Implémentation de In Vitro Résistance au médicament Essais: Maximiser le potentiel pour découvrir cliniquement importants mécanismes de résistance

L’objectif global de cette procédure est de faciliter la découverte préclinique rapide de variantes de nucléotides uniques cliniquement pertinentes qui peuvent entraîner une résistance fonctionnelle à diverses classes de thérapies. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l’oncologie, telles que les mutations génétiques qui peuvent contribuer à la résistance fonctionnelle aux thérapies en clinique et qui pourraient finalement guider l’amélioration des thérapies et les stratégies alternatives de gestion clinique pour les patients résistants aux médicaments. Le principal avantage de cette technique est que, puisque nous facilitons l’émergence de mutations spontanées et appliquons une technologie de dépistage non biaisée chez des clones résistants, il est plus probable que ces variantes soient à l’origine de thérapies ciblées de rechute en clinique.

La démonstration de la procédure sera assurée par un chercheur très talentueux de mon laboratoire pour évaluer le GI 50 pour les lignées cellulaires. Préparez une plaque de dosage en ensemenceant les cellules dans un transparent non transparent. Plaques de fond de 96 puits dans 100 microlitres de milieu cellulaire selon la carte présentée ici.

Préparez une plaque de contrôle de la même manière, en ajoutant des cellules dans les puits bleus et seulement des cellules moyennes dans les puits blancs. Après avoir incubé les plaques à 37 degrés Celsius pendant la nuit, équilibrez le réactif de viabilité cellulaire luminescente à température ambiante et mélangez doucement en inversant. Pour obtenir une solution homogène, ajoutez 80 microlitres de réactif dans les puits de la plaque de contrôle et agitez le contenu pendant 30 minutes.

Pour induire la lyse cellulaire. Utilisez un luminomètre avec une exposition de 0,1 à 1,0 seconde et une longueur d’onde de détection de 560 nanomètres pour enregistrer la luminescence. Ensuite, pour ajouter les composés d’essai aux plaques d’essai, effectuez une série d’une dilution sur quatre des composés dans le DMSO en commençant par une concentration micromolaire de 2000 pour un total de 10 dilutions.

Ajoutez ensuite les composés dilués en série dans le milieu pour obtenir un mélange de composé à une concentration finale de 10. Conservez la plaque composée à moins 20 degrés Celsius pour l’utiliser le troisième jour de l’essai. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de composés dilués aux cellules en trois exemplaires de sorte que la dose la plus élevée soit de 10 micromolaires.

Incuber les plaques à 37 degrés Celsius pendant trois jours. Le troisième jour, préparez un mélange de 400 microlitres de composé X à l’aide des plaques composées préparées trois jours auparavant. Retournez les plaques de dosage pour retirer le milieu et séchez-les deux à trois fois sur des serviettes en papier autoclave.

Ajoutez un composé x à bien ombré en bleu et ajoutez 100 microlitres de puits moyens à périmétriques pour éviter l’évaporation. Le sixième jour, évaluez le nombre relatif de cellules viables en prenant une lecture de luminescence comme démontré précédemment dans la vidéo. Calculez ensuite les valeurs IG 50 à l’aide d’un logiciel tel que PRISM à l’aide des valeurs IG 50 calculées et configurez des cellules pour les tests de résistance aux médicaments.

Si vous travaillez avec un agent cytostatique, ensemencez les cellules à 30 à 40 % de confluence dans des boîtes de culture carrées de 150 millimètres. Si vous travaillez avec un agent toxique, observez les cellules à 70 ou 80 % de confluence. Après avoir déterminé les concentrations initiales de composés conformément au protocole de texte, traiter les cellules avec les composés d’essai pour les composés hautement toxiques, qui provoquent la mort cellulaire dans un essai de viabilité de six jours.

Commencez par l’IG 50 et augmentez progressivement la concentration toutes les deux à trois semaines jusqu’à ce qu’une résistance robuste soit observée. Pour isoler des clones de cellules uniques, utilisez la microscopie à contraste de phase à un grossissement de 40 x pour examiner la boîte de culture et identifier des amas viables de cellules au fond de la boîte. Utilisez un stylo pour marquer les clones de taille moyenne et bien isolés des autres colonies pour choisir des clones à l’aide d’une pipette P 200.

Retirez le milieu de croissance de la boîte et utilisez un XPBS pour rincer toutes les cellules flottantes. Avec la pointe de la pipette, soulevez les clones et transférez-les dans les puits d’une plaque de 48 puits contenant 50 microlitres de trypsine à 0,25 % incuber à 37 degrés Celsius pendant une à deux minutes. Ajoutez ensuite 200 microlitres de milieu frais avec la moitié de la concentration de composé pour permettre une récupération optimale des cellules.

Pour isoler les clones à l’aide de disques de clonage de trois millimètres, placez les disques dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres contenant cinq millilitres de 0,25 % de tripsin EDTA pendant deux minutes. Ensuite, aspirez le milieu de la boîte contenant les clones résistants et superposez les clones avec les disques de clonage trempés. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une à deux minutes selon la facilité avec laquelle les clones se détachent des plaques.

Ensuite, à l’aide d’une pince stérile, prenez les disques de clonage et transférez-les dans des plaques de 48 puits avec 200 microlitres de milieu frais, et faites pipter doucement la concentration du composé de haut en bas pour déloger les cellules des disques de clonage et incubez à 37 degrés pendant la nuit le lendemain, retirez les disques de clonage, incubez les cellules, Ensuite, évaluez la résistance aux médicaments. Selon le protocole textuel, comme indiqué ici, HCT une 16 cellules traitées pendant une période prolongée avec cytotoxique. Le composé numéro un a conduit à l’émergence spontanée de clones résistants qui ont continué à croître pendant le traitement.

Les clones ont été cueillis à l’aide d’un homme à pipette. Dans cette figure, les clones résistants un à trois ont tous montré une résistance significative au composé numéro un et à son analogue proche composé numéro deux, tandis que tous les clones ont montré une sensibilité à un composé cytotoxique non apparenté. Velcade. Après confirmation de la résistance phénotypique, le GDNA a été isolé et soumis à une analyse de séquençage de l’exome entier.

Les variantes structurelles récurrentes et susceptibles d’avoir un impact fonctionnel ont été confirmées par un outil de séquençage indépendant tel que le séquençage de Sanger. Un exemple montré ici portait une mutation faux-sens hétérozygote, et la lignée cellulaire parentale a ensuite été modifiée pour exprimer l’ADNC muté. Alors que la surexpression de l’ADNC de type sauvage n’a pas réussi à conférer une résistance aux médicaments.

Le mutant CD NA a conféré de manière significative une résistance phénotypique au composé numéro un, confirmant le rôle fonctionnel de la variation structurelle en tant que moteur de la résistance. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer une croissance résistante spontanée pour dépister les gènes responsables de la résistance aux médicaments dans les cellules cancéreuses après son développement. Cette technique permet aux chercheurs dans le domaine de l’oncologie d’explorer les mécanismes de résistance aux médicaments de manière impartiale à la fois dans les lignées cellulaires cancéreuses et les modèles animaux.