Name: Induction et de lévaluation de lischémie-reperfusion dans coeurs de rat Langendorff perfusés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: Découvrez comment modéliser l'ischémie-reperfusion ex vivo sur cœur de rat isolé en utilisant le système de Langendorff. Cette technique permet d'évaluer la fonction myocardique par mesure de la pression ventriculaire.

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Cette publication a été soutenue par la recherche clinique et translationnelle (SCTR) Institut Caroline du Sud, avec un foyer universitaire à l&#39;Université médicale de Caroline du Sud, NIH / RNTAC Grant Nombre UL1 TR000062. Un soutien supplémentaire a été fourni par VA prix du mérite BX002327-01 de DRM. DJH a été soutenue par le NIH / RNTAC Grant Nombre TL1 TR000061 et par le NIH Grant Nombre T32 GM008716. SEA a été soutenu par des subventions du NIH Nombre T32 HL07260.

Toutes les procédures énumérés ici ont été approuvés par le Comité de protection des animaux et l&#39;utilisation institutionnelle à l&#39;Université médicale de Caroline du Sud. Les expériences décrites ici sont, des expériences non-survie aigus. En tant que tel, il n&#39;y a aucune utilisation de pommade ophtalmique et un bloc opératoire stérile est pas nécessaire. L&#39;euthanasie est obtenu par saignée pendant la récolte du cœur. 1. Préparation expérimentale <ol><li> Mettre en place soit une pression constante ou un débit constant perfusion de Langendorff Appareil 4. </li><li> Préparer 4 litres de tampon de Krebs-Henseleit modifiée (en mM: NaCl 112, KCl 5, 1,2 MgSO 4, 1 K 2 HPO 4, CaCl2 1,25, NaHCO 3 25, 11 D-glucose, l&#39;acide octanoïque 0,2, pH = 7,4). <ol><li> Assurez 10x actions tampons. <ol><li> Dissoudre NaCl, KCl, MgSO 4 et K 2 HPO 4 dans 3 L d&#39;eau ultrapure. </li><li> Dissoudre CaCl2 dans 500 ml d&#39;eau ultra pure wie 40 ml de HCl 1 N. </li><li> Ajouter lentement solution de CaCl 2 à la mémoire tampon réalisés dans 1.2.1.1. Ajouter de l&#39;eau ultra pure assez pour totalisera 4 L. permettent de remuer pendant 1 heure avant de filtrer à travers un filtre de 0,8 um. Conserver à 4 ° C. </li><li> Dissoudre NaHCO 3 à 4 L d&#39;eau ultra-pure. Laisser agiter pendant 1 heure avant de filtrer à travers à 0,8 um filtre. Conserver à 4 ° C </li></ol></li><li> Mélanger 400 ml 10x tampon de Krebs Henseleit avec 400 ml 10x tampon NaHCO 3. Ajouter suffisamment d&#39;eau ultra-pure à totalisera 4 L. Dissoudre le glucose et l&#39;acide octanoïque, tout en agitant. Filtrer à travers 0,8 um filtre. </li></ol></li><li> Préparez-vous pour le système cardiaque. <ol><li> Ajouter 2 L de tampon filtré à un 4 L bouteille placé 38 en dessus du robinet fixé à la canule aortique. Cela donnera une pression de perfusion de 70-80 mmHg au cœur, qui est la pression de perfusion recommandé 4. </li><li> Insérez dispersion barboteur de gaz dans la mémoire tampon dans la bouteille. </li><li> Exécutez le tampon à travers le système, en étant sûr d&#39;éliminer les bulles à l&#39;intérieur du tube. </li><li> Activer le gaz (95% O 2/5% CO 2) d&#39;au moins 30 min avant de cœur doit être placé sur le système. Utilisation d&#39;une sonde d&#39;écoulement de gaz et l&#39;analyseur de gaz de sang pour vérifier la saturation en oxygène. </li></ol></li><li> Préparer fournitures chirurgicales et ballon. <ol><li> Pour la récolte de cœur, de préparer une paire de 6,75 &quot;ciseaux chirurgicaux, une paire de 4.5&quot; ciseaux, deux paires de pinces hémostatiques, deux ensembles de pince caramalt, deux seringues avec 27 g d&#39;aiguilles, 2 morceaux de 0-jauge suture de soie (environ 15 cm de longueur), une canule à barbillons 1/16 de pouce, et une canule trachéale. </li><li> Pour assembler canule trachéale, coller un court morceau de tuyau en plastique de diamètre 1/16 pouces à un connecteur en Y. </li><li> Pour assembler un appareil de ballon: fixer une aiguille de gavage à un morceau de tuyau 1/16 de pouce, puis fixer la tuyauterie à un logement de capteur de pression. Une petite seringue fixée à l&#39;autre côté de la pression de transducer logements permettra à l&#39;inflation et la déflation du ballon. <ol><li> Couper un carré de la pointe de pellicule plastique et le lieu d&#39;une aiguille de gavage dans le centre. Enveloppez la pellicule de plastique autour de l&#39;aiguille de gavage. </li><li> Remplissez ballon avec une solution saline et attacher avec deux points de suture. Gonflez ballon pour assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de fuites. Le volume de solution saline à l&#39;intérieur du ballonnet gonflé doit être approximativement de 200 pi, mais peut varier en fonction de la taille du rat. </li><li> Sinon, utilisez un lit latex de doigt à la place de la pellicule de plastique. Placez aiguille de gavage dans les doigtier, remplir avec une solution saline et attacher. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Récolte cœur <ol><li> Retenez un rat Sprague Dawley utilisant un decapicone ou un autre dispositif de retenue manuel. Peser rat. </li><li> Administrer la kétamine / xylazine mélange (0,85 mg / kg de kétamine et 0,15 mg / kg de xylazine) par injection intrapéritonéale à anesthésier rat. Cette dose d&#39;anesthésique fournira anesthésie suffisantes pour20-40 min, mais la procédure devrait être achevée aussi rapidement que possible après l&#39;anesthésie est confirmée. </li><li> Confirmez bon degré de l&#39;anesthésie par des tests pincement de l&#39;orteil réflexe. </li><li> Trachéotomie <ol><li> Retirer peau à partir de mi-patte à la base de la mâchoire, en utilisant des produits hémostatiques pour élever peau et ciseaux pour faire incision. Gardez la peau élevée à séparer du muscle sous-jacent, permettant de couper le long de la fourrure et le retirer. </li><li> Utilisation de pinces hémostatiques, soulevez le tissu glandulaire et de faire une incision horizontale au fascia inférieur au tissu glandulaire. Utilisez des pinces hémostatiques pour répandre incision ouverte, en prenant soin de ne pas entailler les veines jugulaires. </li><li> Utilisation de pinces hémostatiques, pincée muscle recouvrant la trachée et l&#39;aide de ciseaux font une incision transversale dans le muscle juste en dessous de la pointe des pinces hémostatiques. Utilisation de pinces hémostatiques, répartis tissu pour révéler la trachée. </li><li> Insérez soigneusement hémostatiques dans la trachée, de compensation fascia tout en progressant par doucement avancer et reculer hémostatiques. </li><li>Une fois hémostatiques sont placés avec succès derrière la trachée, pincez 0-0 suture de soie avec des pinces hémostatiques et hemisect la trachée avec une petite paire, de ciseaux. </li><li> Insérez canule trachéale dans la trachée hemisected, tirez suture derrière la trachée, et attacher la suture autour de la trachée canule, l&#39;ancrage de la suture à la Y-aine de la canule avec un noeud de chirurgiens. </li><li> En utilisant une aiguille 27 G, injecter 1 000 U / kg d&#39;héparine dans la veine jugulaire et laisser circuler pour 30 sec. </li></ol></li><li> Thoracotomie <ol><li> Retirer fourrure provenant milieu de l&#39;abdomen à la région mi-patte en pinçant avec pinces hémostatiques et couper avec des ciseaux. </li><li> Faire un ¾ de pouce transversale incision dans la paroi musculaire abdominale, juste en dessous du diaphragme. </li><li> Faire une incision verticale sur le mur de la paroi abdominale et la poitrine, coupe le long du sternum. </li><li> Coupez le diaphragme retour bilatéralement, puis étaler la cage thoracique pour révéler coeur, pince cage thoracique avec des pinces hémostatiques pour assurer qu&#39;il demeure propagation. </li&gt; <li> Utilisation de pinces hémostatiques, retirez délicatement le thymus, exposer l&#39;aorte ascendante. </li><li> Taquiner hémostatiques dans la boucle de l&#39;aorte, avancer et reculer hémostatiques et doucement propagation fascia pour permettre pointe de pinces hémostatiques travers. </li><li> Utilisez des pinces hémostatiques pour tirer 0-0 soie suture derrière l&#39;aorte ascendante, ligaturer dans un demi-carré noeud lâche. </li><li> Tournez le robinet pour commencer flux de tampon de perfusion, hemisect aorte et l&#39;insérer immédiatement la canule dans la lumière de l&#39;aorte. Rapidement sangler un nœud de demi-carré et compléter le noeud, serrer à fond. </li><li> Utilisez des ciseaux à disséquer coeur loin des gros vaisseaux, retirez le cœur de la poitrine et l&#39;attacher à la colonne de perfusion. </li><li> Coupez le tissu pulmonaire excès et permettre cœur à équilibrer sur la colonne pendant environ 15 minutes avant l&#39;insertion de ballon. Utiliser un débit normal de tampon à travers le cœur de 10-20 ml / min. </li></ol></li></ol> 3. perfusion de Langendorff et l&#39;ischémie-reperfusion <ol><li> Placement de LV préssure ballon <ol><li> Dégonfler ballon tout en roulant en forme de cône et tourner le robinet pour assurer ballon reste dégonflé. </li><li> Accise oreillette gauche avec une petite paire de ciseaux pour exposer l&#39;accès à la valve mitrale. </li><li> Insérez ballon à travers l&#39;oreillette gauche et la valve mitrale dans le ventricule gauche. </li><li> Lancer le logiciel de surveillance de la pression (LabChart Pro). </li><li> Gonflez ballon en ouvrant le robinet et doucement une quantité croissante de solution saline en ballon jusqu&#39;à la pression diastolique de micromanomètre dépasse zéro. </li><li> Pour vérifier la réponse longueur-tension, gonfler ballon lentement à une pression diastolique de 75 mmHg, dégonfler lentement, répéter une fois. </li><li> Régler la pression diastolique de 10 mmHg en modulant la quantité de solution saline dans le ballon. Tournez le robinet pour sceller ballon à ce niveau de l&#39;inflation, et de maintenir le système de pression fermée entre LV ballon et capteur de pression. </li><li> Basse coeur dans la chambre de la chambre et le couvercle chauffé avec du plastique. </li></ol></li><li> Annonceministère de l&#39;ischémie-reperfusion <ol><li> Branchez le fond de la chambre chauffée et permet de remplir la chambre avec un tampon épanché. </li><li> Lorsque le tampon a submergé coeur, tourner le robinet pour arrêter l&#39;écoulement de tampon dans le cœur, induisant une ischémie globale. temps d&#39;ischémie peut varier en fonction des objectifs de l&#39;expérience. </li><li> Après 30 min d&#39;ischémie, tourner le robinet pour restaurer le flux de tampon dans le cœur, initiant reperfusion. </li><li> Autoriser la reperfusion du coeur pendant 1 heure avant de terminer l&#39;expérience. Utilisez des temps de reperfusion variables, en fonction des objectifs de l&#39;expérience. </li></ol></li><li> Résiliation de l&#39;expérience et de récolte de tissus <ol><li> Utilisation du port de côté du robinet, administrer 10 ml de solution saline tamponnée phosphate à 4 ° C dans le cœur à un taux de 10 ml / min pour arrêter le coeur. </li><li> Retirer le cœur de la colonne de perfusion, rogner tissu auriculaire restant. </li><li> Placez coeur dans une matrice de découpage de tissu en acier inoxydable, couvrir avec Parafilm, et le lieu à -80 ° C pendant 8 minutes, ou jusqu&#39;à ce que le coeur a une consistance de guimauve-like. </li><li> Retirer le bloc du congélateur et insérer des lames de rasoir dans le tranchage matrice pour découper coeur en tranches de 2 mm. blocs de tissus peuvent également être achetés avec des tranches dimensions autres que 2 mm. </li><li> Retirer les tranches une à la fois et déposez-les dans de l&#39;azote liquide à clignoter geler pour les études biochimiques. Conserver la troisième tranche ventriculaire du sommet pour l&#39;infarctus coloration. </li><li> Retirer le tissu de l&#39;azote liquide et conserver à -80 ° C jusqu&#39;à utilisation dans des expériences biochimiques. </li></ol></li><li> Infarctus coloration <ol><li> Incuber la troisième tranche ventriculaire dans 10 ml de 1% p / v de chlorure de triphényltétrazolium (TTC) à 37 ° C pendant 15 min. Note: Incubation dans TTC peut être réalisée pour 15 ou 30 minutes, sans modification de 15 l&#39;efficacité. </li><li> Transfert tranche de tissu à partir de TTC à 10% de formaline tamponnée et laisser incuber à la température ambiante pendant une nuit. Pour des résultats optimaux, entendrets doivent être prises hors de formol et imagés dans les 24 heures 4. </li><li> Taché logiciel de tranche et de l&#39;utilisation de Droits tel que ImageJ pour estimer la taille de l&#39;infarctus selon le protocole du fabricant. Prenez des photos dès que possible après la fixation, comme le colorant va disparaître au fil du temps. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Le coeur de rat isolé perfusé peut être utilisé avec succès pour étudier l&#39;effet de l&#39;intervention pharmacologique sur préconditionnement cardiaque dans l&#39;ischémie reperfusion 9. Cependant, il ya certaines étapes essentielles de la procédure qui doit être normalisée afin d&#39;assurer des résultats reproductibles. Le maintien d&#39;une température de 37,4 ° C dans le système est critique, car même une légère hypothermie et l&#39;hyperthermie peuvent provoquer préconditionnement cardiaque 10,1...

