Name: Un rendement élevé et Expression System coût-efficace de granzymes humain dans des cellules de mammifères (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Découvrez une méthode efficace pour produire des granzymes humains glycosylés et actifs dans des cellules HEK293T. Ce protocole optimise le rendement et réduit les coûts pour la recherche en immunologie.

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Ce travail a été soutenu par des subventions de la Fondation Novartis pour la recherche médico-biologique et du Pool de recherche de l’Université de Fribourg (à MW). Nous remercions Li Zhao, Zhan Xu et Solange Kharoubi Hess pour leur soutien technique, ainsi que Radu Aricescu et Yvonne Jones (Université d’Oxford, Royaume-Uni) pour avoir fourni le plasmide pHLsec, et Thomas Schürpf (Harvard Medical School) pour les discussions utiles.

1. Production du plasmide d&#39;expression pHLsec-GZM <ol><li> Préparation de l&#39;ARN total à partir de cellules NK humaines (cellules primaires préparées comme dans 26 ou la lignée de cellules NK NK-92 exprimant les cinq Gzms humaines) en utilisant un procédé d&#39;isolement d&#39;ARN appropriée et transcription inverse en utilisant un premier brin kit ADNc de synthétiser la suite de la manufacturer` s recommandations. Amplifier GZM ADNc par PCR et clone dans pHLsec comme décrit dans 23 (don genre de Radu Aricescu et Yvonne Jones, Université d&#39;Oxford, Royaume-Uni) en utilisant les sites Agel et Kpnl (Figure 1). REMARQUE: Utilisez les amorces suivantes indiquées dans le tableau 1. </li><li> Confirmez inserts correctes par séquençage. Développez les plasmides d&#39;expression dans des cellules DH5a et purifier en utilisant un kit d&#39;isolement de plasmide libre endotoxine et suivez les instructions du fabricant. </li><li> Reprendre les plasmides purifiés dans de l&#39;eau stérile sans endotoxine à une concentration de 2 mg / ml et conserver à -20 ° C until utilisation. </li></ol> 2. Expression de Gzms dans des cellules HEK293T <ol><li> Préparation des réactifs <ol><li> Préparer le milieu de culture standard. Pour milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant taux élevé de glucose (25 mM), Glutamax (4 mM), du pyruvate de sodium (1 mM) ajouter 10% de sérum standard de veau foetal (FCS), la pénicilline (100 unités / ml), la streptomycine ( 100 ug / ml). </li><li> Préparer milieu de transfection. Pour milieu de culture sans pénicilline-streptomycine ajouter 25 pg / ml chloroquine (ajouter fraîchement sur le jour de la transfection de 1,000x stocks dans PBS, stockés à -20 ° C). </li><li> Préparer un milieu de culture exempt de sérum: A un milieu sans sérum pour cellules HEK293 ajouter de la glutamine (4 mM), de la pénicilline (100 unités / ml), streptomycine (100 ug / ml), et 2,5 mg / L de l&#39;amphotéricine B. </li><li> Préparer les solutions décrites dans le tableau 2 et le filtre avec un filtre de 0,45 um avant utilisation: </li></ol></li><li> Expansion des cellules HEK293T <ol><li> Cultiver les cellules HEK293T dans 20 ml culteSupport d&#39;ure utilisant 150 x 25 mm boîtes de culture de tissu. </li><li> Cellules Split à 80% de confluence (split-ratio de 1: 4, généralement tous les 3 ème jour). Cellules attachent vaguement, ils peuvent être détachés mécaniquement sans traitement à la trypsine par pipetage rigoureusement haut et en bas. </li><li> cellules de la plaque avant la transfection nuit pour donner 60 à 70% de confluence au jour de la transfection (densité d&#39;ensemencement ~ 2 x 10 5 cellules / ml). Une taille de la préparation habituelle consiste de 20 à 25 boîtes de culture. </li></ol></li><li> La transfection au phosphate de calcium <ol><li> 1 h avant la transfection, remplacer le milieu de culture standard à 20 ml de milieu de transfection. Près de la fin de cette étape d&#39;incubation de 1 heure, mélanger 400 ug d&#39;ADN plasmidique avec 10,95 ml ddH 2 0 et 1,55 ml de 2M CaCl2 en tubes de 50 ml (1 