Name: Souris Direct Trauma / Graver Modèle dossification hétérotopique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Apprenez à induire l'ossification hétérotopique chez la souris par ténotomie d'Achille et brûlure partielle sans facteurs exogènes. Cette méthode permet d'étudier la formation osseuse ectopique post-traumatique.

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Nous remercions Amanda Fair, la CMI, ainsi que Kathy Sweet et l’ORL de l’UM pour leur aide avec l’imagerie et l’analyse μCT. Financement : BL Financé par 1K08GM109105-01 et Plastic Surgery Foundation National Endowment Award.

Déclaration éthique: Toutes les procédures d&#39;animaux ont été effectuées en stricte conformité avec les bonnes pratiques de l&#39;animal tel que défini dans les directives fournies dans le Guide pour l&#39;utilisation et l&#39;entretien des animaux de laboratoire: huitième édition de l&#39;Institute for Laboratory Animal Research (ILAR, 2011) et ont été approuvé par le soin et l&#39;utilisation Commission institutionnelle animale de l&#39;Université du Michigan (PRO0001553). 1. Souris Interventions chirurgicales REMARQUE: Utilisez 8-10 semaine vieille souris C57BL / 6. Autres âges, des origines et souches de souris peuvent également être utilisés pour tester des conditions différentes ou génétique. Pour la partie de ténotomie de la procédure, de maintenir des conditions stériles en utilisant un masque, bonnet de cheveux, et blouse stérile, des gants et des instruments. Sites chirurgicaux doivent être préparés avec stérilement povidone-iode et drapage stérile. Éviter l&#39;hypothermie en utilisant un coussin chauffant vétérinaire et le réchauffement des solutions de réanimation à 37 ° C avant d&#39;administration. <ol><li> Anesthésier la souris en utilisant 2,5% d&#39;isoflurane inhalé. Utilisez un cône de nez de quitter le dos et membres postérieurs facilement accessible. Réglez la vitesse d&#39;administration de l&#39;isoflurane pour maintenir le taux respiratoire appropriée et la coloration des muqueuses et de veiller à l&#39;anesthésie en vérifiant le tonus musculaire, pincement de l&#39;orteil, et réflexe cornéen. Appliquer une pommade ophtalmique fade aux yeux de la souris pour éviter les blessures de l&#39;oeil sec lors de la procédure. Maintenir la température corporelle adéquate en utilisant un coussin chauffant vétérinaire ou circulateur d&#39;eau chaude sous le champ chirurgical. </li><li> Administrer la buprénorphine, 0,1 mg / kg, voie sous-cutanée immédiatement avant l&#39;intervention chirurgicale pour l&#39;analgésie. </li><li> Raser de près le site chirurgical sur la patte arrière gauche l&#39;aide de tondeuses du talon au genou. </li><li> Étroitement raser le dos de la souris, en commençant sur la colonne vertébrale et l&#39;extension de la zone rasée à la gauche de la ligne médiane dorsale, nettoyer une zone d&#39;au moins 2 cm x 3 cm pour accueillir la brûlure. </li><li>Préparer le site chirurgical, y compris la patte postérieure du genou en utilisant 3 alternance gommages povidone-iode. </li><li> Effectuer une incision longitudinale le long de la face médiale du tendon d&#39;Achille gauche. Elargir l&#39;incision de sorte que le tendon d&#39;Achille peut être visualisé facilement; environ 0,5 cm. </li><li> Effectuer une ténotomie d&#39;Achille avec dissection du tendon au milieu avec des ciseaux pointus de tissus. Insérer une lame de ciseaux de tissu dans le plan du tissu au-dessous du tendon et disséquer le long du plan jusqu&#39;à ce que la lame est au point médian du tendon. Fermez les lames de ciseaux pour sectionner le tendon fortement. REMARQUE: Veiller à l&#39;inclusion de tous les tendons postérieurs y compris Gastrocnemius, soléaire et tendons plantaire. </li><li> Hémostase en appliquant une pression avec de la gaze stérile (il devrait y avoir un saignement minime) et fermer l&#39;incision de la peau avec un point 5-0 de vicryl. </li><li> Effectuez la dorsale partielle brûlure d&#39;épaisseur avec un bloc d&#39;aluminium pesant 35 g avec approximatives DE MESUREts 2 cm x 2 cm x 3 cm chauffé à 60 ° C dans un bain d&#39;eau appliquée sur la face dorsale rasée de la souris pendant 17 sec. Remarque: obtenir la profondeur de gravure approprié en plaçant le bloc au-dessus de la souris