Name: Clonage et Production à grande échelle de haute capacité vecteurs adénoviraux Basé sur le type adénovirus humain 5 (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Découvrez la production de vecteurs adénoviraux à haute capacité dépourvus de gènes viraux pour la thérapie génique. Cette méthode permet de cloner et d'amplifier des transgènes jusqu'à 35 kb dans des cellules productrices.

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Ce travail a été soutenu par la subvention DFG EH 192/5-1 (A.E.), le projet européen (E-rare-2) Transposmart (A.E.), l’UWH Forschungsförderung (E.S. et W.Z), et le programme de doctorat de l’Université Witten/Herdecke (P.B.). J.L. a été soutenu par une allocation du Conseil chinois des bourses d’études et T.B. et M.G par la fondation Else Kröner-Fresenius (EKFS).

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Le protocole présenté ici permet la purification de vecteurs de HCAdV basés sur l&#39;adénovirus humain de type 5 sur la base de procédures précédemment décrites 4,12. Le génome du plasmide à l&#39;intérieur HCAdV pAdFTC est dépourvu de tous les gènes adénoviraux et ne porte les 5 &#39;et 3&#39; ITR et le signal d&#39;encapsidation. Dans cette stratégie, le HV AdNG163R-2 4 fournit tous les gènes nécessaires à la production de virus efficace en trans. Cette offre une capacité de conditionne...

Pour les applications de thérapie génique, il est d&#39;une grande importance pour éviter des effets secondaires cytotoxiques et immunogènes causées par expression de protéines virales, le transgène lui-même ou par des protéines virales entrants. Les vecteurs adénoviraux (AdV) sont largement utilisés pour introduire un ADN étranger dans une grande variété de cellules pour étudier l&#39;impact de l&#39;expression du transgène 1,2. La version la plus avancée de AdV est représentée par des vecteurs adénoviraux à grande capacité (HCAdV) dépourvues de toutes les séquences virales codantes 3,4 et offrant ainsi une capacité de conditionnement jusqu&#39;à 35 kb combinées à une faible immunogénicité et une faible toxicité 8.5. En raison de leur capacité de conditionnement de haute ils permettent la livraison de grandes ou plusieurs transgènes en utilisant une dose de vecteur unique. Par conséquent, ils représentent un outil précieux pour la communauté de recherche. Contrairement au premier ou au deuxième génération AdV dépourvu des gènes précoces E1 et / ou E3 qui peuvent être facilement produites en utilisant des kits commerciaux, vector construction du génome du virus et la production de HCAdV est plus complexe. Le système pour la construction de génomes HCAdV est basé sur la pAdFTC plasmidique portant un génome de HCAdV dépourvu de toutes les séquences codantes virales et le plasmide navette PHM5 12/09. Tout gène d&#39;intérêt allant jusqu&#39;à 14 kilo bases (kb) peut être cloné dans le PHM5 vecteur navette dans lequel le site de clonage multiple est flanquée par la reconnaissance / sites de clivage des endonucléases homing PI Sce I et I-Ceu I. Par conséquent, un gène clone intéressant peut être libéré par consécutive PI- Sce I et I-Ceu I digère pour l&#39;insertion ultérieure réalisé dans les mêmes sites de restriction présents dans le génome de HCAdV contenu dans le plasmide pAdFTC. Dans pAdFTC le site d&#39;insertion du transgène situé entre la PI-Sce I et I-Ceu I est flanquée de sites de clivage par stuffer ADN et les séquences non codantes adénovirales nécessaires pour l&#39;emballage du génome de telles répétitions terminales en 5 &#39;et 3&#39; inversées (ITR)aux deux extrémités et le signal de conditionnement en aval de la 5&#39;ITR. L&#39;ADN stuffer supplémentaire fournit une taille optimale du génome de HCAdV finale allant de 27 à 36 kb pour assurer l&#39;emballage pendant la production efficace de virus. Depuis pAdFTC est un grand plasmide avec un maximum de 45 kb (en fonction de la taille du transgène inséré) et l&#39;utilisation d&#39;endonucléases de homing avec des sites de reconnaissance d&#39;ADN longues comparable présente une forte liaison à l&#39;ADN, plusieurs étapes de nettoyage sont nécessaires au cours du transfert du transgène à partir de PHM5 à pAdFTC. Une manipulation soigneuse évitant des forces de cisaillement est recommandé. Les ITR du génome de HCAdV sont flanquées par Not I sites de reconnaissance d&#39;enzymes de restriction situés directement en amont de la 5&#39;ITR et en aval de la 3&#39;ITR 12. Par conséquent, HCAdV peut être libérée par digestion par Not I pour la transfection ultérieure du génome viral dans la lignée cellulaire productrice de HCAdV. On notera que l&#39;utilisation de l&#39;enzyme de restriction Not I pour relfacilité du génome viral à partir du plasmide pAdFTC implique que le transgène inséré est dépourvue de sites de reconnaissance Not I ADN. Les cellules productrices à base de cellules HEK293 (116 cellules) expriment de façon stable la recombinase Cre. Pour l&#39;amplification du virus 116 cellules sont co-infectées par un virus auxiliaire (HV) fournissant tous les gènes nécessaires à la réplication AdV et de l&#39;emballage en trans 3,4. Le HT est un AdV de première génération avec un signal d&#39;emballage floxé qui est éliminé au cours de l&#39;amplification par virus recombinase Cre exprimée dans des cellules 116 4. Cela garantit que les génomes principalement HCAdV contenant un signal d&#39;emballage intact sont encapsidés. Pré-amplification de la HCAdV est réalisée en effectuant des étapes de 116 passages en série dans des cellules cultivées sur des surfaces dans des boîtes de culture tissulaire. Après chaque passage des particules virales sont libérées à partir de cellules infectées en effectuant trois étapes de congélation-décongélation successifs. Avec chaque passage du nombre de cellules de plus en plus sont infectées par le3.1 du lysat cellulaire à partir du passage précédent. Enfin lysat provenant de la dernière étape de pré-amplification est utilisé pour infecter des cellules productrices cultivées en suspension dans une fiole centrifuge de grande amplification de l&#39;échelle. Les virions sont purifiés à partir des cellules en suspension en procédant à une ultracentrifugation à une densité de chlorure de césium 4,12 gradient. Avec cette procédure, les particules et les particules vides entièrement assemblés sont séparés en deux bandes distinctes. Pour concentrer davantage le HCAdV particules d&#39;une deuxième étape d&#39;ultracentrifugation non progressive est effectuée. Par la suite la bande résultant contenant le HCAdV est recueillie et dialysée contre un tampon physiologique. Préparations de vecteurs finales sont caractérisées par rapport au nombre de particules virales infectieuses absolus, les particules et les niveaux de contamination HV. Particules virales absolue peut être déterminée par la lyse des particules virales et la mesure de l&#39;absorbance à 260 nm ou en effectuant quantitative PCR en temps réel (qPCR) 12. Infectivité du purified particules virales peuvent être déterminées par qPCR HCAdV génomes de mesure présentes dans les cellules infectées par 3 h après l&#39;infection.

