Name: Induction directe de Hemogenic endothélium et le sang par la surexpression de facteurs de transcription dans pluripotentes humaines Cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-12-03T10:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Découvrez l'induction d'endothélium hémogénique et de cellules sanguines à partir de cellules souches pluripotentes humaines par surexpression de facteurs de transcription. Cette méthode permet d'étudier la transition endothélio-hématopoïétique in vitro.

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Nous remercions Matt Raymond pour son aide rédactionnelle. Ce travail a été soutenu par des fonds de l’Institut national de la santé (U01HL099773, R01HL116221 et P51 RR000167) et de la Fondation Charlotte Geyer.

1. préparations de virus et facteur de transcription Combinaisons <ol><li> Préparer des solutions avec pSIN EF1-lentiviral plasmide d&#39;expression contenant l&#39;ADN codant pour la protéine de ETV2, GATA1, GATA2, LMO2 et TAL1 (tableau 1). </li><li> Mesurer la concentration et la pureté des préparations de plasmides utilisés pour la production lentiviral enregistrement par absorption UV avec un spectrophotomètre à 230 nm, 260 nm et 280 nm. Note: préparations d&#39;ADN démontrant A260 / 280 et A260 / 230 des valeurs supérieures à 1,8 sont généralement considérés comme de bonne qualité. A260 / 280 valeurs inférieures peuvent indiquer une contamination de la protéine, tandis que la baisse A260 / 230 valeurs indiquent les impuretés avec des sels ou un peu de solvant tel que le phénol. Concentration de plasmide recommandée est de 1-3 pg / pl. </li><li> Produire lentivirus pour transductions comme décrit dans les protocoles précédemment publiés 11. Induction de SE avec un potentiel pan-myéloïde nécessite co-expression de ETV2 et GATA1 ou ETV2 et GATA2.Induction de SE avec un potentiel erythro- et mégacaryocytes nécessite GATA2 et TAL1. L&#39;addition de LMO2 améliore de manière significative le rendement en cellules érythro-mégacaryocytaire de hPSCs en présence de 10 GATA2 et TAL1. </li></ol> 2. hPSCs Protocole Culture <ol><li> Cultiver des cellules souches pluripotentes en colonies serrées avec des arêtes vives à 70-80% de confluence avant repiquage. Mark et retirer spontanément différenciées colonies avant passage de cellules. </li><li> Diluer gel commercial de la matrice extracellulaire (voir le tableau 2) selon les instructions du fabricant et des plaques à 6 puits couche pendant une nuit à 4 ° C ou pendant au moins 1 heure à 37 ° C avant utilisation. Avant de passage de cellules, aspirer la matrice, ajouter 2 ml de milieu de culture commerciale complète frais (voir le tableau 2) et de garder les plaques à 37 ° C, 5% de CO2 jusqu&#39;à ce que les cellules sont prêtes pour l&#39;ensemencement. </li><li> HPSCs Passage <ol><li> Aspirate moyen d&#39;un puits de confluence d&#39;une plaque à 6 puits avec hPSCs et ajouter 1,5 ml de solution dispase II préchauffé (2 mg / ml dans du DMEM / F12, stérilisé par filtration à travers des filtres de 0,22 um). Incuber pendant 5-7 minutes à 37 ° C, 5% CO 2 jusqu&#39;à ce que les bords des colonies commencent à se soulever de la surface. </li><li> Aspirer solution Dispase II et se laver soigneusement les colonies à deux reprises par l&#39;ajout puis aspirer 2 ml de milieu DMEM / F12 frais. Puis, en utilisant un 5 ml sérologique pipette en verre, dissocier hPSCs avec 3 ml de milieu frais de culture complet commerciale (voir le tableau 2) par pipetage suspension cellulaire monter et descendre plusieurs fois. </li><li> Ajouter 0,5 ml de suspension cellulaire dans chaque puits d&#39;une plaque à 6 puits contenant 1,5 ml de milieu de culture complet commerciale (voir le tableau 2). Agiter la plaque arrière et de droite à gauche à plusieurs reprises pour assurer une répartition uniforme des cellules où situer la plaque dans l&#39;incubateur. Maintenir les cellules à 37 ° C, 5% CO 2 pour une8-24 h. </li><li> La prochaine moyen de changement de jour dans un milieu frais de culture complet commerciale (voir le tableau 2) et d&#39;examiner hPSCs morphologie. Résultats de passages réussis dans de petites colonies, bien attachés retenue HPSC morphologie. hPSCs doivent être nourris avec 2,5-3 ml par puits freshmedium sur une base quotidienne et un passage tous les 4-5 jours à pas plus de 70-80% de confluence. REMARQUE: si hiPSCs ont été maintenues sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF), ils doivent être transférés à des conditions exemptes d&#39;alimentation et des passages 2-3 fois avant transduction pour assurer la différenciation efficace. </li></ol></li></ol> 3. Induction de Hematoendothelial Pprecursors de hPSCs (jour 0, la transduction du hPSCs) <ol><li> Pour préparer le milieu de réaction combiner 1,3 ml de milieu sans sérum complète commerciale (voir le tableau 2), le virus, polybrène, et l&#39;inhibiteur de ROCK Y27632 (tableau 1): ajouter 1,3 pi d&#39;inhibiteur de ROCK 10 mM à 1,3 ml de milieu à une concentration finaletion de 10 uM, et de polybrène à une concentration finale de 6 ug / ml. <ol><li> Ajouter une quantité appropriée de concentré (s) virale à une concentration finale de 0,5 à 1,0 MOI (multiplicité d&#39;infection) de chaque virus par cellule. Garder milieu réactionnel sur de la glace ou à 4 ° C jusqu&#39;à ce que la suspension cellulaire unique est prêt. REMARQUE: La même quantité de virus pour chaque MOI dans la GATA1 / ETV2, GATA2 / TAL1, et des mélanges de GATA2 / TAL1 / de réaction de LMO2 est optimale pour l&#39;induction de la différenciation. Cultures Toutefois, dans ETV2 / GATA2 transduites doublement MOI pour GATA2, par rapport à ETV2, améliore la différenciation. Par conséquent, pour ces cultures, le ratio 1: 2 pour MOI de ETV2 et une MOI de GATA2 est recommandée (par exemple, si le concentré viral est estimé à environ 6,8 x 10 7 particules / ml, ajouter 10 ul de ETV2 et 20 ul de GATA2 concentrés viraux à 0,68 x 10 6 cellules par une seule réaction ETV2 / GATA2 dans un 35 mm et d&#39;une plaque de 6 puits). </li></ol></li><li> Préparer hPSCs en une seule susp cellulaireension. <ol><li> Cultivez hPSCs dans des conditions exemptes de cellules nourricières, comme décrit dans la section 2. Le jour 4 suivant le dernier passage, observer la densité cellulaire et de morphologie sous un microscope inversé. hPSCs doivent croître en colonies serrées avec des arêtes vives, sans différenciation spontanée et atteindre ~ 60-70% de confluence le jour de la transduction. </li><li> Aspirer le milieu, ajouter 1,5-2 ml de réactif commerciale de dissociation cellulaire (tableau 1) par puits et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant 5-7 min. </li><li> Recueillir des cellules dans des volumes égaux de milieu complet commerciale (voir le tableau 2) avec 10 uM de l&#39;inhibiteur de ROCK, compter les cellules et de déterminer la viabilité. Pellet cellules par centrifugation à 200 g pendant 5 min, puis remettre en suspension les cellules dans un milieu complet commerciale avec 10 uM de l&#39;inhibiteur de ROCK à une concentration de 3.4-5 x 10 6 cellules par ml. NOTE: La viabilité des cellules est essentiel pour la transduction virale réussie et la différenciation ultérieure.Généralement, la viabilité des cellules avant la transduction doit être supérieure à 90%. </li></ol></li><li> Ajouter 200 ul de la suspension cellulaire, contenant 0.68-1 x10 6 cellules, dans 1,3 ml du milieu de réaction préparé en 3.1. </li><li> Aspirer la solution de la matrice de la plaque de 6 puits revêtu nuit préparé en 2.2., Transférer le mélange de réaction à un puits d&#39;une plaque à 6 puits et distribuer les cellules uniformément. Incuber à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant 24 heures. Après 24 h au moins 80% des cellules doit être fixé à la matrice. </li></ol> 4. Induction de Hematoendothelial précurseurs de hPSCs (Jour 1-7) <ol><li> 24 heures après la transduction, éliminer le milieu contenant le virus et laver les cellules attachées avec un milieu de culture cellulaire incomplète commerciale (voir le tableau 1), puis ajoutez 3 ml par puits de milieu de culture cellulaire incomplète commerciale contenant des cytokines hématopoïétiques: EFC 100 ng / ml, TPO 50 ng / ml de bFGF, 20 ng / ml (ci-après dénommé 3F-moyen). </li><li> Remplacer milieu total avec des produits frais 3F-moyen les jours 2, 3 et 4 jours pour éliminer les cellules mortes et les débris. Après le jour 4, lorsque les cellules hématopoïétiques flottantes apparaissent, remplacer la moitié de la 3F-support tous les jours tout en conservant le volume total à 4 ml. NOTE: pSIN-EF1 plasmides d&#39;expression lentiviral incorporent gène de résistance à la puromycine permettant ainsi une sélection positive des cellules transduites. Le 1 ug / ml de puromycine peut être ajouté au milieu au cours des 1-2 premiers jours de différenciation pour éliminer les résiduels des hPSCs indifférenciées. </li><li> Observez la morphologie des cellules le jour 4 sous un microscope inversé: grappes serrées de cellules ayant une morphologie typique endothéliale commencent à apparaître (Figures 2A, 3A). Globules ronde apparaît du jour 5 au jour 7 de la différenciation, tandis que certaines régions peuvent conserver hPSCs morphologie. Analyser HE et différenciation hématopoïétique tel que décrit ci-dessous. REMARQUE: différente hematoendothelial réussieiation se traduit par la production de cellules sanguines qui apparaissent comme des cellules rondes réfractiles attaché de manière lâche aux cellules endotheliales planes sous-jacents. Ces cellules prolifèrent activement à former de petits agrégats, et finalement se détacher et flotteur (Figures 2A et 3A). Cellules sanguines vivantes peuvent être distingués visuellement des cellules mortes et mourantes en fonction de leur capacité à réfléchir la lumière et se développer dans des conditions de culture. </li></ol> 5. Analyse des Hemogenic endothélium (HE) stade de différenciation. <ol><li> Détecter la formation de SE entre les jours 3 et 4 de différenciation par l&#39;observation microscopique des cellules ayant une morphologie endothéliale. Il n&#39;y a pas de globules flottants