anesthésiée, veiller à ce que toute la zone de surface du bloc est au contact de la souris, cependant éviter d&#39;appliquer une pression supplémentaire sur le bloc, à savoir, permettre à la gravité pour être la seule force de maintien le bloc en place. Une poignée en matière plastique mince fixée à un côté du bloc est commode pour la manipulation, la stabilisation et la récupération à partir du bain d&#39;eau chaude. Cela va créer un organisme surface totale d&#39;environ 30% à brûler dans une ancienne 8-10 semaine souris C57BL / 6. Cette brûlure de contact a été choisi sur les autres méthodes (flamme ou brûlure brûlures) en raison de l&#39;uniformité de la profondeur de la brûlure sur la plaie et la reproductibilité entre les animaux. </li><li> Sécher le site de la brûlure avec de la gaze et appliquer un pansement Tegaderm. </li><li> Administrer des fluides de réanimation réchauffés: solution 1 ml de Ringer lactateinjection intraperitoneale et injection sous-cutanée de 0,5 ml. Cette administration unique de la réanimation est adéquate pour la récupération de la blessure de brûlure et ténotomie. REMARQUE: Ne pas revenir souris anesthésiées dans des cages de logement avec d&#39;autres souris, maison individuellement dans des cages propres sous surveillance jusqu&#39;à ce que les souris sont complètement rétablis. Récupération type se produit dans 1-6 hr. les sites de gravure guérissent généralement dans les 2-4 semaines et sont rarement compliqués par infection de la plaie si elles sont conservées dans des environnements de logement propres. </li><li> Administrer buprénorphine 0,1 mg / kg injection sous-cutanée toutes les 12 heures pendant 3 jours suivants la procédure. Surveillez la croissance HO avec des scans de μCT série à des intervalles appropriés. La croissance osseuse ectopique est la première évident environ 3 semaines post-op par μCT. NOTE: La majorité du développement HO est terminée par neuf semaines post-op. Nous avons pas observé de différence de volume HO ou l&#39;emplacement avec répétée μCT scans bi-hebdomadaire pendant 15 semaines comparativement à un seul point final μCT numériser à 15 semaines.A la fin des expériences, toutes les souris euthanasie avec CO 2 inhalation selon les directives institutionnelles et vérifier mort à la dislocation cervicale après 10 min. </li></ol> 2. μCT acquisition et d&#39;analyse <ol><li> Fixez la souris anesthésiés sur la vitre du scanner dans la position couchée. Collez les membres postérieurs en toute sécurité vers le lit pour éviter de respirer un artefact de mouvement. Inclure l&#39;air, l&#39;eau, et d&#39;hydroxyapatite contenant fantôme sous la souris pour l&#39;étalonnage de l&#39;image. </li><li> Ouvrez le logiciel d&#39;analyse d&#39;os et de définir une région d&#39;intérêt (ROI) qui englobe les deux membres postérieurs de l&#39;articulation de la hanche proximale à l&#39;extrémité de la patte arrière distale. Obtenir une image en utilisant les paramètres suivants:. 80 kV, 500 pA et 1300 msec exposition, 48 um taille de voxel 14,15 </li><li> Calibrer l&#39;image pour unités Hounsfield (HU) en dessinant un retour sur investissement dans chacune des trois chambres de fantômes et de la saisie de la densité moyenne dans les champs appropriés dansle logiciel. </li><li> Utilisation de la &quot;grabber&quot; outil dans le logiciel, réorienter l&#39;image de sorte que le tibia de la patte arrière gauche est parallèle le long de l&#39;axe Z pour permettre à la vue anatomique la plus claire pour la délimitation des structures osseuses corticales orthotopiques et HO. </li><li> Commençant au niveau du genou, faites défiler distale à travers les tranches d&#39;image jusqu&#39;à HO est rencontré. Utilisation de l&#39;outil manuel de spline, faire un retour sur investissement autour de l&#39;os ectopique sur chaque 5 ème tranche continue distale à travers la patte ou jusqu&#39;à ce que HO a été dépassé. Utilisez l&#39;outil de extrapoler à étendre et à assembler les ROI ensemble dans un ROI qui contient toutes les HO. </li><li> Faire un ROI 3D et choisissez le menu d&#39;analyse. Calculer le volume osseux par le réglage des valeurs seuils inférieure et supérieure qui montrent le mieux la fenêtre osseuse. Utilisez les mêmes valeurs seuils fixés pour toutes les analyses. </li></ol>