<table><tbody><tr><td>I-CeuI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0699S</td> restriction <td>digest</td></tr><tr><td>PI-SceI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0696S</td><td>restriction digest</td></tr><tr><td>T4 Ligase</td><td>New engand Biolabs</td><td>M0202S</td><td>ligation</td></tr><tr><td>SwaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0604S</td> restriction <td>digest</td></tr><tr><td>NotI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0189S</td> restriction <td>digest</td></tr><tr><td>Phosphatase alcaline intestinale de veau (CIP)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td>déphosphorylation des plasmides digérés</td></tr><tr><td>Hygromycine B</td><td>PAN Biotech</td><td>P02-015</td><td>sélection de l’ERC exprimant 116 cellules</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03590&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Milieu de culture cellulaire Hek293T</td></tr><tr><td>Milieu Essentiel Minimal (MEM) Eagle</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-08500</td><td>116 milieu de culture cellulaire&nbsp ; &nbsp ;</td></tr><tr><td>Dulbecco' s tampon phosphate salin (DPBS)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td>lavage des cellules, remise en suspension des cellules</td></tr><tr><td>Flacon de stockage de 250 ml</td><td>Sigma</td><td>CLS430281-24EA</td><td>infection de 116 cellules cultivées en suspension</td></tr><tr><td>500 ml PP CentrifugeTubes</td><td>Sigma</td><td>CLS431123-36EA</td><td>sédimentation des cellules de la culture</td></tr><tr><td>en suspension Fiole tournante</td><td>Bellco</td><td>1965-61030</td><td>croissance de 116 cellules en suspension</td></tr><tr><td>Tubes ultracentrifuges ultra-clairs</td><td>Beckmann Coulter</td><td>344059</td><td>centrifugation à gradient de densité</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge Beckmann</td><td>Coulter</td><td></td><td>Centrifugation à gradient de densité</td></tr><tr><td>SW-41 rotor Beckmann</td><td>Coulter</td><td></td><td>Centrifugation à gradient de densité</td></tr><tr><td>Spectrum Laboratories Spectrum Membrane</td><td>VWR</td><td>132129</td><td>tube de dialyse</td></tr><tr><td>Cassettes de dialyse prêtes à l’emploi&nbsp ;</td><td>Thermo</td><td>66383</td><td>dialyse</td></tr><tr><td>one shot DH10B électrocompétente E. coli</td><td>invitrogen</td><td>C4040-52</td><td>transformation des réactions de ligature</td></tr><tr><td>PureYield Plasmid Midiprep System</td><td>Promega</td><td>A2495</td><td>midiprep</td></tr><tr><td>peqGOLD Tissue DNA Mini Kit&nbsp ;</td><td>Peqlab</td><td>12-3396-02</td><td>isolement de l’ADN génomique</td></tr><tr><td>Réactif de transfection SuperFect</td><td>Qiagen</td><td>301305</td><td>transfection de 116 cellules</td></tr><tr><td>opti MEM (10 % FBS)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td>transfection de 116 cellules</td></tr><tr><td>iQ SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>&nbsp ; 170-8882</td><td>q-PCR</td></tr><tr><td>CFX 96 C1000 tactile&nbsp ;</td>Machine <td>Biorad</td><td></td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Phénol/Chloroforme/Alcool isoamylique&nbsp ;</td><td>Carl Roth</td><td>A156.1</td><td>purification de l’ADN</td></tr><tr><td>Chlorure de césium</td><td>Carl Roth</td><td>8627.1</td><td>gradient de densité centrifugation acétate</td></tr><tr><td>de sodium 99 %</td><td>Carl Roth</td><td>6773.2</td><td>précipitation de l’ADN</td></tr><tr><td>LB moyen&nbsp ;</td><td>Carl Roth</td><td>X968.3</td><td>milieu de croissance bactérienne</td></tr><tr><td>éthanol&nbsp ; 99.8 % pur</td><td>Carl Roth</td><td>9065.5&nbsp ;</td><td>Précipitation et lavage de l’ADN</td></tr><tr><td>FS 99.5 %</td><td>Carl Roth</td><td>2326.2</td><td>tampon de lyse</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth</td><td>8043.2</td><td>tampon de lyse&nbsp ;</td></tr><tr><td>Tris-HCl 99 %</td><td>Carl Roth</td><td>9090.3</td><td>tampon de dialyse/lyse&nbsp ; tampon</td></tr><tr><td>glycérol 99.5 %</td><td>Carl Roth</td><td>3783.1</td><td>tampon de dialyse</td></tr><tr><td>MgCl2 98.5 %</td><td>Carl Roth</td><td>KK36.2</td><td>tampon de dialyse</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Carl Roth</td><td>3957.1</td><td>tampon de dialyse en option</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Carl Roth</td><td>3904.2</td><td>tampon de dialyse en option</td></tr><tr><td>saccharose</td><td>Carl Roth</td><td>9286.1</td><td>tampon de dialyse en option</td></tr><tr><td>Na2HPO4x2H2O</td><td>Carl Roth</td><td>4984.2</td><td>Tampon de dialyse en option</td></tr><tr><td>Tubes de 1,5 ml</td><td>Sarstedt</td><td>72,730,005</td><td>Stockage des préparations virales à -80 &deg ; L</td></tr></tbody></table>

