique et de la spectroscopie de force.

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'observer et d'analyser les propriétés physiques de membranes en séparation de phases à l'aide de la microscopie à force atomique. Cela est réalisé en mélangeant d'abord du dilio, de la phosphatidylcholine, du fgo, de la myéline et du cholestérol selon un rapport de deux à deux à un, afin de former un mélange lipidique en séparation de phases. Ensuite, les bicouches lipidiques supportées sont préparées en déposant la suspension de liposomes sur une surface en MICA à l'aide de la microscopie à force atomique.La surface de la bicouche est ensuite balayée, produisant une image topographique dans laquelle des caractéristiques structurales telles que la hauteur peuvent être mesurées. Ensuite, une spectroscopie de force est réalisée sur des zones spécifiques de la bicouche afin d'explorer les propriétés physiques de celle-ci, notamment la force de rupture et l'épaisseur de la membrane. En définitive, les résultats montrent des différences de propriétés entre les différentes phases lipidiques, basées sur des images de microscopie à force et des courbes de force.Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la microscopie par fluorescence, réside dans l'amélioration de la résolution et dans les propriétés supplémentaires qu'un microscope à force peut explorer sur l'échantillon. Cette méthode permet de répondre à des questions clés dans le domaine de la biophysique, telles que la structure des membranes biologiques et des protéines intégrées dans ces membranes. De plus, nous pouvons également examiner les propriétés physiques de la membrane et surveiller comment des modifications de sa composition ou l'ajout d'agents actifs sur la membrane pourraient altérer ces propriétés.En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés en raison de la nature fragile de l'échantillon. Cela a des implications sur la préparation de l'échantillon, la manipulation, le choix des leviers et les conditions d'imagerie et de spectroscopie en mode force. Commencez par dissoudre du DOPC, de la spino, de la myéline et du cholestérol dans du chloroforme aux concentrations souhaitées. Ensuite, mélangez 18,38 microlitres de DOPC, 17,1 microlitres de myéline et 11,3 microlitres de cholestérol pour obtenir une solution contenant un milligramme de lipides totaux et un rapport molaire respectif de deux pour deux pour un.Mélanger une solution par vortex, sécher le mélange à l’aide d’un gaz inerte tel que l’azote, puis poursuivre le séchage sous vide pendant au moins une heure. Ensuite, dissoudre les lipides séchés dans 100 microlitres de PBS pour obtenir une concentration de 10 milligrammes par millilitre. Agiter vigoureusement le mélange par vortex pendant environ une minute.Pour obtenir une suspension trouble contenant des vésicules multilamellaires. Veiller à ce qu'aucun film lipidique ne reste attaché aux parois du flacon. Prélever 10 microlitres de la suspension lipidique multilamellaire et ajouter 150 microlitres de tampon de bicouche lipidique supportée.Ensuite, mélanger une solution et la transférer dans un petit flacon en verre bouché de deux millilitres, puis le sceller avec du film parafilm et soniquer. Mélanger la solution à température ambiante dans un bain sonique pendant 10 minutes. Pendant ce temps, la solution doit devenir limpide et former de petites vésicules unilamellaires dont le diamètre est d'environ 50 nanomètres.Lavez les lamelles de verre à l'eau, puis à l'éthanol, et laissez-les sécher à l'air libre. Ensuite, prenez les disques MICA et retirez la couche externe à l'aide d'un ruban adhésif. Fixez le disque MICA sur une lamelle à l'aide d'une goutte de colle transparente et optiquement claire.Ensuite, fixez des cylindres en plastique sur la mica à l’aide de graisse à vide et assurez-vous qu’il n’y ait aucune fuite. Pipetez toute la solution de liposomes directement sur la mica et ajoutez 140 microlitres supplémentaires de tampon de bicouche lipidique supportée afin d’atteindre un volume total de 300 microlitres. Ajoutez ensuite 0,9 microlitre de solution de chlorure de calcium à une molaire afin d’obtenir une concentration finale de trois millimolaire en calcium, incubez les échantillons pendant deux minutes à 37 degrés Celsius, puis pendant au moins 10 minutes à 65 degrés Celsius. Pendant cette étape, préchauffez également le tampon de bicouche lipidique supportée à 65 degrés Celsius.Ajoutez du tampon si nécessaire pour vous assurer que l'échantillon ne s'assèche pas. Couvrir la chambre à échantillon avec une lame couvre-objet permet également de maintenir l'hydratation