<ol><li>Leblanc, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-9-induced+muscle+heterotopic+ossification+requires+changes+to+the+skeletal+muscle+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">BMP-9-induced muscle heterotopic ossification requires changes to the skeletal muscle microenvironment.</a> J Bone Miner Res. 26 (6), 1166-1177 (2011).</li>
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Les auteurs n’ont rien à révéler

L’ossification hétérotopique représente une déficience fonctionnelle majeure à laquelle sont confrontés les patients qui subissent des traumatismes, des brûlures et des procédures musculo-squelettiques invasives. La population la plus à risque est celle des soldats dans les conflits modernes qui ont subi d’importantes blessures dues à des explosions dues à des mécanismes tels que les engins explosifs improvisés (EEI). 18 L’amélioration du gilet pare-balles et des unités médicales positionnées à l’avant perme...

L’ossification hétérotopique (OH) est la formation d’os ectopique dans lequel les cellules ostéo-puissantes sont induites de manière aberrante à former de l’os endochondral à l’extérieur du squelette. Bien que les détails de la voie de formation des OH soient encore largement inconnus, un paradigme accepté comprend trois facteurs clés : un incident inflammatoire incitatif, une niche permissive et des cellules souches mésenchymateuses capables de former de l’os. 1-3 L’OH est une comorbidité courante qui complique plus de 60 % des brûlures graves, 65 % des blessures liées au combat et 10 % des cas de chirurgie orthopédique invasive. 4,5 Cependant, il est souvent difficile de prédire où l’OH se formera, car elle peut se produire à des endroits où des lésions sont subies localement ou à des endroits éloignés qui pourraient ne pas être blessés autrement. Cette variabilité de localisation rend difficile l’intervention prophylactique pour prévenir la formation osseuse réactive de manière ciblée localement. Il existe également des formes congénitales d’OH telles que la fibrodysplasie ossifiante progressive (FOP) dans lesquelles les patients sont sujets au développement d’une OH robuste en réponse à un traumatisme mineur ou à une agression inflammatoire. De puissants modèles animaux utilisant des souris transgéniques ont reproduit ce phénotype et ont fourni des informations sur les voies moléculaires qui peuvent également être importantes dans l’OH induite par un traumatisme.6-9 La recherche translationnelle sur la pathogenèse de l’OH non congénitale a utilisé une grande variété de constructions allant de la blessure seule à l’implantation de matériaux et/ou de cellules ostéo-inductifs exogènes. 10 à 13
Dans nos travaux précédents, nous avons validé un modèle simple et fiable de formation de HO chez la souris qui ne nécessite pas l’administration de matériel exogène. 14-17 Ce modèle a créé deux conditions clés pour initier l’OH : un traumatisme local et une inflammation globale. Cela a été réalisé grâce à l’utilisation d’une ténotomie d’Achille (traumatisme local) combinée à une brûlure à distance (inflammation globale). Les souris ont reçu les deux traitements en même temps et ont développé une quantité robuste de HO qui pouvait être analysée par des moyens histologiques, radiologiques et moléculaires. Il est intéressant de noter que les brûlures concomitantes ont considérablement augmenté la quantité d’OH qui s’est formée et ont accéléré son développement. L’OH 14-16 s’est développée à des endroits prévisibles autour du calcanéum, de l’articulation de la cheville et du tibia/péroné du membre qui a subi la ténotomie. La fiabilité du développement de l’OH à un endroit connu a permis un examen ciblé des caractéristiques moléculaires et histologiques aux premiers stades de l’ossification ectopique. 14,17 À ce jour, 100 % des souris (plus de 50 animaux) ayant subi une ténotomie et des brûlures concomitantes ont développé une OH. De plus, des images longitudinales 2D et 3D et des analyses spectroscopiques ont été effectuées pour examiner le profil de croissance et la composition biochimique de l’OH15,16.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 souris</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>8-10 semaines</td></tr><tr><td>Isoflurane &ndash ; Fluriso</td><td>VET one, Boise, ID</td><td>V1 501017</td><td></td></tr><tr><td>Buprénorphine &ndash ; Buprenex</td><td>Reckitt Benckiser Healthcare</td><td>NDC 12496-0757-1</td><td>0,3 mg/ml solution</td></tr><tr><td>Betadine</td><td>Owens and Minor, Mechanicsville, VA</td><td>2047PVP202</td><td></td></tr><tr><td>5-0 Vicryl sutures</td><td>Ethicon, Summerville, NJ</td><td>J493</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm Film, 6 cm x 7 cm</td><td>3M</td><td>1624W</td><td>Couper en deux pour couvrir correctement le site de brûlure</td></tr> <tr><td>et micro ; CT - GE eXplore Locus SP</td><td>GE Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microview 2.2 Advanced Bone Analysis Application</td> GE <td>Healthcare Pre-Clinical Imaging, London, ON, Canada</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