clonage et production à grande échelle de haute capacité vecteurs adénoviraux basé sur le type adénovirus humain 5

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

Les vecteurs adénoviraux de grande capacité (HCAdV) dépourvus de toute séquence codante virale représentent l’un des vecteurs de délivrance de gènes les plus avancés en raison de leur grande capacité de conditionnement (jusqu’à 35 kb), de leur faible immunogénicité et de leur faible toxicité. Cependant, pour de nombreux laboratoires, l’utilisation de HCAdV est entravée par la procédure compliquée de construction du génome vectoriel et de production de virus. Ici, un protocole détaillé pour un clonage et une production efficaces de HCAdV basé sur le plasmide pAdFTC contenant le génome HCAdV est décrit. La construction des génomes de HCAdV est basée sur un système de vecteurs de clonage utilisant des endonucléases à tête chercheuse (I-CeuI et PI-SceI). Tout gène d’intérêt d’une taille maximale de 14 kb peut être sous-cloné dans le vecteur navette pHM5, qui contient un site de clonage multiple flanqué de I-CeuI et PI-SceI. Après la libération du transgène par I-CeuI et PI-SceI, le transgène peut être inséré dans le vecteur de clonage HCAdV pAdFTC. En raison de la grande taille du plasmide pAdFTC et des longs sites de reconnaissance des enzymes utilisées associés à une forte liaison à l’ADN, une manipulation soigneuse des fragments de clonage est nécessaire. Pour la production de virus, le génome de HCAdV est libéré par la digestion NotI et transfecté dans une lignée cellulaire productrice basée sur HEK293 exprimant de manière stable la Cre recombinase. Pour fournir tous les gènes adénoviraux pour l’amplification de l’adénovirus, une co-infection avec un virus auxiliaire contenant un signal d’emballage flanqué de sites loxP est nécessaire. La préamplification du vecteur est effectuée dans des cellules productrices cultivées sur des surfaces et l’amplification à grande échelle du vecteur est effectuée dans des fioles tournantes avec des cellules productrices cultivées en suspension. Pour la purification du virus, deux étapes d’ultracentrifugation basées sur des gradients de chlorure de césium sont effectuées, suivies d’une dialyse. Ici, des conseils, des astuces et des raccourcis développés au cours des dernières années en travaillant avec ce système vectoriel HCAdV sont présentés.

Voici des exemples représentatifs pour le clonage, l&#39;amplification et la purification des préparations de HCAdV sont présentés. Un aperçu de la stratégie de clonage (Figure 1) et des exemples représentatifs pour le clonage et la libération du génome de HCAdV par digestion de restriction enzyme sont fournis (Figure 2). Un motif de restriction typique après la libération de la cassette GOI-expression de PHM5 par PI Sce I et I-Ceu je d...

Un protocole de génération de vecteurs adénoviraux de grande capacité dépourvus de toutes séquences codantes virales est présenté. Le clonage des transgènes contenus dans le génome du vecteur est basé sur des endonucléases à tête chercheuse. L’amplification virale dans les cellules productrices cultivées en tant que cellules adhérentes et en suspension repose sur un virus auxiliaire fournissant des gènes viraux chez trans.

Clonage et Production à grande échelle de haute capacité vecteurs adénoviraux Basé sur le type adénovirus humain 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

L'objectif général de cette procédure est de produire un vecteur adénoviral à haute capacité dépourvu de gène, destiné à la livraison et à l'expression de transgènes thérapeutiques dans des cellules ou des organismes vivants. Cette méthode peut aider le domaine de la thérapie génique à délivrer de grands transgènes qui ne peuvent pas être insérés dans d'autres vecteurs viraux. Le principal avantage de cette technique est que les adénovirus à haute capacité sont dépourvus de gènes viraux.À l’aide de ces vecteurs, jusqu’à 35 kb d’ADN étranger peuvent être transférés. L’application de cette technique s’étend à notre thérapie des maladies héréditaires, car elle permet de délivrer des vecteurs thérapeutiques destinés à la correction ou à l’ajout de gènes. Cette méthode constitue un outil avancé pour la délivrance biologique de transgènes thérapeutiques et peut être utilisée aussi bien en culture cellulaire que chez des organismes vivants.La démonstration visuelle de cette méthode est cruciale, car l'amplification du vecteur et la purification du vecteur nécessitent une certaine expérience. Il faut avoir la main juste lors de la purification du vecteur. Analyser un aliquot d'un plasmide

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Source: Ehrke-Schulz, E., et al. Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5. J. Vis. Exp. (2016)This video demonstrates the large-scale amplification of high-capacity adenoviral vectors in suspension-adapted human embryonic kidney cells expressing Cre recombinase for use in gene delivery applications requiring high-titer, helper-free vector preparations.

Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors 

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Utilisant la stratégie capside-Incorporation Antigen pour le développement d&#39;approches adénovirus sérotype 5 Vectored vaccins

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Production, Purification et contrôle de la qualité pour les vecteurs de base de Virus Adeno-associé

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Production de vecteurs de virus adéno-associés dans des piles cellulaires pour des études précliniques dans de grands modèles animaux

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Découvrez la production de vecteurs adénoviraux à haute capacité dépourvus de gènes viraux pour la thérapie génique. Cette méthode permet de cloner et d'amplifier des transgènes jusqu'à 35 kb dans des cellules productrices.

Clonage et Production à grande échelle de haute capacité vecteurs adénoviraux Basé sur le type adénovirus humain 5

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