dans la culture à ce stade de différenciation. La présence de SE peut être confirmée par coloration immunofluorescence et de débit analyse cytométrique en utilisant des anticorps VE-cadhérine, CD73, CD226 et CD43. <ol><li> Pour évaluer la formation HE par les cellules de l&#39;utilisation de l&#39;analyse de cytométrie en flux au jour 3et quatre jours d&#39;une expérience. Recueillir les cellules par incubation de cultures avec commercial réactif de dissociation cellulaire (voir tableau 1) pendant 5-10 min à 37 ° C, 5% CO 2 et ensuite utiliser jusqu&#39;à 1 x 10 5 cellules par réaction de coloration (cytométrie de flux procédure de coloration décrit dans 12). REMARQUE: VE-cadhérine + HE cellules acquièrent expression de début hématopoïétique marqueur CD226, mais manque l&#39;expression de CD73 et CD43 6. En revanche, les cellules ES non-expriment CD73 (figures 2B, 3B). </li></ol></li><li> Immunofluorescence pour HE HPSC dérivés. <ol><li> Laver la monocouche attachée de cellules avec un tampon phosphate salin (PBS) et fixer ensuite les cellules dans du paraformaldéhyde 4% entre 30 et 60 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules à nouveau avec du PBS puis perméabilisent utilisant 0,1% de Triton X-100 dans du PBS pendant 20 min à température ambiante. </li><li> Laver les cellules dans du PBS à deux trois fois, puis incuber àun tampon de blocage consistant en PBS avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS), de 30 à 120 min. </li><li> Préparer la solution de coloration, contenant à la fois des anticorps primaires (1: 1000 dilution) de souris CD43 anti-humain de lapin et anti-VE-cadhérine humaines dans du PBS avec 5% de FBS, (tableau 1). </li><li> Aspirer le tampon de blocage à partir des cellules et ajouter 1 ml par puits de tampon de coloration avec les anticorps primaires a été ajoutée; incuber 3 heures à température ambiante, ou une nuit à 4 ° C. </li><li> Laver les cellules trois fois en ajoutant 2 ml de PBS avec 5% de FBS. </li><li> Préparer un deuxième tampon de coloration, contenant des anticorps secondaires à dilution 1: 500 dans du PBS avec 5% de FBS: âne anti-lapin conjugué à un colorant fluorescent vert, et anti-souris conjugué à un colorant fluorescent rouge (Tableau 1). Ajouter 1 ml par puits de tampon de coloration secondaire et incuber à température ambiante pendant 1 heure. </li><li> Laver trois fois avec du PBS sans sérum. Cellules tache avec une solution 300 nM DAPI travail en DH2 O pendant 10-15 min. </li><li> Laver les cellules avec du PBS deux fois et ajouter 2-3 ml de PBS dans le puits avec des cellules colorées. Observer la fluorescence avec des filtres de microscope vert, rouge et bleu. </li></ol></li></ol> 6. Analyse des précurseurs hématopoïétiques induits <ol><li> Maintenir des cultures de cellules flottantes jusqu&#39;à ce que la différenciation se dilatent de manière significative, jusqu&#39;à 10-14 jours, en changeant la moitié de la 3F-moyen, tel que décrit au paragraphe 3.1, tous les deux jours. </li><li> Dissociation de différenciation et de recueillir des monocouches de cellules par traitement de cellules avec un réactif de dissociation cellulaire du commerce (voir tableau 1) pendant 5-10 min à 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Effectuer cytométrie de flux utilisant des anticorps anti-VE-cadhérine, anticorps CD43 et CD45 pour évaluer l&#39;hématopoïèse dans les cultures 12. Notez qu&#39;une fraction importante de cellules, jusqu&#39;à 40% des cellules ETV2 et GATA2 transduites, co-exprime VE-CAD et CD43. Les anticorps suivants peuvent être utilisés pour détecter des lignées cellulaires spécifiques suivantes eXpansion ou la différenciation des progéniteurs sanguins induites: CD235a (cellules érythroïdes), CD41a (mégacaryocytes), CD32 (tous les types de cellules myéloïdes), CD66b (neutrophiles) et CD163 (macrophages). </li><li> Effectuer CFC-dosage clonogénique en utilisant un milieu commercial (Tableau 1) selon les instructions du fabricant. <ol><li> Transfert 1-2 x 10 4 cellules dans 3 ml de milieu donogene commerciale (voir tableau 3) pour évaluer le nombre de cellules et de types de colonies hématopoïétiques formant colonie. Densité d&#39;ensemencement optimale permet l&#39;identification et l&#39;isolement de colonies uniques qui se développent indépendamment les uns des autres et ne se chevauchent pas. La densité de semis peut varier entre les expériences en fonction de l&#39;efficacité de différenciation, mais ne devrait pas dépasser 1 x 10 4 cellules par 1 ml de milieu donogene commerciale. </li><li> Mélanger cellules dans un milieu donogene commerciale par tourbillonnement doux, et transférer 3 ml de suspension à deux 35 mm des plats ultra-faible attachementpour le dosage de CFC, 1,5 ml de suspension à chaque plat. Distribuer uniformément milieu et incuber à 37 ° C, 5% CO 2 pendant 14 jours. Éviter de perturber les plats; observer la formation de colonies sur les jours 7 et 10 de dosage. </li><li> Identifier et compter les colonies hématopoïétiques selon leurs morphologies sur 14 jours. </li></ol></li></ol>