Élucidation des événements sous-jacents de la réponse cardiaque à la fois à l&#39;ischémie et la reperfusion sont essentiels pour améliorer le traitement des infarctus 1 et cardiaques procédures chirurgicales qui nécessitent du myocarde clampage aortique 2. Alors que les modèles in vivo d&#39;une lésion de reperfusion d&#39;ischémie permettent une analyse de point de terminaison très utiles, ils ne sont pas aussi efficaces pour étudier les effets fonctionnels de la lésion de reperfusion d&#39;ischémie aiguë en temps réel. En outre, dans les modèles d&#39;ischémie reperfusion vivo produisent généralement la variabilité significative de la taille de l&#39;infarctus, et la livraison directe de médicaments au cœur au moment de la reperfusion est difficile. L&#39;utilisation d&#39;un système de cœur isolé de Langendorff pour l&#39;étude des lésions d&#39;ischémie de reperfusion permet une évaluation fonctionnelle en temps réel des traitements pharmacologiques, zone uniforme de tissu infarci et livraison instantanée du médicament directement dans le myocarde. D&#39;abord décrit by Langendorff Oscar en 1895 3, au coeur de Langendorff isolé est un modèle robuste pour étudier les lésions de reperfusion d&#39;ischémie, après avoir été utilisé dans la recherche de reperfusion d&#39;ischémie pendant les 40 dernières années 4,5. Ici, quelques modifications sont apportées pour optimiser le coeur isolé pour l&#39;analyse fonctionnelle. Dans cathétérisme situ de l&#39;aorte alors que le cœur bat assure que le cœur ne connaît pas le préconditionnement ischémique, qui pourrait altérer les résultats des essais ischémie reperfusion 6. Pour faciliter cela, une trachéotomie est réalisée, ce qui permet la ventilation et assurer la stabilité physiologique du rat au cours de la chirurgie. Le cœur est ensuite fixé à une colonne à chemise d&#39;eau en spirale à travers laquelle le verre tampon Krebs Henseleit est envoyé par perfusion rétrograde directement dans l&#39;aorte. Un ballon rempli de solution saline est introduite dans le ventricule gauche et fixé à un transducteur de pression, ce qui permet la mesure du temps réel de la pression de l&#39;intérieur de l&#39;un ventriculed calcul des paramètres fonctionnels multiples. À la fin de l&#39;expérience, le cœur est rincée avec une solution saline froide pour arrêter la contraction et le flash congelés dans l&#39;azote liquide pour permettre une analyse en aval du taux d&#39;ADN, ARN et de protéines. Ainsi modifié, le cœur de Langendorff perfusé sert d&#39;un système efficace pour la surveillance directe de l&#39;effet physiologique des interventions pharmacologiques à tout moment aiguë au cours de la lésion d&#39;ischémie reperfusion.

