Induction directe de Hemogenic endothélium et le sang par la surexpression de facteurs de transcription dans pluripotentes humaines Cellules souches

L’objectif global de cette procédure est de générer des cellules sanguines érythroïdes et myéloïdes à partir de cellules souches pluripotentes humaines par expression forcée de facteurs de transcription. Cette méthode est applicable à la génération d’endothélium homogène dans les cellules sanguines pour l’étude de la transition endothéliale à l’hépo et la régulation transcriptionnelle du développement et de la spécification de l’hépo. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit des moyens inefficaces et rapides d’induction endothéliale homogène à partir de cellules souches humaines et permet d’observer la transition de l’hémie endothéliale dans une boîte de culture cellulaire.

Le Dr Bruske, assistant de recherche dans le laboratoire du Dr Lin, fera une démonstration de la procédure Avant de commencer la précochromie de six plaques murales avec une matrice extracellulaire telle qu’un gel mat en la diluant selon les instructions du fabricant et en la versant dans les puits. Incuber les plaques pendant 30 à 60 minutes à 37 degrés Celsius pour le milieu de transduction. Tout d’abord, préparez des aliquotes lentivirales pour chaque ensemble de transduction de sorte que la multiplicité estimée de l’infection ou du MOI du virus par rapport aux cellules soit d’un virus par cellule et maintenez-les à quatre degrés Celsius.

Ensuite, combinez un milieu complet sans sérum pour les virus hbsc poly brain à une concentration finale de six microgrammes par millilitre et l’inhibiteur de roche Y 2 7 6 3 2 à une concentration finale de 10 micromolaires dans un volume total de 1,3 millilitres pour chaque ensemble de transduction et réglez les mélanges sur de la glace pour préparer les cellules. Commencez avec un lot sain de cellules souches pluripotentes à 70 % de confluence environ quatre jours après le dernier passage. Si les cellules souches pluripotentes humaines ont été conservées sur des cartes, elles doivent être transférées dans des conditions exemptes de nourrisseur, deux à trois passages avant les expériences de transduction, et représenter des cultures de cellules souches pluripotentes saines.

Libre de différenciation spontanée. Aspirez le milieu HPSC et ajoutez deux millilitres de solutions de détachement de sel telles que Accutane par puits d’une plaque à six puits incubant la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq à sept minutes. Ajoutez ensuite deux millilitres de milieu complet avec 10 inhibiteurs de roche micromolaires et collectez les cellules détachées.

Après avoir préparé une suspension cellulaire homogène, prélever une petite aliquote et compter les cellules viables par la méthode d’exclusion du bleu de Trian. Ensuite, centrifugez les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes et remettez la pastille en suspension dans un milieu complet avec 10 inhibiteurs de roche micromolaires à une concentration finale de 3,4 fois 10 pour les six cellules vivantes par millilitre. Ajoutez ensuite 200 microlitres de suspension cellulaire contenant 0,68 fois 10 aux six cellules de chacune des 1,3 millilitres de milieu de transduction préparé précédemment.

Retirez la plaque murale à six revêtue de matrice de 37 à degrés Celsius. Ensuite, aspirez la solution matricielle et transférez chacun des mélanges de transduction dans un puits et faites tourner la plaque pour répartir uniformément les cellules dans le puits. 24 heures sur 24.

Après la transduction, visualisez les puits au microscope pour vous assurer qu’au moins 80 % des cellules sont adhérentes. Jetez la solution virale et lavez les cellules attachées avec un milieu incomplet sans aucun facteur de croissance. Ensuite, ajoutez trois millilitres du milieu complété par des cytokines appelées trois F.Medium aux cellules.

Incuber les cellules pendant la nuit le lendemain. Changez le milieu avec du milieu frais à trois F contenant un microgramme par millilitre de mycine pure. Pour éliminer les cellules résiduelles non transduites.

Remplacez ce milieu toutes les 24 heures pour éliminer les cellules mortes. Après 48 heures de traitement, arrêtez la mycine pure et n’utilisez que du milieu frais à trois F le quatrième jour. Après la transduction, observez les cellules au microscope pour détecter l’apparition de cellules groupées avec une morphologie endothéliale afin de déterminer la formation des cellules hémo-endothéliales.

Associez d’abord les cellules entre les trois ou quatre jours de la boîte de culture avec la solution de détachement cellulaire. Collectez les cellules détachées dans un milieu complet et centrifugez-les, remettez les cellules en suspension dans un tampon maximum à température ambiante et comptez les cellules dans un hémocytomètre, puis incubez une fois 10 à la cinquième cellules par réaction de coloration avec des anticorps appropriés pour la détection de la catrinité v, CD 2 26, CD 73 et CD 43. Marqueurs de surface cellulaire.

Effectuer une cytométrie en flux est décrit dans le protocole textuel à partir du quatrième jour. Après la transduction, continuez la différenciation des cellules en remplaçant la moitié du milieu de chaque puits, toutes les 48 heures entre cinq et sept jours, les cellules sanguines rondes apparaîtront faiblement agrégées et se refileront au-dessus de la couche de cellules endothéliales. Conservez les cultures jusqu’à 14 jours, période pendant laquelle les cellules flottantes devraient se développer de manière significative.

Analyse cytométrique en flux de l’ETV deux, du gata un et de l’ETV deux. Les cellules transduites de Gata deux montrent la formation d’un endothélium hémo positif à la térine, qui peut être identifié par l’expression de CD 2 26 et l’absence d’expression de CD 73 au troisième ou au quatrième jour de l’analyse cytométrique en flux de différenciation de l’ETV deux, du gata un et de l’ETV deux. Gata deux cellules transduites montre l’induction de cellules sanguines exprimant le CD 43 au septième jour.

Après la transduction, l’analyse cytométrique en flux de gata deux, TAL, un LMO, deux cellules induites le 14e jour après la transduction montre la formation de cellules sanguines exprimant CD 2, 35 A et CD 41 A, des préparations cytosines colorées à droite de gata deux, TAL, un LMO, deux cellules hématopoïétiques induites ont montré des morphologies de cellules érythroïdes, macrophages érythroïdes et méga cario-acides dans des essais de cellules formant des colonies. La transduction des cellules souches pluripotentes humaines peut être effectuée en moins d’une heure lors de la procédure de transduction. Il est important de tenir compte de la viabilité des cellules souches, de toujours inclure un inhibiteur de roche dans le mélange réactionnel et d’utiliser une quantité optimale de virus par cellule après les trois premiers jours.

Après la transduction, des méthodes telles que l’immuno-marquage, la formation du côlon et la cytométrie en flux peuvent être effectuées afin de répondre aux questions sur l’efficacité de la différenciation et le type de maladie hématoïde induite. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’infecter et d’infecter les cellules souches pluripotentes humaines et de ce à quoi vous pouvez vous attendre en différenciant les cultures dans les sept à dix premiers jours. Une fois que les facteurs de transcription ont été administrés avec succès dans les cellules souches humaines, les cellules perdent leur puissance et s’engagent progressivement dans un destin hématopoïétique.

Ainsi, les chercheurs disposeront d’un modèle in vitro pratique pour étudier les mécanismes moléculaires de la transition endothéliale à hématopoïétique. N’oubliez pas que travailler avec des régions contenant des lentivirus peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’un équipement de protection individuelle et l’élimination appropriée des régions contenant des virus doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.