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</ol>

IS est un actionnaire fondateur et consultant pour Cynata.

La méthode décrite ci-dessus pour la différenciation hématopoïétique de hPSCs par la surexpression de TFS, représente une approche rapide et efficace pour la génération de SE et myéloïdes et erytho-magakaryocytic progéniteurs de CSEh et CSPi, permettant ainsi la production de jusqu&#39;à 30 millions de cellules de sang de un million de cellules souches pluripotentes 10. Cette méthode présentait différenciation cohérente dans de multiples lignées de CSEh et CISP 10. Au cours de la différenciation pa...

La capacité unique de cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) d&#39;auto-renouvellement et de se différencier en cellules des trois feuillets embryonnaires, y compris le sang, faire un outil précieux pour les études mécanistiques de développement hématopoïétique, la modélisation des maladies du sang, le dépistage des drogues, Les études de toxicité et le développement de thérapies cellulaires. Parce que la formation du sang dans l&#39;embryon produit à partir de l&#39;endothélium hemogenic (HE) à travers une transition hématopoïétique endothéliale 1,2, la génération de SE dans les cultures serait essentiel d&#39;étudier les mécanismes moléculaires régulant l&#39;endothélium à la transition hématopoïétiques et la spécification hématopoïétique. Les méthodes actuelles pour les études de SE sont basés sur l&#39;induction de la différenciation dans les agrégats hematoendothelial (EBS) avec l&#39;ajout de cytokines hématopoïétiques 3-5, et de co-culture avec des cellules hPSCs stromales hématopoïèse-6,7 de soutien ou dans des cultures en deux dimensions avec extracellulaire et c matricesytokines 8,9. Ces méthodes classiques de différenciation sont basées sur l&#39;introduction de signaux externes agissant à la surface de la cellule et d&#39;initier des cascades de voies moléculaires qui conduisent finalement à l&#39;activation du programme de transcription orienter le développement hematoendothelial. Ainsi, l&#39;efficacité de hPSCs différenciations dans ces systèmes repose sur une induction efficace de ces signaux, la transduction du signal vers le noyau, et l&#39;activation résultant de régulateurs transcriptionnels spécifiques. En outre, l&#39;étude de SE dans les cultures de différenciation classiques nécessite l&#39;étape supplémentaire consistant à isoler des cellules SE en utilisant le tri de cellules. Ici, nous décrivons un protocole simple pour l&#39;induction directe de SE et de sang par la surexpression de facteurs de transcription hématopoïétiques. Cette méthode permet l&#39;induction efficace de SE dans un plat et l&#39;observation directe de l&#39;endothélium à la transition hématopoïétique, sans la nécessité pour l&#39;isolation des SE en utilisant une procédure de tri cellulaire encombrant. Formation de SE et de sang à partir de cellules souches pluripotentes humaines peuvent être efficacement induites par la surexpression seulement quelques facteurs de transcription (FT). La combinaison optimale de TFS capables d&#39;induire robuste hématopoïèse pan-myéloïde de hPSCs comprend ETV2 et GATA1 ou GATA2. En revanche, la combinaison de GATA2 et TAL1 induit erythromegakaryocytopoiesis 10. Programmation hPSCs par la surexpression de ces facteurs différencie hPSCs directement à la VE-cad + CD43 - CD73 - HE cellules qui acquièrent progressivement le phénotype hématopoïétique défini par l&#39;expression du début hématopoïétiques CD43 marqueur 7. Cette méthode basée lentivirus pour la programmation directe de pluripotentes méthode des cellules souches humaines est applicable pour la génération de SE et de cellules sanguines pour des études mécanistes, des études de l&#39;endothélium à la transition hématopoïétique, et la régulation transcriptionnelle du développement hématopoïétique et la spécification. Bien que le cprotocole de dusyst décrit la production de sang en utilisant une expression constitutive des transgènes, des résultats similaires pourraient être obtenus en utilisant l&#39;ARNm modifié 10.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Table 1. Induction de la différenciation des hPSCs avec des facteurs de transcription et analyse de l’endothélium hémogénique et des cellules sanguines.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-ETV2-IRES-Puro&nbsp ;</td><td>Addgene</td><td>Plasmide #61061</td><td>Vecteur lentiviral</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA2-IRES-Puro&nbsp ;</td><td>Addgene</td><td>Plasmide #61063</td><td>Vecteur lentiviral</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro&nbsp ;</td><td>Addgene</td><td>Plasmide #61062</td><td>Vecteur lentiviral</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-TAL1-IRES-Puro&nbsp ;</td><td>Addgene</td><td>Plasmide #61062</td><td>Vecteur lentiviral</td></tr><tr><td>pSIN4-EF1a-LMO2-IRES-Puro&nbsp ;</td><td>Addgene</td><td>Plasmid #61064</td><td>Vecteur lentiviral</td></tr><tr><td>Bromure d’hexadiméthrine (Polybrene)&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689-10G</td><td>Polymère cationique utilisé pour augmenter l’efficacité de l’infection</td></tr><tr><td>Y-27632 (dichlorhydrate) Inhibiteur de ROCK</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td>Inhibiteur de la voie RHO/ROCK Inhibe