tube / 5 plats). </li><li> 1 à 2 min avant la transfection, ajouter 12,5 ml 2x HBS à 12,5 ml de la solution ADN-Calcium, mélanger par inversion des tubes et incuber pendant 30 secondes à la température ambiante. </li><li> Ajouter èmee mélange préparé en 2.3.2 directement aux cellules (5 ml par boîte), goutte à goutte dans le milieu. Saupoudrer uniformément sur toute la surface, en tournant le support à une couleur légèrement orangée. </li><li> Incuber les boîtes de culture de 7 à 11 h dans un incubateur de culture de tissu (37 ° C, 5% de CO2 dans de l&#39;air humidifié). Après l&#39;incubation, une amende précipité est visible. Retirez le milieu de transfection, rincer soigneusement préchauffé PBS et ajouter 20 ml de milieu de culture sans sérum préparé à 2.1.3. Incuber pendant 72 heures dans un incubateur de culture de tissu. </li><li> Analyser l&#39;efficacité de transfection et l&#39;expression par l&#39;exécution d&#39;un échantillon (~ 20 ul) du surnageant de cellule sur SDS-PAGE et coloration avec du bleu brillant de Coomassie pour visualiser une bande de granzyme. </li></ol></li><li> Purification de Gzms de surnageant de culture par Nickel-IMAC <ol><li> Après l&#39;incubation, décanter le surnageant de culture de cellules dans 250 ml tubes et claire par centrifugation. Effectuer une première rotation (400 xg, 10 min, 4 °C) qui va effacer le milieu à partir des cellules individuelles. Transférer le surnageant dans fraîches 250 ml tubes et tournent à 4000 g, 30 min à 4 ° C pour éliminer les débris de cellules restant. </li><li> Ajouter 5 ml de NaCl 5 M, 6,25 ml de 2 M de Tris-Base (pH 8) et 1 ml de 0,25 M NiSO 4 par 250 ml de surnageant clarifié. Filtrer le surnageant à l&#39;aide d&#39;une unité de filtration sous vide de 500 ml (0,45 mm). </li><li> Equilibrer une colonne nickel-IMAC avec Sa liaison tampon A (10 volumes de colonne, CV) en utilisant un système FPLC approprié. </li><li> Appliquer le surnageant clarifié à la colonne équilibrée à un débit de 0,5 ml / min à 4 ° C. </li><li> Après le surnageant a été appliqué, colonne de lavage avec Sa liaison tampon jusqu&#39;à ce que l&#39;absorbance UV de référence est atteint (généralement 10 CV). </li><li> Gzms éluées avec un gradient de 20 ml-linéaire (0 à 250 mM imidazole) à un débit de 0,5 ml / min tout en recueillant des fractions de 2 ml. Analyser les fractions d&#39;élution par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie. </li></ol></li><li> Enterokinase (EK)le traitement et le nettoyage final par Chromatographie d&#39;échange de cations <ol><li> Piscine GZM fractions contenant dans un tube de dialyse MWCO avec ≤10. Stocker un petit échantillon à -20 ° C que le contrôle pré-EK. </li><li> Ajouter EK à 0,02 unité / ml de 50 surnageant initial directement à la fraction groupée dans le tube de dialyse et dialyse O / N (au moins 16 heures) à la température ambiante dans EK-tampon (4 L, le changement tampon une fois). </li><li> Le lendemain, analyser EK Gzms traitée par rapport à la pré-EK contrôle par SDS-PAGE et coloration au bleu de Coomassie. </li><li> Lorsque le traitement N-terminal est terminée, modifier un tampon de dialyse à tampon A S (4 L) et on dialyse pendant 4 heures à température ambiante. Filtre dialysat (0,45 um). </li><li> Équilibrer une colonne S-S avec du tampon de l&#39;échantillon A. charger sur la colonne avec à un débit de 0,5 ml / min à 4 ° C. </li><li> Après chargement de l&#39;échantillon, laver la colonne avec le tampon de S A jusqu&#39;à ce que la ligne de base UV absorbance est atteint (environ 10 CV). Éluer les Gzms avec un gradient linéaire de 30 ml (150 à 1 000 mM de NaCl). GZMA eluths à ~ 650 mM de NaCl, GZMB à ~ 700 mM de NaCl et GzmM à ~ 750 mM de NaCl. </li><li> Analyser élution fractions par SDS-PAGE et essais colorimétriques (voir ci-dessous). Piscine fractions contenant Gzms et concentré (environ 30 fois, à une concentration d&#39;environ 100 pM) dans les filtres de rotation (15 ml, 10 MWCO). Aliquoter les préparatifs GZM concentrés et conserver à -80 ° C. </li></ol></li></ol> 3. Test de l&#39;activité GZM <ol><li> Préparation des réactifs <ol><li> Préparer le tampon de dosage colorimétrique: 50 mM de Tris-Base, pH 7. <ol><li> Pour la mesure de GZMA, ajouter Na-CBZ-L-Lysine thiobenzyle ester (S-Bzl) (BLT) pour le tampon d&#39;essai à une concentration finale de 0,2 mM et 5,5&#39;-dithio-bis (acide 2-nitrobenzoïque) (DTNB) à une concentration de 0,22 mM. Pour GZMB, inclure 0,2 mM Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD) et 0,22 mM DTNB. Pour GzmM, y compris 0,2 mM de Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (pNA) (AAPL). Les peptides synthétiques sont ajoutés à partir de solutions d&#39;achat d&#39;actions appropriées (dans le DMSO, stored à -20 ° C) dans la mémoire tampon fraîchement avant l&#39;essai. </li></ol></li><li> Préparer le tampon de dosage de clivage: 100 mM de NaCl, 50 mM de Tris-Base, pH 7,5 </li></ol></li><li> Dosages colorimétriques <ol><li> Distribuez de petits échantillons GZM (&lt;5 pi) de fractions d&#39;élution ou des stocks concentrés dans les plaques à 96 puits à fond plat. Inclure un contrôle positif (GZM préparations testées ou brut lysats de cellules NK) et un contrôle négatif (tampon seulement). </li><li> Ajouter 100 ul de tampon de dosage à chaque puits (à l&#39;aide d&#39;une pipette multi-canaux). Incuber pendant 10 min à 37 ° C. Mesurer la DO à 405 nm dans un lecteur de microplaques. </li></ol></li><li> Dosage Décolleté <ol><li> Pour les essais de clivage à l&#39;aide de substrats purifiés, co-incuber un substrat protéique (native ou recombinante, de 100 à 400 nM; quelques exemples de substrats de GZM efficaces sont présentés dans la section de résultat et à la note à la fin de cette section) avec des dilutions en série d&#39;un GZM (à partir de 400 nM) dans du tampon analytique pour différents moments.Analyse par SDS-PAGE et coloration à l&#39;argent ou au bleu de Coomassie; ou par Western blot en utilisant des anticorps spécifiques. </li><li> Pour les essais de clivage à l&#39;aide de lysats de cellules, de suspendre 10 6 cellules HeLa (ou toute lignée cellulaire de tumeur disponible) dans 1 ml de tampon de dosage et lyse par congélation dans un / bain de glace sèche de l&#39;éthanol et décongélation à 37 ° C trois fois. Éliminer les débris cellulaires par centrifugation (15 000 xg pendant 10 min à 4 ° C). </li><li> Co-incuber le lysat clarifié avec Gzms à diverses concentrations et heures ci-dessus. Le clivage est détecté par immunotransfert en utilisant des anticorps appropriés. NOTE: Quelques exemples de substrats de bonne foi pour laquelle les anticorps commerciaux sont disponibles: Offre (BH3-interaction agoniste domaine de mort) et de la caspase 3 clivée par GZMB 27,28; plusieurs ribonucléoprotéines nucléaires hétérogènes (hnRNPA1, A2 et U) clivées par GZMA 29; cytomégalovirus phosphoprotéine 71 par GzmM 30. </li></ol></li></ol>

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<li>Thiery, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin+pores+in+the+endosomal+membrane+trigger+the+release+of+endocytosed+granzyme+B+into+the+cytosol+of+target+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Perforin pores in the endosomal membrane trigger the release of endocytosed granzyme B into the cytosol of target cells.</a> Nat Immunol. 12, 770-777 (2011).</li>
<li>Thomas, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leukocyte+protease+binding+to+nucleic+acids+promotes+nuclear+localization+and+cleavage+of+nucleic+acid+binding+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Leukocyte protease binding to nucleic acids promotes nuclear localization and cleavage of nucleic acid binding proteins.</a> J Immunol. 192, 5390-5397 (2014).</li>
