Création d'une importance clinique

L'objectif général de cette procédure est de créer un modèle cliniquement pertinent dans lequel la réparation de la plaie peut être suivie dans son microenvironnement naturel. Cela est réalisé en premier lieu en retirant le cristallin de l'œil d'un embryon de poulet. La deuxième étape consiste à pratiquer une petite incision dans l'antérieur du cristallin.

Ensuite, éluerez par voie hydrique la masse des cellules fibreuses du cristallin. Puis, aplatirez la capsule du cristallin avec l'épithélium associé en effectuant des incisions supplémentaires dans la capsule antérieure. La dernière étape consiste à fixer la culture lésée sur la boîte de culture tissulaire afin de suivre la cicatrisation de la plaie au fur et à mesure de son déroulement.

En fin de compte, la microscopie enregistrement temporel, la microscopie confocale et l'analyse biochimique sont utilisées pour montrer les mécanismes de réparation des plaies dans un modèle qui reproduit fidèlement l'environnement in vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la cicatrisation, comme la manière dont les cellules se déplacent de façon coordonnée pour refermer la plaie. Bien que cette méthode puisse fournir des aperçus sur le processus de réparation des plaies.

Il peut également être appliqué à l'étude de la cicatrisation des plaies ABER, en particulier la fibrose et la formation de cicatrices. Commencez par placer trois boîtes de Pétri de 100 millimètres dans une hotte à flux laminaire stérile. Remplissez deux des boîtes de Pétri à moitié avec du tampon tris glucose à température ambiante, en laissant la troisième vide.

Ensuite, retirez un œuf de poussin Leghorn blanc fécondé de 15 jours d’incubation de l’étuveur réglé à 37,7 degrés Celsius et nettoyez l’extérieur de la coquille avec de l’éthanol à 70 % afin de la stériliser. Ensuite, cassez délicatement l’œuf et versez son contenu dans la boîte de Pétri vide de 100 millimètres. À l’aide de pinces standard et de ciseaux fins, décapitez l’embryon et placez la tête dans l’un des compartiments contenant le tampon TST au dextrose.

En moins de 15 minutes, déplacer la tête de l'embryon de poulet sur le couvercle d'une boîte de Pétri. Utiliser des pinces de haute précision pour pincer l'arrière de l'œil, créant ainsi une petite ouverture à l'arrière de l'œil. Ensuite, saisir l'humeur vitrée avec les pinces et tirer doucement sur celle-ci en effectuant un mouvement de roulis.

Le vitré avec le cristallin attaché va se détacher de l'œil. Placer le cristallin et le vitré dans la boîte de Pétri restante contenant le tampon Tex extras. Laisser les cristallins dans le tampon pendant un maximum de 30 minutes avant de poursuivre la dissection.

Ensuite, déplacer le cristallin vers un nouveau couvercle de boîte de Pétri sous un microscope stéréoscopique à l'aide de pinces de précision, puis brosser soigneusement les cellules du corps ciliaire qui ont été détachées avec le cristallin en utilisant le bord de la pince. Puis séparer le cristallin du corps vitré en pincant le corps vitré pour le détacher de son association avec la capsule postérieure du cristallin. Une fois séparé, transférer le cristallin dans une goutte de 200 microlitres de tampon tris-dextrose dans une boîte de culture tissulaire de 35 millimètres, et l'orienter de manière à ce que la face antérieure du cristallin soit dirigée vers le haut.

L'antérieur du cristallin est facilement identifiable par la présence d'un anneau dense dans le tissu, qui marque la frontière entre la région intérieure et la région équatoriale de l'épithélium du cristallin. À l'aide de deux pinces de haute précision, pratiquer une petite incision d'environ 850 microns de longueur au centre de la capsule antérieure du cristallin en saisissant le tissu avec une pince dans chaque main et en tirant doucement dans des directions opposées. Ensuite, prendre une seringue d'un millilitre munie d'une aiguille de calibre 27,5 et la remplir avec 300 microlitres de tampon TST au dextrose.

Insérez la pointe de l'aiguille dans l'incision pratiquée dans la capsule antérieure du cristallin et à environ mi-chemin dans le cristallin. Appuyez ensuite doucement sur la seringue pour injecter le tampon de dextrose TST dans le cristallin. Masse des cellules fibreuses.

Injectez entre 50 et 200 microlitres de tampon pour détacher la masse cellulaire des fibres de l'épithélium environnant et de la capsule du cristallin. N'injectez jamais plus de 300 microlitres. À l'aide de pinces de haute précision, retirez la masse cellulaire des fibres détachée du cristallin par le site d'incision antérieur.

Le retrait de la masse des cellules fibreuses de son insertion sur la capsule postérieure crée une zone de lésion hautement reproductible sur la membrane basale, entourée par l'épithélium lésé. À partir de la capsule capsulaire, effectuez cinq incisions dans la partie antérieure du cristallin jusqu'à l'équateur. Aplatir les cinq volets résultants de la capsule du cristallin, avec l'épithélium attaché, dans la boîte de culture, la face capsule vers le bas et la face cellulaire vers le haut.

Appuyez doucement avec la pince en chaque point de l'étoile pour fixer la capsule à la boîte. Cela créera une petite indentation au niveau des cinq extrémités les plus externes de l'x explan et assurera une adhérence durable à la boîte. Ensuite, retirez le tampon tris dextrose de la boîte de 35 millimètres et remplacez-le par 1,5 millilitre de M1 99 préchauffé.

Milieu supplémenté avec 1 % de L-glutamine et de pénicilline. Recouvrez le plat avec son couvercle et placez-le dans l'incubateur. Placez la boîte de culture sous le microscope stéréoscopique et observez la démarcation entre la zone centrale de migration et la zone d'attachement d'origine des cellules épithéliales.

Ensuite, utilisez deux pincettes de haute précision pour saisir le bord des deux côtés de la ligne de démarcation entre les deux zones. Tirez délicatement la zone d'attachement d'origine le long de la ligne afin de séparer facilement les deux zones. Poursuivez la séparation des deux zones tout autour de la culture jusqu'à ce que les deux régions soient complètement dissociées.

Étudiez les deux fractions à l'aide de techniques analytiques biochimiques ou moléculaires classiques. Immédiatement après le retrait de la masse des cellules fibreuses, une sous-population de cellules mésenchymateuses de réparation se trouve activée et migre vers le bord de la plaie épithéliale. Ces cellules migrent rapidement vers la région dépourvue de cellules de la capsule de la membrane basale endogène, la zone centrale de migration, pour amorcer le processus de cicatrisation.

La plaie étant formée, la technique décrite ici prépare idéalement ce système modèle à l'observation de ce processus au microscope ou à la caméra vidéo. La cicatrisation progresse rapidement, recouvrant une zone importante de la plaie dès le premier jour en culture. Au troisième jour, le processus de cicatrisation est généralement terminé, suite à la séparation entre la zone centrale de migration et la zone d'attachement d'origine. Les différences moléculaires entre ces zones distinctes ont été analysées ici.

Les niveaux de la kinase du point d'ancrage ont été mesurés dans les deux zones, et la quantité de kinase du point d'ancrage phosphorylée s'est révélée augmentée dans la zone centrale spécifique à la migration. Une fois maîtrisée, cette technique de simulation de chirurgie de la cataracte peut être réalisée en trois minutes si elle est effectuée correctement. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment créer un modèle de simulation de chirurgie de la cataracte qui imite de près la réparation des plaies dans un microenvironnement naturel.