ROCK</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/ stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>A11105-01</td><td>Réactif</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> de dissociation cellulaire <tr><td>Milieu de culture incomplet (sans facteur de croissance)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; mTeSR1 Formulation personnalisée&nbsp ;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>MCF</td><td><a name="RANGE ! D12">Milieu mTeSR1 sans sérum sans bFGF ni TGFb&nbsp ; </a></td></tr><tr><td>humain SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>Maître TPO humain</td><td>Premium Peprotech</td><td>300-18</td><td>Grade</td></tr><tr><td>recherche FGF-basic</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Qualité Premium</td></tr><tr><td>CD144 (VE-cad) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>560411</td><td>Marqueur endothélial (FACS)</td></tr><tr><td>CD226 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>338305</td><td>Hématopoïétique ( FACS)</td></tr><tr><td>CD43 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560199</td><td>Hématopoïétique (FACS)</td></tr><tr><td>CD73 APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB5795A</td><td>Marqueur endothélial (FACS)</td></tr><tr><td>CD45 APC</td><td>BD Biosciences 555485</td><td></td><td>Hématopoïétique (FACS)</td></tr><tr><td>7AAD</td><td>Life Technologies</td><td>A1310</td><td>Essai vivant/mort (FACS)</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148-500G</td><td>Fixation cellulaire</td></tr><tr><td>Triton X-100&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9284-500ML&nbsp ;</td><td>Perméabilisation&nbsp ;</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003</td><td>Sérum fœtal bovin</td></tr><tr><td>Souris anti-humain CD43</td><td>BD Biosciences</td><td>551457</td><td>Pure, anticorps primaire pour la coloration par immunofluorescence (IF)</td></tr><tr><td>Lapin anti-cadhérine humaine VE-cadhérine</td><td>BenderMedSystem</td><td>BMS158</td><td>Primaire (IF)</td></tr><tr><td>Anti-lapin Alexa Fluor 488-conjugué</td><td>JacksonResearch</td><td>715-486-152</td><td>Secondaire (IF)</td></tr><tr><td>Anti-souris Alexa Fluor 594-conjugué</td><td>JacksonResearch</td><td>715-516-150&nbsp ;</td><td>Secondaire (IF)</td></tr><tr><td>Coloration à l’acide nucléique DAPI</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>D1306&nbsp ;</td><td>Essai vivant/mort (IF)</td></tr><tr><td>Milieu clonogénique MethoCult H4435 Enriched</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>4435</td><td>CFC-assay</td></tr><tr><td>Wright Stain solution</td><td>Sigma -Aldrich</td><td>32857</td><td>Coloration des cytospins</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 2. hPSCs culture.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs)&nbsp ;</td><td>WiCell Research Institute (Madison, WI)</td><td>hESCs (WA01, WA09) Cellules souches embryonnaires humaines ; iPSC (DF-19-9-7T, DF-4-3-7T) Cellules souches pluripotentes induites sans transgène</td> Les <td>hPSC sont capables de s’auto-renouveler et de se différencier en cellules de trois couches germinales</td></tr><tr><td>Milieu complet sans sérum pour la culture de hPSC&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; mTeSR1 media&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Institut de recherche WiCell (Madison, WI)</td><td>M500&nbsp ;</td><td>Milieu sans sérum avec facteurs de croissance pour la culture sans nourrissage d’ESC/iPSC</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>BD Biosciences/ Corning&nbsp ;</td><td>356234</td><td>Matrice pour l’entretien des ESC/IPSC humains</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, poudre&nbsp ;</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>12500-062</td><td>Milieu de Base&nbsp ;</td></tr><tr><td>HyClone Dulbecco’s PBS poudre</td><td>Fisher Scientific</td><td>dSH30013.04</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Dispase II, powder</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/stem-cell-research/stem-cell-culture/stem-cell-research-misc/stempro-accutase.html">Life Technologies</a></td><td>17105-041</td><td>Protéase neutre, Dissociation cellulaire</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Table 3. Amorces pour la détection de l’intégration génomique du virus.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Nom de l’abécédaire</td><td><fort>avant (avant)&nbsp ; 5' -->3' </td><td>Reverse (Rev) 5'-->3' </td><td>Discription&nbsp ; </td></tr><tr><td>pSIN EF1a Fwd</td><td>TTC CAT TTC AGG TGT CGT GA-</td><td>-</td><td>EF1a séquence promotrice</td></tr><tr><td>GATA1 Rev</td><td>--</td><td>TCC CTG TAG TAG GCC AGT GC</td><td>&nbsp ; Région de codage&nbsp ;</td></tr><tr><td>GATA2 Rev</td><td>--</td><td>GGT TGG CAT AGT AGG GGT TG&</td><td>NBSP ; Région de codage&nbsp ;</td></tr><tr><td>TAL1 Rev</td><td>--AGG</td> <td>CGG AGG ATC TCA TTC TT</td><td>&nbsp ; Région de codage&nbsp ;</td></tr><tr><td>LMO2 Rev</td><td>--</td><td>GGC CCA GTT TGT AGA GGC</td><td>&nbsp ; Région de codage&nbsp ;</td></tr><tr><td>ETV2 Rev</td><td>--</td><td>GAA CTT CTG GGT GCA GTA AC&nbsp ;</td><td>&nbsp ; Région de codage&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

induction directe de hemogenic endothélium et le sang par la surexpression de facteurs de transcription dans pluripotentes humaines cellules souches