<table><tbody><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma Aldrich</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Sigma Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>203726</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de potassium dibasique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>RES20765-A7</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium dihydraté</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Acide octanoïque</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C2875</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de 2,3,5-triphényltétrazolium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8877</td><td></td></tr><tr><td>Transducteur de pression médical</td><td>MEMSCAP</td><td>SP844</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique Masterflex</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07521-40</td><td></td></tr><tr><td>Tête de pompe Masterflex Easy Load</td><td>Cole Parmer</td><td>EW-07518-10</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie à circulation chauffé</td><td>Lauda</td><td>M3</td><td></td></tr><tr><td>Module de débit de tube</td><td>Transonic</td><td>TS410</td><td></td></tr><tr><td>Console de recherche modulaire</td><td>Transonic</td><td>T402</td><td></td></tr><tr><td>Capteur de débit en ligne</td><td>Transonic</td><td>ME2PXN</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab Dispositif d’acquisition de données</td><td>AD Instruments</td><td>PL3508</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel d’acquisition de données LabChart</td><td>AD Instruments</td><td>MLU60/8</td><td></td></tr></tbody></table>

induction et de l&#39;évaluation de l&#39;ischémie-reperfusion dans coeurs de rat langendorff perfusés

Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts

Les événements biochimiques entourant les lésions d’ischémie-reperfusion en milieu aigu sont d’une grande importance pour faire avancer de nouvelles options de traitement de l’infarctus du myocarde et des complications cardiaques de la chirurgie thoracique. La capacité de certains médicaments à préconditionner le myocarde contre les lésions d’ischémie et de reperfusion a conduit à de multiples essais cliniques, avec peu de succès. Le modèle cardiaque isolé permet une observation aiguë des effets fonctionnels des lésions d’ischémie-reperfusion en temps réel, y compris les effets de diverses interventions pharmacologiques administrées à n’importe quel moment avant ou pendant la fenêtre de lésion d’ischémie-reperfusion. Étant donné que de brèves périodes d’ischémie peuvent préconditionner le cœur contre une lésion ischémique, une canulation aortique in situ est réalisée pour permettre une évaluation fonctionnelle du myocarde non préconditionné. Un ballonnet rempli de solution saline est placé dans le ventricule gauche pour permettre de mesurer en temps réel la génération de pression. La lésion ischémique est simulée par l’arrêt du flux tampon de perfusion, suivi d’une reperfusion. La durée de l’ischémie et de la reperfusion peut être modulée pour examiner les événements biochimiques à un moment donné. Bien que le modèle du cœur isolé de Langendorff ne permette pas de prendre en compte les événements systémiques affectant l’ischémie et la reperfusion, il s’agit d’un excellent modèle pour l’examen des événements fonctionnels et biochimiques aigus dans la fenêtre de lésion de reperfusion d’ischémie ainsi que de l’effet de l’intervention pharmacologique sur le pré et post-conditionnement cardiaque. L’objectif de ce protocole est de démontrer comment réaliser in situ une canulation aortique et une exérèse cardiaque suivies d’une lésion d’ischémie/reperfusion dans le modèle de Langendorff.

L&#39;appareil ventriculaire gauche ballon permet un suivi en temps réel de la pression développée par le pouvoir ventricule gauche (Figure 1). Comme décrit précédemment 7, cette trace de pression peut être utilisée pour calculer un grand nombre de paramètres de la fonction ventriculaire. Ces calculs peuvent être effectués dans la phase initiale, ainsi que la phase de reperfusion, moyennées sur plusieurs traces à l&#39;intérieur de chaque groupe, et on les compare afin de déterminer si l&#39;...

Le cœur isolé du rat est un modèle durable de lésion d’ischémie reperfusionnelle. Ici, nous décrivons le processus de prélèvement du cœur battant d’un rat via la canulation aortique in situ, la perfusion de Langendorff du cœur, la lésion d’ischémie-reperfusion simulée et la coloration de l’infarctus pour confirmer l’étendue de l’agression ischémique.