<li>Jacquemin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Granzyme+B-induced+mitochondrial+ROS+are+required+for+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+death+and+differentiation%22%5BJournal%5D)">Granzyme B-induced mitochondrial ROS are required for apoptosis.</a> Cell death and differentiation. , (2014).</li>
<li>Kummer, J. A., Kamp, A. M., Citarella, F., Horrevoets, A. J., Hack, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+human+recombinant+granzyme+A+zymogen+and+its+activation+by+the+cysteine+proteinase+cathepsin+C%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Expression of human recombinant granzyme A zymogen and its activation by the cysteine proteinase cathepsin C.</a> The Journal of biological chemistry. 271, 9281-9286 (1996).</li>
<li>Hagn, M., Sutton, V. R., Trapani, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+that+specifically+measures+Granzyme+B+proteolytic+activity%3A+hydrolysis+of+Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments+%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay that specifically measures Granzyme B proteolytic activity: hydrolysis of Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e52419(2014).</li>
<li>Huang, M. T., Gorman, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intervening+sequences+increase+efficiency+of+RNA+3%27+processing+and+accumulation+of+cytoplasmic+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Intervening sequences increase efficiency of RNA 3' processing and accumulation of cytoplasmic RNA.</a> Nucleic Acids Res. 18, 937-947 (1990).</li>
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<li>Magee, A. I., Grant, D. A., Hermon-Taylor, J., Offord, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+one-stage+method+for+assay+of+enterokinase+activity+by+release+of+radiolabelled+activation+peptides+from+alpha-N-%5B3H%5Dacetyl-trypsinogen+and+the+effect+of+calcium+ions+on+the+enzyme+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Specific one-stage method for assay of enterokinase activity by release of radiolabelled activation peptides from alpha-N-[3H]acetyl-trypsinogen and the effect of calcium ions on the enzyme activity.</a> Biochem J. 197, 239-244 (1981).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le rôle classique et d&#39;études approfondies et de GZMA GZMB est l&#39;induction de l&#39;apoptose dans des cellules de mammifères après leur livraison cytosolique de la protéine formant des pores PFN 1. Récemment, le spectre des Gzms cytotoxique a été élargi de façon significative à partir de cellules de mammifères à 9,10 bactéries, ainsi qu&#39;à 11 certains parasites. En outre, les fonctions, extracellulaires non-classiques de GZMA et GZMB ainsi que la signification biologique des d...

Les Gzms sont une famille de serine proteases homologues fortement localisées dans les lysosomes spécialisées des CTL et les cellules NK 1. Les granules cytotoxiques de ces cellules tueuses contiennent également des protéines de la membrane perturbateurs PFN et GNLY qui sont libérés simultanément avec les Gzms lors de la reconnaissance d&#39;une cellule cible destiné à l&#39;élimination 2,3. Il existe cinq Gzms chez l&#39;homme (GZMA, B, H, K et M), et 10 chez des souris (Gzms GZMA - G, K, M et N). GZMA et GZMB sont les plus abondants et largement étudiés chez l&#39;homme et la souris 1. Cependant, des études plus récentes ont commencé à enquêter sur les voies de mort cellulaire ainsi que les effets biologiques supplémentaires induits par les autres, soi-disant Gzms orphelins de la santé et de la maladie 4. La fonction la plus connue des Gzms, en particulier de GZMA et GZMB, est l&#39;induction de la mort cellulaire programmée dans des cellules de mammifère lorsqu&#39;elle est remise dans les cellules cibles par PFN 5,6. Pourtant, Des études plus récentes ont également démontré des effets extracellulaires des Gzms avec un impact profond sur la réglementation et l&#39;inflammation immunitaire, indépendamment de livraison cytosolique par PFN 7,8. Le spectre de cellules qui sont tuées efficacement