Direct Induction of Hemogenic Endothelium and Blood by Overexpression of Transcription Factors in Human Pluripotent Stem Cells

Au cours du développement, les cellules hématopoïétiques proviennent de un sous-ensemble spécialisé de cellules endothéliales, l&#39;endothélium hemogenic (HE). Modélisation HE développement in vitro est essentiel pour des études mécanistiques de la transition de l&#39;endothélium hématopoïétiques et la spécification hématopoïétique. Ici, nous décrivons un procédé efficace pour l&#39;induction de IL partir de cellules humaines pluripotentes de troncs (hPSCs) au moyen de la surexpression de différents ensembles de facteurs de transcription. La combinaison de ETV2 et GATA1 ou GATA2 TF est utilisé pour induire un potentiel SE pan-myéloïde, tandis qu&#39;une combinaison de GATA2 et des facteurs de transcription TAL1 permet la production de IL avec érythroïde et mégacaryocytaire potentiel. L&#39;ajout de LMO2 à GATA2 et la combinaison TAL1 accélère sensiblement la différenciation érythroïde et augmente et les cellules mégacaryocytaires production. Cette méthode offre un moyen efficace et rapide de SE l&#39;induction de hPSCs et permet l&#39;observation de l&#39;endothélium hematopoietic transition dans une boîte de culture. Le protocole comprend des procédures hPSCs de transduction et l&#39;analyse post-transduction de SE et des progéniteurs sanguins.

Le schéma de SE et l&#39;induction de sang de hPSCs par la surexpression de facteurs de transcription est montré dans la figure 1. ETV2 avec GATA1 ou GATA2 combinaison induit hématopoïèse pan-myéloïde, tandis qu&#39;un GATA2, TAL1 +/- combinaison LMO2 induit hématopoïèse principalement érythro-mégacaryocytaire. Les deux combinaisons de TF directement induites cellules ES qui ont transformé ensuite en progéniteurs sanguins avec un spectre distinct de la différenciation hématopoïétique. D...

Ce protocole décrit l’induction efficace de l’endothélium hémogène et des progéniteurs hématopoïétiques multipotentiels à partir de cellules souches pluripotentes humaines via l’expression forcée de facteurs de transcription.

Induction directe de Hemogenic endothélium et le sang par la surexpression de facteurs de transcription dans pluripotentes humaines Cellules souches

During development, hematopoietic cells arise from a specialized subset of endothelial cells, hemogenic endothelium (HE). Modeling HE development in vitro ...