de l'échantillon. Rincez ensuite délicatement l'échantillon avec le tampon de la bicouche lipidique préchauffée de 10 à 15 fois afin d'éliminer le calcium et les vésicules non fusionnées.Prenez des précautions supplémentaires lors des étapes de lavage pour éviter que la bicouche ne s'assèche à aucun moment après les lavages. Refroidissez les bicouches supportées à température ambiante. Avant les mesures au microscope à force atomique, préparez le microscope à force atomique ou un FM pour effectuer l'imagerie des bicouches lipidiques en solution.En utilisant le mode contact conformément aux spécifications du fabricant, ajoutez du tampon à l'échantillon pour le maintenir immergé dans le tampon pendant toute la durée de l'expérience. Montez l'échantillon sur la platine de microscopie à force atomique (AFM) et assurez-vous que tous les modules d'isolation des vibrations sont activés. Attendez au moins 15 minutes afin que le système atteigne l'équilibre et réduise la dérive thermique.Ensuite, approchez l'échantillon en mode contact à l'aide d'une pointe de cantilever FM souple jusqu'à ce que le contact soit établi. Étant donné que les bicouches sont très fragiles, minimisez le point de consigne de la pointe AFM pendant l'acquisition en mode contact afin de maintenir la force au minimum et de corriger la dérive thermique tout en conservant le contact avec l'échantillon. Une fois l'acquisition terminée, traitez les images en ajustant chaque ligne de balayage à des fonctions de nivellement polynomiales.Effectuez la suppression des lignes pour les balayages qui perdent le contact avec la membrane. À l’aide du logiciel propriétaire de la société fabricante du microscope à force atomique, étalonnez le levier en suivant le protocole du fabricant afin de déterminer la conversion adéquate du signal électrique en une mesure de force. Après avoir acquis une image d’une zone de la bicouche, sélectionnez une région de cinq microns sur cinq microns dans la bicouche afin d’effectuer la spectroscopie de force.Configurer les MFA pour qu'elles acquièrent des courbes de force sur une grille de 16 par 16 dans cette région, ce qui donne 256 courbes de force par région. Ensuite, régler le déplacement du pas Z à 400 nanomètres. Cela détermine la plage maximale de déplacement du piézo Z et garantit que le levier a complètement été retiré de l'échantillon entre les mesures.Réglez ensuite la vitesse d'approche à 800 nanomètres par seconde et la vitesse de retrait à 200 nanomètres par seconde. Réglez également la force cible maximale pour chaque courbe de force, dans ce cas, à 12 nano Newtons. Après avoir configuré tous les paramètres, enregistrez les courbes de force en appuyant sur le bouton de démarrage du logiciel A FM.Acquérir au moins 500 courbes de force pour chaque condition afin d'assurer de bonnes statistiques, tracer un histogramme des valeurs, puis ajuster les histogrammes à une distribution gaussienne afin d'obtenir le pic et la largeur de la distribution. En raison de la composition lipidique utilisée dans cette étude, deux régions membranaires principales se forment. Il existe une région liquide ordonnée composée de fing, de myéline et de cholestérol, et une région liquide désordonnée principalement composée de DOPC.Le profil de hauteur obtenu par l'imagerie en AFM peut fournir des informations importantes sur la structure de la membrane en examinant ce profil. L'épaisseur de la bicouche peut être mesurée en exploitant la présence de défauts dans la membrane. La carte de hauteur peut également servir à mesurer la différence de hauteur entre les phases ordonnées et désordonnées.Les courbes de force dérivées du mode de spectroscopie de force sont utilisées pour mesurer la force de rupture en prenant la valeur de force au sommet de la courbe de force, comme illustré ici. En outre, l'épaisseur de la membrane peut être déterminée en soustrayant la valeur de distance au sommet de la courbe de force de la valeur de distance lorsque la courbe de force commence à augmenter à nouveau. Lors de l'exécution de cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir la solution de stratification B et de surveiller constamment l'assemblage FM afin de corriger les effets de la dérive thermique et de l'accumulation de D sur la pointe suite à cette procédure.D'autres méthodes, telles que la microscopie de fluorescence confocale, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme celles portant sur la dynamique des membranes. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des bicouches supportées et utiliser une MF pour visualiser et étudier les propriétés physiques de ces bicouches.

