Génération des solutions évolutives de métal de très haute-Aspect Ratio nanocomposites dans un milieu liquide biologique

L'objectif général de cette procédure est de produire des composites linéaires de grande dimension, à l'échelle microscopique et nanométrique, en utilisant des matériaux de départ contenant du cuivre et de la cystéine. Cette étape est réalisée en mélangeant d'abord des nanoparticules de cuivre soumises à l'ultrasonication ou du sulfate de cuivre avec de la cystine et de l'eau dans un flacon de culture stérile ventilé. La deuxième étape de la synthèse consiste à placer le mélange contenu dans le flacon dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 °C pendant au moins six heures.

Ensuite, le flacon est examiné visuellement et par microscopie en lumière blanche. Afin de déterminer l'ampleur de la formation des structures linéaires, la dernière étape consiste à interrompre la synthèse en plaçant le flacon de synthèse dans un réfrigérateur maintenu à quatre degrés Celsius. Enfin, une microscopie numérique est utilisée pour caractériser les structures synthétisées. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme la position par électrode, est que la synthèse décrite peut facilement être réalisée à plus grande échelle sous forme liquide et que le processus se déroule dans des conditions physiologiques.

Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie ou au diagnostic de maladies telles que le cancer, car les structures synthétisées peuvent être dégradées par les cellules, offrant potentiellement un moyen de délivrer des médicaments. J'ai eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous réalisions des expériences visant à étudier la toxicité potentielle de différents nanomatériaux. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes finales de la synthèse peuvent être difficiles à apprendre.

Des procédures incorrectes peuvent entraîner la formation de structures agrégées ou aucune structure du tout. Pour réaliser la synthèse par auto-assemblage à l'aide de nanoparticules de cuivre ou de CMP, préparez une solution de nanoparticules de cuivre en pesant au moins deux milligrammes de CMP. Portez des gants jetables pendant cette étape afin d'éviter tout contact possible des CMP avec la peau.

Placer les nanoparticules dans un flacon en verre stérile vide de 16 millilitres contenant les CMP. Ajouter de l'eau déionisée stérile en volume approprié afin d'obtenir une solution de deux milligrammes par millilitre et homogénéiser la solution par vortex pendant 20 secondes pour assurer la dispersion des nanoparticules avant le début de la synthèse. Ne pas remplir le flacon au-delà de la moitié avec de l'eau, car cela inhiberait.

Le mélange par vortex provoque la décantation rapide des CMP au fond du flacon, qui prennent alors une couleur foncée. Sonez la solution de CNP pendant 17 minutes à température ambiante afin d'obtenir une dispersion maximale des CMP avant le début de la synthèse. Vérifiez périodiquement que les CMP sont bien en suspension grâce à la sonication ; après une sonication réussie, les CMP restent en suspension dans la solution pendant au moins 30 minutes, et la solution apparaît de couleur foncée.

Prélevez 7,29 milligrammes de cystine pour la synthèse. Étant donné que la cystine n'est pas directement soluble dans l'eau, placez la cystine dans un récipient de pesée antistatique, puis transférez-la dans le récipient contenant la cystéine. Ajoutez un volume suffisant de soude stérile à une molaire afin que la cystine se dissolve complètement, obtenant ainsi une solution à 72,9 milligrammes par millilitre.

Dissoudre complètement la cystéine dans 100 microlitres d'hydroxyde de sodium à un molaire. Ensuite, mélanger sept microlitres de cystéine dissoute avec 6 643 microlitres d'eau stérile dans un flacon de synthèse stérile. Placer le flacon contenant la solution mélangée dans l'incubateur pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius, avec le bouchon du flacon ventilé afin d'assurer un mélange efficace.

Il s'agira de la solution mère de cystéine. Remettre en suspension la solution de CNP à deux milligrammes par millilitre par vortex pendant 30 secondes, car les CMP se seront déposés après l'étape de sonication pour un volume total de synthèse de sept millilitres. Transférer la solution mère de cystéine dans un flacon de culture cellulaire de 25 centimètres carrés et ajouter 350 microlitres de CMP remis en suspension.

Remplacez le bouchon sur le flacon et serrez-le de manière à ce qu'il soit bien fixé. Après avoir combiné tous les composants pour la synthèse, mélangez délicatement dans le flacon en le faisant tourner quatre à cinq fois. Placez le flacon dans l'incubateur à dioxyde de carbone et ventilez le flacon en desserrant légèrement le bouchon afin de permettre des échanges gazeux entrants et sortants.

Pendant la synthèse, laissez la réaction se dérouler dans l’incubateur pendant environ 24 heures. Pendant ce temps, on peut observer au microscope et à l’œil nu la formation de composites fortement linéaires. Cette étape est cruciale afin de s’assurer que certaines structures se forment et que le processus d’auto-assemblage ne dure pas trop longtemps.

Interrompre la synthèse des biocomposites dès que des structures linéaires sont observées dans le flacon, en bouchant hermétiquement le flacon de synthèse ; étiqueter le flacon avec les conditions de synthèse, y compris la date d'utilisation de la synthèse et de l'incubation, ainsi que la durée de la synthèse avant l'arrêt. Ensuite, conserver le récipient au réfrigérateur, les structures formées restant stables sous cette forme pendant au moins un an. Alternativement, pour réaliser la synthèse par auto-assemblage à l'aide de sulfate de cuivre, remplacer les CMPs par du sel de sulfate de cuivre en utilisant une technique stérile, puis dissoudre au moins deux milligrammes de sulfate de cuivre dans un volume suffisant d'eau désionisée stérile afin d'obtenir une solution de deux milligrammes par millilitre.