L'objectif général de cette procédure est de générer des cellules sanguines érythroïdes et myéloïdes à partir de cellules souches pluripotentes humaines par l'expression forcée de facteurs de transcription. Cette méthode s'applique à la génération d'endothélium homogénique dans les cellules sanguines pour des études sur la transition endothéliale vers l'hépo et la régulation transcriptionnelle du développement et de la spécification de l'hépo. Le principal avantage de cette technique est qu'elle offre un moyen inefficace et rapide d'induire un endothélium homogénique à partir de cellules souches préportes humaines, et permet d'observer la transition hémie endothéliale dans une boîte de culture cellulaire.Le Dr Bruske, assistante de recherche dans le laboratoire du Dr Lin, démontrera la procédure. Commencez par revêtir au préalable six plaques à six puits avec une matrice extracellulaire telle que le matrigel, en la diluant conformément aux instructions du fabricant et en la versant dans les puits. Incubez les plaques de 30 à 60 minutes à 37 degrés Celsius pour le milieu de transduction. Préparez d'abord des aliquotes de lentivirus pour chaque jeu de transduction, de sorte que la multiplicité d'infection estimée, ou MOI, du virus par rapport aux cellules, soit d'un virus par cellule, et conservez-les à quatre degrés Celsius.Ensuite, combiner le milieu complet sans sérum pour les virus hbSC poly cerveau à une concentration finale de six microgrammes par millilitre et l'inhibiteur ROCK Y 2 7 6 3 2 à une concentration finale de 10 micromolaire, dans un volume total de 1,3 millilitre pour chaque série de transduction, puis placer les mélanges sur de la glace en vue de la préparation des cellules. Commencer avec un lot sain de cellules souches pluripotentes à 70 % de confluence, environ quatre jours après le dernier passage. Si les cellules souches pluripotentes humaines ont été maintenues sur des couches d'alimentation (maps), elles doivent être transférées en conditions sans cellules nourricières, deux à trois passages avant les expériences de transduction, et doivent représenter des cultures saines de cellules souches pluripotentes.Exempt de différenciation spontanée. Aspirez le milieu des CPSh et ajoutez deux millilitres de solution de détachement enzymatique, comme Accutase, par puits d'une plaque de six puits, puis incubez la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq à sept minutes. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu complet contenant un inhibiteur ROCK à 10 micromolaire et récupérez les cellules détachées.Après avoir préparé une suspension cellulaire homogène, prélevez un petit aliquot et dénombrez les cellules viables par la méthode d'exclusion au bleu de Trypan. Ensuite, centrifugez les cellules à 200 × g pendant cinq minutes et resuspendez le culot dans du milieu complet contenant 10 micromolaire d'inhibiteur ROCK à une concentration finale de 3,4 × 10⁶ cellules vivantes par millilitre. Puis ajoutez 200 microlitres de suspension cellulaire contenant 0,68 × 10⁶ cellules à chacun des milieux de transduction de 1,3 millilitre préparés précédemment.Retirer la plaque à six puits revêtue de matrice de 37 degrés Celsius. Ensuite, aspirer la solution de matrice et transférer chacun des mélanges de transduction dans un puits, puis agiter doucement la plaque pour répartir uniformément les cellules dans le puits. 24 heures.Après la transduction, visualisez les puits au microscope afin de vous assurer qu’au moins 80 % des cellules sont adhérentes. Éliminez la solution virale et lavez les cellules fixées avec du milieu incomplet ne contenant aucun facteur de croissance. Ensuite, ajoutez trois millilitres de milieu supplémenté avec des cytokines, appelé milieu trois F, aux cellules.Incuber les cellules toute la nuit le jour suivant. Changer le milieu par du milieu 3F frais contenant un microgramme par millilitre de puromycine, afin d'éliminer les cellules non transduites résiduelles.Remplacez ce milieu toutes les 24 heures afin d'éliminer les cellules mortes. Après 48 heures de traitement, interrompez l'utilisation de la pur mycine et utilisez uniquement du milieu trois F frais le quatrième jour. Après la transduction, observez les cellules au microscope à la recherche d'agglomérats cellulaires présentant une morphologie endothéliale, afin de déterminer la formation de cellules hémato-endothéliales.Commencez par associer les cellules entre les jours trois et quatre à partir de la boîte de culture avec la solution de détachement cellulaire. Récupérez les cellules détachées dans un milieu complet et centrifugez-les, resuspendez les cellules dans un tampon max à température ambiante et comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, puis incubez une fois 10 à la puissance cinq cellules par réaction de marquage avec des anticorps appropriés pour la détection de la v-catrine, du CD226, du CD73 et du CD43. Marqueurs de surface cellulaire.La cytométrie en flux est décrite dans le protocole écrit à partir du jour quatre. Après la transduction, poursuivre la différenciation des cellules en remplaçant la moitié du milieu de chaque puits toutes les 48 heures ; entre cinq et sept jours, des cellules sanguines rondes apparaîtront, légèrement agrégées et flottant au-dessus de la couche de cellules endothéliales. Maintenir les cultures jusqu'à 14 jours, durant lesquels les cellules en suspension devraient se développer de manière significative.Analyse cytométrique en flux de l'ETV2, de la GATA1 et de l'ETV2. Les cellules transduites avec GATA2 montrent la formation d'un hémendothélium TER1 positif, identifiable par l'expression de CD226 et l'absence d'expression de CD73 entre le jour 3 et le jour 4 de la différenciation. L'analyse cytométrique en flux de l'ETV2, de la GATA1 et de l'ETV2. Les cellules transduites avec GATA2 montrent l'induction de cellules sanguines exprimant CD43 au jour 7.Après la transduction, l'analyse par cytométrie en flux des cellules induites par gata2-TAL1-LMO2 au jour 14 post-transduction montre la formation de cellules sanguines exprimant CD235a et CD41a. Des préparations cytosiniques colorées de cellules hématopoïétiques induites par gata2-TAL1-LMO2 ont révélé des morphologies de cellules érythroïdes, de macrophages et de mégacaryocytes. Dans les tests de formation de colonies cellulaires, la transduction de cellules souches pluripotentes humaines peut être réalisée en moins d'une heure lors de l'exécution de la procédure de transduction. Il est important de toujours prendre en compte la viabilité des cellules souches, d'inclure un inhibiteur de ROCK dans le mélange réactionnel et d'utiliser une quantité optimale de virus par cellule après les trois premiers jours.Après la transduction, des méthodes telles que la coloration immunohistochimique, l'essai de formation de colonies et la cytométrie en flux peuvent être réalisées afin de répondre à des questions concernant l'efficacité de la différenciation et le type de trouble hématologique induit. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de cultiver et d'infecter des cellules souches pluripotentes humaines, ainsi que de ce à quoi s'attendre dans les cultures en cours de différenciation au cours des sept à dix premiers jours. Une fois que les facteurs de transcription ont été correctement introduits dans les cellules souches humaines, les cellules perdent leur pluripotence et s'engagent progressivement vers un destin hématopoïétique.Ainsi, les chercheurs disposeront d'un modèle in vitro pratique pour étudier les mécanismes moléculaires de la transition endothéliale vers hématopoïétique. N'oubliez pas que le travail avec des régions contenant des lentivirus peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d'équipements de protection individuelle et l'élimination appropriée des virus contenant des régions doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette procédure.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Ici, nous montrons un protocole simple et efficace pour la génération de l'homme iPSCs de 3-4 ml de sang périphérique en utilisant un vecteur lentiviral unique reprogrammation. La reprogrammation des cellules sanguines facilement disponibles promet d'accélérer l'utilisation des technologies de l'iPSC en la rendant accessible à une communauté plus large de la recherche.