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Bioingénierie

Dans cette vidéo, nous démontrons les interactions protéine-phosphoinositide dans un motif microfluidique à l’aide du test de modulation du pH, en utilisant un colorant fluorescent sensible au pH marqué sur le lipide phosphatidyléthanolamine d’une bicouche lipidique supportée, appelée plateforme microfluidique. Les modulations du pH après la liaison des protéines aux phospholipides provoquent l’extinction de la fluorescence.

Dosage de la modulation du pH sur les bicouches lipidiques supportées pour détecter les interactions protéine-phosphoinositide

Nous présentons une méthode de préparation de mica soutenu bicouches lipidiques pour microscopie à haute résolution. Mica est transparent et plat à l'échelle atomique, mais rarement utilisé dans l'imagerie en raison des difficultés de manipulation; notre préparation résulte en un dépôt régulier de la feuille de mica, et de réduire la matière utilisée dans la préparation de bicouche.

Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d&#39;imagerie

Un protocole permettant de coupler de manière covalente une grande variété de molécules uniques sur une pointe AFM est présenté. Des procédures et des exemples pour déterminer la force d’adhésion et l’énergie libre de ces molécules sur des supports solides et des bio-interfaces sont fournis.

Enquête molécule unique adhérence par force atomique Spectroscopie

Nous présentons un protocole expérimental pour former une bicouche lipidique supporté sur des substrats solides, sans utiliser des vésicules lipidiques. Nous démontrons un procédé en une étape pour former une bicouche lipidique de dioxyde de silicium et l'or ainsi que des membranes supportées par domaine enrichi en cholestérol pour diverses applications biologiques.

Biomembrane Fabrication par le solvant assistée bicouche lipidique (SALB) Méthode

La préparation de bicouches lipidiques planes fonctionnalisées par du verre, la détermination de la mobilité des protéines à l’intérieur et la mesure des densités de protéines sont présentées ici. Une feuille de route pour la construction d’un microscope à réflexion interne totale à bruit réduit est esquissée, qui permet de visualiser des fluorochromes résidents d’une seule bicouche avec une résolution spatio-temporelle élevée.

Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

Ici, nous présentons un protocole pour détecter un seul, les événements de fusion SNARE médiation entre liposomes et bicouches pris en charge dans des canaux microfluidiques utilisant TIRFM polarisée, avec une sensibilité et une seule molécule ~ 15 résolution temporelle msec. Lipid et la libération de la cargaison soluble peuvent être détectés simultanément. la taille des liposomes, des lipides diffusivité et la fusion des pores propriétés sont mesurées.

Fusion SNARE-médiée de Single protéoliposomes avec bicouches supportées Tethered dans une cellule microfluidique débit contrôlé par Polarized FRBR Microscopie

Nous présentons une méthode pour réaliser des images de résolution sous-nanomètre avec (mode tapping) modulation d'amplitude en microscopie à force atomique dans un liquide. La méthode est mise en évidence sur les microscopes à force atomique commerciales. Nous expliquons les raisons de nos choix de paramètres et de suggérer des stratégies d'optimisation de la résolution.

Imaging Résolution Sous-nanomètre avec modulation d&#39;amplitude en microscopie à force atomique en liquide

Cet article décrit les protocoles de préparation des échantillons, de réduction des données et d’analyse des données dans les études d’écho de spin neutronique (NSE) des membranes lipidiques. Le étiquetage judicieux des lipides au deutérium permet d’accéder à différentes dynamiques membranaires sur des échelles de longueur et de temps mésoscopiques, sur lesquelles se produisent des processus biologiques vitaux.

Spectroscopie d’écho de spin neutronique en tant que sonde unique pour la dynamique de la membrane lipidique et les interactions membrane-protéine

Ce protocole décrit la formation de cellules imitant les vésicules unilipidiques et multilipidiques, les bicouches lipidiques soutenues et les bicouches lipidiques en suspension. Ces modèles in vitro peuvent être adaptés pour incorporer une variété de types de lipides et peuvent être utilisés pour étudier diverses interactions entre molécules et macromolécules.

Assemblage de modèles de bicouches lipidiques supportées et suspendues imitant des cellules pour l’étude des interactions moléculaires

La quantification de la zone de contact et de la force appliquée par la pointe d’une sonde de microscope à force atomique (AFM) à une surface d’échantillon permet de déterminer les propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique. Les meilleures pratiques pour mettre en œuvre la nanoindentation à base de porte-à-faux AFM dans l’air ou le fluide sur des échantillons mous et durs pour mesurer le module d’élasticité ou d’autres propriétés nanomécaniques sont discutées.

Microscopie à force atomique Nanoindentation basée sur le porte-à-faux: mesures des propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique dans l’air et les fluides

Un protocole expérimental est présenté pour assembler, stimuler électriquement et analyser les bicouches d’interface de gouttelettes dopées à la gramicidine A. Les relations structure-fonction lipide-protéine sont quantifiées en mesurant les variations de la surface membranaire, du flux ionique et de la conductance à canal unique, et en reliant ces réponses à des changements de conduction ionique similaires à la plasticité dans un modèle membranaire inspiré par des synapses électriques.

Caractérisation de la structure et de la fonction membranaire lipide-protéine à l’aide de bicouches d’interface de gouttelettes

Découvrez la microscopie à force atomique pour imager et caractériser les propriétés mécaniques des bicouches lipidiques supportées. Cette méthode permet d'étudier la structure membranaire à haute résolution.

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

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