Induction et de l&#39;évaluation de l&#39;ischémie-reperfusion dans coeurs de rat Langendorff perfusés

The biochemical events surrounding ischemia reperfusion injury in the acute setting are of great importance to furthering novel treatment options for ...

L'objectif général de cette procédure est de modéliser l'ischémie et la lésion de reperfusion ex vivo. Cela est réalisé en anesthésiant d'abord un rat et en ouvrant la poitrine pour canuler l'aorte au niveau de C deux, empêchant ainsi la préconditionnement ischémique du myocarde. Ensuite, le cœur est retiré et fixé à un appareil de perfusion en mode non recirculant.La dernière étape consiste à induire une lésion par ischémie-reperfusion en arrêtant l'écoulement du tampon pendant une période déterminée, puis en rétablissant l'écoulement. En fin de compte, la génération de pression ventriculaire est utilisée pour montrer l'effet de la lésion par ischémie-reperfusion sur la fonction myocardique. Cette méthode peut être utilisée pour aider à répondre à des questions clés dans le domaine de l'ischémie-reperfusion cardiaque, telles que quels événements moléculaires se produisent durant les premières heures dynamiques de la lésion par ischémie-reperfusion.Pour commencer, calculez l'anesthésique nécessaire une fois que l'anesthésie du rat a été confirmée. Commencez la trachéotomie en ouvrant d'abord la peau du milieu des quatre pattes jusqu'à la base de la mâchoire. Utilisez des pinces hémostatiques pour écarter les tissus et exposer le muscle.Ensuite, à l’aide de pinces hémostatiques, soulevez le tissu glandulaire et utilisez des ciseaux pour pratiquer une incision inférieure dans la fascia. Écartez le tissu exposé à l’aide d’une autre paire de pinces hémostatiques. Veillez à ne pas entailler la jugulaire.Effectuez maintenant une incision transversale dans le muscle recouvrant la trachée à l’aide de ciseaux et avec l’aide de pinces hémostatiques. Utilisez ensuite les pinces hémostatiques pour dégager soigneusement la trachée, positionnez les pinces sous la trachée tout en éliminant le fascia au cours du processus. Pincez ensuite la soie 0,0 avec les pinces hémostatiques derrière la trachée.Ensuite, utilisez des ciseaux pour faire un hémis. Disséquez la trachée dans la trachée. Insérez la canule trachéale et fixez-la avec le fil de suture, sans faire le nœud sur le rameau en Y du groin de la canule.À l’aide d’une seringue munie d’une aiguille de calibre 27, injectez maintenant 1000 unités d’héparine par kilogramme dans la veine jugulaire. Attendez 30 secondes avant de procéder à la thoracotomie. Commencez la thoracotomie en retirant la peau entre le milieu de l’abdomen et le milieu du quatrième espace intercostal à l’aide de pinces hémostatiques et de ciseaux.Effectuez ensuite une incision d’environ deux centimètres dans la paroi abdominale juste sous le diaphragme. Poursuivez l’incision verticalement le long du sternum. Ensuite, sectionnez le diaphragme bilatéralement afin d’exposer la cage thoracique.Maintenant, écartez la cage thoracique et fixez-la sur les côtés à l’aide de pinces hémostatiques, mettant ainsi le cœur en évidence. La mise en place de deux canules sur l’aorte est l’étape la plus critique de la procédure. La canule doit être insérée avec précision puis ligaturée rapidement afin d’éviter au cœur une courte période d’ischémie, ce qui modifierait les résultats du rétablissement de la perfusion après ischémie.Expérimentez avec des hémostats. Retirez soigneusement le thymus pour accéder à l'aorte ascendante. Manœuvrez les hémostats à travers la boucle aortique en passant par la fascia.Ensuite, passez un fil de soie 0-0 à travers l'ouverture et faites un nœud simple lâche. Démarrez maintenant le flux de tampon de perfusion à travers la canule. Ensuite, hémez, disséquez l'aorte et insérez immédiatement la canule dans la lumière aortique.Fixez la canule en resserrant le nœud et en le terminant par un nœud carré. À l’aide de ciseaux, disséquez le cœur des gros vaisseaux. Une fois libéré, retirez-le