Génération de l&#39;homme cellules souches pluripotentes induites à partir de sang périphérique en utilisant le vecteur lentiviral STEMCCA

Une méthode a été développée afin de dériver directement des cellules souches neuronales humaines à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques enrichies de cellules du sang périphérique.

Induction directe de neurales humaines cellules souches à partir de cellules progénitrices hématopoïétiques du sang périphérique

Le protocole décrit ici détaille l’induction d’un programme hémogénique dans des fibroblastes embryonnaires de souris via la surexpression d’un ensemble minimal de facteurs de transcription. Cette technologie pourrait être transposée au système humain afin de fournir des plateformes pour l’étude future de l’hématopoïèse, des maladies hématologiques et de la greffe de cellules souches hématopoïétiques.

Reprogrammation fibroblastes embryonnaires de souris avec les facteurs de transcription pour induire un programme Hemogenic

Nous proposons un protocole de reprogrammation des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) en cellules souches pluripotentes induites (iPSC). En plaquant les cellules sanguines transduites sur des plaques recouvertes de matrice avec centrifugation, les iPSC sont induites avec succès à partir de cellules flottantes. Cette technique suggère un protocole de reprogrammation simple et efficace pour des cellules telles que les PBMC et les CBMC.

Induite cellules souches pluripotentes génération de cellules sanguines utilisant Sendai Virus et Centrifugation

Ce protocole décrit une méthode détaillée pour la génération efficace d’iPSC sans intégration à partir de cellules sanguines périphériques humaines adultes. Grâce à l’utilisation de quatre vecteurs épisomaux basés sur oriP/EBNA pour exprimer les facteurs de reprogrammation, KLF4, MYC, BCL-XL ou OCT4 et SOX2, des milliers de colonies d’iPSC peuvent être obtenues à partir de 1 mL de sang périphérique.

Génération d&#39;Intégration-libres induits des cellules souches pluripotentes à partir de cellules mononucléaires sang périphérique humain utilisant épisomique Vecteurs

Nous présentons ici pluripotentes humaines protocoles de culture de cellules souches (hPSC), utilisés pour différencier les hPSCs en CD34+ progéniteurs hématopoïétiques. Cette méthode utilise la manipulation spécifique au stade de canonique WNT de signalisation indiquer les cellules exclusivement pour le programme hématopoïétique de définitif ou primitif.

Réalisé la différenciation des progéniteurs hématopoïétiques primitives et définitif des cellules souches pluripotentes humaines

Ici, nous présentons un protocole pour former précisément l'endothélium hémogène à partir de cellules souches pluripotentes humaines dans une condition sans mangeoire et sans xéno. Cette méthode aura de larges applications dans la modélisation des maladies et le dépistage des composés thérapeutiques.

Différenciation hémogénique de l'endothélium par des cellules souches pluripotentes humaines dans une condition définie sans mangeoire et sans xéno

Ce protocole démontre l'induction d'un programme hémogène dans les fibroblastes dermiques humains par l'expression forcée des facteurs de transcription GATA2, GFI1B et FOS pour produire des cellules hématopoïétiques de tige et d'ancêtre.

Reprogrammation hémogénique des fibroblastes humains par expression forcée des facteurs de transcription

Présenté ici est un protocole simple pour la différenciation dirigée des cellules endothéliales hémogènes à partir de cellules souches pluripotentes humaines en environ 1 semaine.

Différenciation dirigée de cellules endothéliales hémogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Ce protocole décrit la génération de vaisseaux sanguins auto-organisés à partir de cellules souches pluripotentes et pluripotentes induites humaines. Ces réseaux de vaisseaux sanguins présentent un réseau endothélial étendu et connecté entouré de péricytes, d’actine musculaire lisse et d’une membrane basale continue.

Génération d’organoïdes de vaisseaux sanguins humains à partir de cellules souches pluripotentes

Il s’agit d’un flux de travail simple permettant de différencier les cellules endothéliales des cellules souches pluripotentes humaines, suivi d’un protocole détaillé pour leur stimulation mécanique. Cela permet d’étudier la mécanobiologie du développement des cellules endothéliales. Cette approche est compatible avec les dosages en aval de cellules vivantes prélevées sur la puce de culture après stimulation mécanique.

In vitro Modèle de vaisseau humain fœtal sur puce pour étudier la mécanobiologie du développement

Découvrez l'induction d'endothélium hémogénique et de cellules sanguines à partir de cellules souches pluripotentes humaines par surexpression de facteurs de transcription. Cette méthode permet d'étudier la transition endothélio-hématopoïétique in vitro.

Induction directe de Hemogenic endothélium et le sang par la surexpression de facteurs de transcription dans pluripotentes humaines Cellules souches (Vidéo) | JoVE Journal

Induction directe de Hemogenic endothélium et le sang par la surexpression de facteurs de transcription dans pluripotentes humaines Cellules souches

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