souris direct trauma / graver modèle d&#39;ossification hétérotopique

Direct Mouse Trauma/Burn Model of Heterotopic Ossification

L’ossification hétérotopique (OH) est la formation d’os à l’extérieur du squelette qui se forme à la suite d’un traumatisme majeur, de brûlures et d’interventions chirurgicales orthopédiques. La majorité des modèles animaux utilisés pour étudier l’OH reposent sur l’application de substances exogènes, telles que les protéines morphogénétiques osseuses (BMP), les constructions cellulaires exogènes ou les mutations génétiques dans la signalisation BMP. Bien que ces modèles soient utiles, ils ne reproduisent pas avec précision les états inflammatoires à l’origine de la majorité des cas d’OH. Nous décrivons ici un modèle de brûlure/ténotomie chez la souris qui produit de manière fiable une OH focalisée. Ce protocole consiste à créer une brûlure de contact de 30 % de la surface corporelle totale, une brûlure de contact d’épaisseur partielle sur la peau dorsale ainsi qu’une division du tendon d’Achille à son point médian. Le fait de s’appuyer uniquement sur une lésion traumatique pour induire une OH à un endroit prévisible permet d’étudier dans le temps la formation osseuse hétérotopique endochondrale à partir des processus physiologiques intrinsèques et de l’environnement uniquement. Cette méthode pourrait s’avérer déterminante dans la compréhension des voies inflammatoires et ostéogéniques impliquées dans l’OH induite par un traumatisme. De plus, comme l’OH se développe dans un lieu et une évolution temporelle prévisibles dans ce modèle, il permet la recherche pour améliorer les stratégies d’imagerie précoce et les modalités de traitement afin de prévenir la formation d’OH.

Dans la présente étude, le protocole est décrit par le modèle de souris précédemment publié des traumatismes / brûler induite HO. 14-17 Cela implique la création d&#39;une blessure musculo-squelettique localisée concurrente avec une ténotomie Achille et agression inflammatoire mondial avec une épaisseur partielle brûlures. Il en résulte la formation fiable de l&#39;os au niveau du site réactif de ténotomie qui peut être suivie à l&#39;imagerie en série. À ce jour, toutes les souris (plus de 50) qui ont souten...

Un modèle de ténotomie d’Achille et de brûlure de l’ossification hétérotopique permet l’étude fiable de la formation osseuse ectopique induite par un traumatisme sans l’application de facteurs exogènes.