Les cristaux de sulfate de cuivre se dissolvent facilement à cette concentration, mais vortexez le tube si nécessaire et vérifiez visuellement que tous les cristaux sont bien dissous après la préparation du sulfate de cuivre. Réalisez la synthèse comme vient de l'être démontré, mais remplacez les CMP par le sulfate de cuivre. Caractérisez les biocomposites obtenus à partir des CMP et à partir du sulfate de cuivre par microscopie en lumière blanche et par microscopie électronique afin de les analyser et de les inspecter.

L'observation par microscopie en lumière blanche utilise un microscope inversé. Les composés se déposent sur la surface inférieure du flacon en quelques minutes après avoir placé le flacon à plat, puis peuvent être mis au point. Utilisez le mode champ clair du microscope afin de maximiser le contraste entre les biocomposés et le milieu liquide. Les composés provenant de CMP et de sulfate de cuivre apparaissent quant à eux transparents à opaques, tandis que les agrégats de CNP non réagis apparaissent de couleur très foncée.

Utiliser la microscopie inversée en lumière blanche pour évaluer l'efficacité de la synthèse dans une expérience donnée. Par exemple, documenter la présence ou l'absence de CMP non réactifs dans la synthèse. Les flacons utilisés pour les biocomposites dérivés de CNP proviennent de flacons ayant différents paramètres, tels que le temps d'incubation ou la durée de la sonication.

Les PMCs individuels sont trop petits pour être observés au microscope optique, mais les agrégats de PMN non réactifs apparaîtront sous forme d'objets sombres et arrondis. Cela contraste avec les composites de PMN correctement synthétisés, qui présenteront un rapport d'aspect élevé, une forme linéaire et diverses longueurs. Évitez de prolonger la synthèse trop longtemps avant son arrêt, car cela entraînerait la formation de structures ramifiées en forme de oursin, difficiles à disperser en structures individuelles une fois formées.

Utilisez également la microscopie inversée en lumière blanche pour évaluer l'efficacité de la synthèse dans une expérience donnée utilisant du sulfate de cuivre. Étant donné que le sulfate de cuivre passe entièrement en solution, selon ce protocole, la solution apparaîtra moins foncée que la solution obtenue par synthèse utilisant des CMP.

Documenter la taille et l'étendue des composés de sulfate de cuivre en comparant des flacons ayant subi différentes conditions de synthèse, telles que la durée de synthèse avant l'arrêt. Pour concentrer d'abord les composés biosynthétisés par parasynthèse, ajouter six millilitres de structures issues des CNP ou de structures issues du sulfate de cuivre dans un tube conique de 15 millilitres. Centrifuger pendant 10 minutes à 500 ×g et à température ambiante afin d'obtenir un culot pour les petits volumes.

Ajouter 500 microlitres de structures en solution dans des tubes de 0,6 millilitre, centrifuger à 2000 ×g et à température ambiante pendant au moins 10 minutes pour former un culot. Placer les structures dans de l'eau stérile désionisée et soniquer pendant au moins 10 minutes pour les resuspendre. Au fil de ce processus, les structures deviennent fragmentées et plus petites en longueur moyenne.

Documentez les changements de taille des composites en fonction des durées de sonication à l’aide d’un microscope inversé en lumière blanche et d’une caméra numérique. Nos résultats représentatifs issus de la découverte de biocomposites dans un milieu de culture cellulaire montrent qu’après 82 heures, les dispersions initialement homogènes de CMP s’agrègent en microstructures. Avec le temps, les particules sont éliminées et de plus grands agrégats se forment. Enfin, des agrégats plus volumineux présentant des structures linéaires apparaissent, formant des structures de type oursin.

La transformation des PCM en composites biologiques linéaires est illustrée. Les PCM ont été combinés avec de la cystéine et de l'eau à partir de dispersions initiales homogènes de PCM. Des agrégats forment des microstructures après trois heures, des structures intermédiaires apparaissent au bout de six heures.

Des structures de grand rapport d'aspect forment la microscopie électronique. La caractérisation des biocomposites synthétisés par microscopie électronique en transmission montre les nanoparticules carbonées (CNP) du matériau de départ ainsi que la formation de composites linéaires à partir des microparticules composites (CMP). Les CMP sont rondes, comme le montre la microscopie électronique à balayage ou MEB. Les caractéristiques nano et micro des composites formés à partir des CMP et de la cystéine sont illustrées par MEB.

Les caractéristiques des composites formés à partir de sulfate de cuivre et de cystéine sont également illustrées par microscopie électronique à balayage et spectroscopie de dispersion d'énergie de rayons X. Une analyse élémentaire par spectroscopie de dispersion d'énergie de rayons X des matériaux de départ et des composants linéaires synthétisés est présentée. Les PCM de départ montrent un pic prononcé de cuivre en l'absence de soufre.

Les biocomposites à base de PCM et de cystine montrent l'apparition de pics de soufre et de carbone dus à la cystine à partir du sulfate de cuivre. Le matériau présente des pics pour le cuivre et le soufre. Les biocomposites à base de sulfate de cuivre et de cystine montrent l'apparition de pics de carbone dus à la cystine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 12 à 24 heures si elle est effectuée correctement.

Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de surveiller l'avancement de la synthèse à l'œil nu et au microscope, afin que les structures synthétisées n'agglomèrent pas trop. Après cette procédure, d'autres méthodes, comme le marquage fluorescent des structures, peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, par exemple si les structures synthétisées se lient aux cellules. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation des réactifs pour la synthèse, de leur association correcte, du suivi de l'avancement de la synthèse, ainsi que de la concentration et de la modification des structures après la synthèse.