et fixez-le à la colonne de perfusion.Retirez le tissu pulmonaire excédentaire. Après environ 15 minutes, le cœur sera équilibré avec un débit normal de tampon compris entre 10 et 20 millilitres par minute. Une fois que le cœur est raccordé à la colonne, on peut insérer le ballonnet.Tout d'abord, dégonflez le ballonnet en le roulant en forme de cône. Verrouillez l'écoulement vers le ballonnet une fois qu'il est dégonflé. Ensuite, accédez à la valve mitrale en excisant l'oreillette gauche du cœur.Troisièmement, insérez le ballonnet par la valve mitrale dans le ventricule gauche. Commencez maintenant à surveiller la pression systolique et diastolique à l’aide du logiciel Lab Chart Pro, puis gonflez le ballonnet jusqu’à ce que la pression soit supérieure à zéro. Ensuite, vérifiez la réponse tension-longueur.Gonflez lentement le ballonnet jusqu'à ce que la pression atteigne 75 millimètres de mercure. Ensuite, dégonflez-le lentement et répétez l'opération. Réduisez la pression jusqu'à 10 millimètres en ajustant la salive dans le ballonnet.Ensuite, verrouillez le ballonnet à cette pression et maintenez un système de pression fermé entre le ballonnet et le transducteur. Enfin, abaissez le cœur dans une chambre chauffée et enveloppez-le dans un film plastique. La chambre doit être bouchée afin qu'elle se remplisse d'un tampon fondu.Une fois que le cœur est immergé, arrêtez l'écoulement du tampon. Cela induit une ischémie globale pendant la durée nécessaire. Dans ce cas, 30 minutes.Après 30 minutes, interrompre l'ischémie en rétablissant le flux de tampon vers le cœur et en débranchant la chambre. Poursuivre la reperfusion pendant la durée souhaitée, puis terminer l'expérience, ce qui correspondra ici à une heure de reperfusion à partir du raccord latéral du robinet. Administrer 10 millilitres de PBS glacé pendant une minute.Cela provoquera l'arrêt cardiaque. Ensuite, retirez le cœur de la colonne et éliminez tout tissu atrial résiduel. Séchez délicatement le cœur, transférez-le vers une matrice de découpe et recouvrez-le de perfil.Congelez le cœur à moins 80 degrés Celsius pendant huit minutes ou jusqu'à ce qu'il ait la consistance d'un guimauve. À l'aide de lames de rasoir, découpez le cœur en tranches de deux millimètres ou, selon les préférences, retirez chaque tranche individuellement et congelez-la dans de l'azote liquide. Pour les études biochimiques, les tranches congelées doivent ensuite être conservées à moins 80 degrés Celsius.Pour la coloration des infarctus, conserver une coupe non congelée dans l'azote liquide. Avec le protocole décrit. L'appareil en forme de ballonnet pour le ventricule gauche permet une surveillance en temps réel de la pression développée par le ventricule gauche en contraction.Dans un cœur normal, la pression développée varie de 70 à 130 millimètres de mercure. Après une lésion ischémique, la pression développée est réduite et la pression télédiastolique est élevée lorsque les animaux sont administrés. Un agent de préconditionnement comme l'inhibiteur des HDAC de classe un et deux saha administré avant l'excision peut entraîner une variation de la pression de base et les effets de la lésion d'ischémie-reperfusion sont atténués.D'autres mesures de la fonction du ventricule gauche peuvent également être directement obtenues ou calculées à partir des résultats fournis par le logiciel. Lors de l'analyse du cœur lésé au TTC, qui colore en rouge les tissus métaboliquement actifs, il était évident que les cœurs soumis à une lésion d'ischémie-reperfusion présentaient une activité métabolique nettement réduite, indiquant la présence de tissu infarci après cette procédure. Des techniques telles que la PCR quantitative en temps réel, le Western blot et la spectrométrie de masse peuvent être utilisées pour répondre à des questions telles que : quels sont les effets biochimiques et génétiques de l'ischémie, de la lésion de reperfusion et du traitement médicamenteux sur le cœur ?

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