Souris Direct Trauma / Graver Modèle d&#39;ossification hétérotopique

Heterotopic ossification (HO) is the formation of bone outside of the skeleton which forms following major trauma, burn injuries, and orthopaedic surgical ...

L'objectif général de cette procédure est d'induire une formation osseuse ectopique suite à une lésion traumatique, sans l'application de matériaux exogènes. Cela est réalisé en premier lieu en provoquant une lésion ostéo-articulaire ciblée. Dans ce cas, une ténotomie d'Achille.Dans la deuxième étape, on induit une condition inflammatoire généralisée. On démontre ici une brûlure par contact de degré partiel sur une surface de 30 %. L'ossification hétérotopique, ou OH, est ensuite laissée se développer dans la région de la ténotomie au cours des cinq à neuf semaines suivantes.En fin de compte, la quantité et la localisation de l'os ectopique peuvent être évaluées par imagerie microtomographique. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes est qu'elle présente un corrélat clinique dans ce modèle. Les souris forment un précurseur cartilagineux, suivi d'un os hétérotopique, sans cytokines supplémentaires ni mutations supplémentaires chez les souris.Ainsi, nous pensons que cela permettra de mieux tester les thérapeutiques et d'autres modalités d'imagerie, car cette méthode reproduit fidèlement le type d'os que l'on observe chez les patients atteints d'ossification hétérotopique. Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie et au diagnostic de l'OH, car elle permet d'étudier des traitements potentiels du développement osseux ectopique avant qu'il ne s'ossifie. Nous avons eu l'idée de cette méthode en observant des cas d'OH chez des patients souffrant de brûlures graves, qui développaient des lésions à divers emplacements éloignés du site de la brûlure, ainsi que chez d'autres patients, au niveau de traumatismes musculosquelettiques.Après l'administration de l'anesthésie, confirmez l'absence de réponse au pincement et administrez un analgésique. Appliquez une pommade sur les yeux d'une souris adulte C57BL/6 âgée de huit à dix semaines. Ensuite, placez l'animal sur un tapis chauffant et utilisez un tondeur pour raser soigneusement la patte postérieure, du talon jusqu'au genou.Ensuite, en partant de la colonne vertébrale et en s'étendant vers la gauche de la ligne médiane dorsale, dégager une zone d'au moins deux sur trois centimètres afin de pouvoir réaliser la brûlure. Une fois tout le poil retiré, procéder à trois nettoyages alternés avec de la solution de povidone iodée pour désinfecter la zone chirurgicale ainsi que la patte postérieure, puis porter les équipements de protection individuelle appropriés, notamment un masque facial, une coiffe pour les cheveux, une blouse stérile et des gants.Ensuite, à l’aide d’instruments stériles, pratiquer une incision longitudinale de 0,5 centimètre le long de l’aspect médial du tendon d’Achille gauche. Lorsque le tendon est visible, insérer une lame d’une paire de ciseaux tranchants dans le plan tissulaire situé sous le tendon, puis disséquer selon ce plan jusqu’à ce que la lame atteigne le milieu du tendon. Fermer ensuite brusquement les lames des ciseaux pour sectionner le tendon, puis appliquer une pression avec un pansement stérile afin d’obtenir l’hémostase.Après avoir refermé l'incision cutanée à l’aide d’un point de Vicryl 5-0, faites chauffer un bloc d’aluminium de 35 grammes mesurant deux sur deux sur trois centimètres à 60 degrés Celsius dans un bain-marie. Une fois le bloc chauffé, posez-le sur le dos de la souris pendant 17 secondes, en veillant à ce que toute la surface soit en contact avec l’animal. Séchez ensuite la brûlure partielle du dos à l’aide d’un pansement en gaze et appliquez un pansement Tegaderm. Ressuscitez l’animal par l’administration de solution de Ringer lactatée tiédie par injection intrapéritonéale et sous-cutanée.Ensuite, placer la souris dans une cage individuelle pour surveillance jusqu'à ce qu'elle soit complètement rétablie. Pour surveiller l'ossification hétérotopique des lésions par analyse micro-CT aux moments appropriés après une brûlure dorsale de profondeur partielle, fixer la souris anesthésiée sur le plateau du scanner en position ventrale. Fixer solidement la patte postérieure au plateau afin d'éviter les artefacts dus au mouvement respiratoire, et inclure sous la souris un fantôme contenant de l'air, de l'eau et de l'hydroxyapatite pour l'étalonnage de l'image.Ensuite, ouvrez le logiciel d'analyse osseuse et définissez une région d'intérêt englobant les deux membres postérieurs, de l'articulation de la hanche proximalement jusqu'à l'extrémité de la patte postérieure distalement. Obtenez une image en utilisant les paramètres indiqués. Puis, tracez une région d'intérêt dans chacune des trois chambres du fantôme et saisissez la densité moyenne dans les champs appropriés du logiciel afin d'étalonner l'image en unités de champ de hounds.Pour obtenir la vue anatomique la plus claire, utilisez l'outil de sélection dans le logiciel afin de réorienter l'image de manière à ce que le tibia du membre hind gauche soit parallèle à l'axe Z. Ensuite, à partir du genou, faites défiler progressivement vers le bas (distalement) à travers les coupes d'image. Lorsque l'os hétérotopique (HO) est détecté, utilisez l'outil de spline manuel pour créer une région d'intérêt autour de l'os ectopique sur une coupe sur trois à cinq, en continuant distalement jusqu'au niveau de la patte ou jusqu'à ce que l'os hétérotopique soit entièrement dépassé.Ensuite, utilisez l'outil d'extrapolation pour prolonger et assembler les régions d'intérêt en une seule région d'intérêt contenant tout l'HO. Enfin, créez une région d'intérêt en 3D et ouvrez le menu d'analyse, en réglant les valeurs de seuil inférieure et supérieure qui montrent au mieux la fenêtre osseuse afin de calculer, à ce jour, le volume osseux. Toutes les souris ayant subi à la fois une ténotomie du tendon d'Achille et une brûlure, comme vient d'être démontré, ont développé une quantité mesurable d'HO au site de ténotomie, permettant de quantifier la formation d'os ectopique.Le protocole de micro-TDM avec image étalonnée est utilisé à chaque point temporel souhaité. L’ajout d’une lésion par brûlure en combinaison avec une ténotomie d’Achille s’est révélé essentiel pour induire une quantité importante d’os hétérotopique ; en effet, lorsque les deux lésions sont présentes simultanément, on observe une augmentation significative de la quantité d’os hétérotopique formé au site de la ténotomie par rapport à la ténotomie d’Achille seule. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 10 minutes ou moins par animal, si elle est effectuée correctement.Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que tous les tendons postérieurs doivent être sectionnés complètement. Après cette procédure, nous pouvons utiliser des modalités d'imagerie telles que la spectroscopie RO, la bioluminescence ou le scanner CT pour évaluer la quantité d'os formé et l'effet de certains médicaments. Nous pourrions ensuite utiliser l'histologie, l'immunohistochimie, l'immunofluorescence pour examiner les mécanismes de signalisation réels responsables du développement de l'ossification hétérotopique et comprendre comment nos médicaments agissent.

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Ce protocole expliquera comment établir un modèle murin de cicatrisation hypertrophique qui augmente la signalisation de mécanotransduction pour simuler une cicatrisation de type humain. Cette méthode consiste à augmenter la tension mécanique le long d’une incision de cicatrisation chez une souris et à utiliser un appareil spécialisé pour créer un tissu cicatriciel excessif reproductible pour des analyses histologiques et bioinformatiques détaillées.

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Transplantation hétérotopique du membre postérieur au cou chez la souris : un modèle supermicrochirurgical d’allotransplantation composite vascularisée

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Une méthode modifiée de Heterotopic souris coeur la transplantation

Apprenez à induire l'ossification hétérotopique chez la souris par ténotomie d'Achille et brûlure partielle sans facteurs exogènes. Cette méthode permet d'étudier la formation osseuse ectopique post-traumatique.

Souris Direct Trauma / Graver Modèle d'ossification hétérotopique

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