cytosolique après l&#39;entrée des Gzms a également été récemment élargie à partir de cellules de mammifères à des bactéries et même 9,10 11 certains parasites. Ces découvertes récentes ont ouvert un nouveau champ pour les chercheurs GZM. Par conséquent, un, à haut rendement système d&#39;expression mammalien rentable solution va considérablement faciliter la voie à ces études futures. Gzms natives humaines, de souris et de rat ont été purifiés avec succès à partir de la fraction de granulés de CTL et NK lignées cellulaires 14/12. Cependant, dans les mains, le rendement de ces techniques de purification est dans la gamme de culture inférieure à 0,1 mg / L de cellules (observation non publiée et 12). En outre, la résolution chromatographique d&#39;un seul GZM sans contamination par other Gzms et / ou des protéines qui sont également présentes dans les granules contestent (données non publiées et 12,14). Gzms recombinants ont été produites dans des bactéries, des levures 15 16, des cellules d&#39;insectes 17 et même dans des cellules de mammifères telles que HEK 293 18,19. Seuls les systèmes d&#39;expression de mammifères portent le potentiel de produire des enzymes recombinantes avec des modifications post-traductionnelles identiques à la protéine native cytotoxique. Modifications post-traductionnelles ont été impliqués avec l&#39;absorption spécifique par endocytose et la localisation intracellulaire de la protease dans les cellules cibles de 20 à 22. Par conséquent, en utilisant pHLsec 23 (un cadeau genre de Radu Aricescu et Yvonne Jones, Université d&#39;Oxford, Royaume-Uni) comme l&#39;épine dorsale de plasmide pour l&#39;expression GZM, nous avons établi un système simple, rapide et économique efficace pour la production de protéines à haut rendement dans des cellules HEK293T. pHLsec combine un activateur de CMV avec un promoteur de poulet Β-actine; Ensemble, ces éléments démonstrationsted la plus forte activité de promoteur dans diverses lignées cellulaires 24. En outre, le plasmide contient un Β-globine de lapin intron, des signaux de sécrétion et de Kozak optimisée, une 6xHis-tag-Lys et un signal poly-A. Les inserts peuvent être clonées idéalement entre le signal de sécrétion et la-6xHis-tag Lys (Figure 1) assurer une expression optimale et l&#39;efficacité de la sécrétion de protéines dépourvues appropriées domaines N-terminaux. Pour l&#39;expression des Gzms, nous avons remplacé la séquence signal de sécrétion endogène avec le signal de sécrétion fournie par le vecteur suivie par une entérokinase (EK) place (DDDDK) afin que le traitement EK activé le Gzms sécrétées (Gzms actifs commencer par la N-terminal séquence d&#39;acides aminés IIGG 25). De plus en faveur de cette méthode, les cellules HEK293T se développent rapidement en basse à prix moyen, comme milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM), et sont bien adaptés pour la méthode de transfection au phosphate de calcium rentable.

<table><tbody><tr><td>TRIzol</td><td>Reagent Invitrogen</td><td>15596-026</td><td>Kit d’isolement de l’ARN total</td></tr><tr><td>SuperScript II Transcriptase inverse</td><td>Invitrogen</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>QIAGEN</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>EX-CELL 293 Milieu sans sérum pour cellules HEK 293</td><td>Sigma</td><td>14571C</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, hyperglycémie, supplément GlutaMAX, pyruvate</td><td>Gibco</td><td>31966-021</td><td></td></tr><tr><td>Tube de dialyse SnakeSkin, 10K MWCO</td><td>Thermo Scientific</td><td>68100</td><td></td></tr><tr><td>Entérokinase de l’intestin bovin</td><td>Sigma</td><td>E4906</td><td>recombinant, &ge ; 20&nbsp ; unités/mg de protéines</td></tr><tr><td>HisTrap Excel 5 ml colonne</td><td>GE Healthcare</td><td>17-3712-06&nbsp ;</td><td>Nickel IMAC</td></tr><tr><td>HiTrap SP HP 5 ml colonne</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1152-01&nbsp ;</td><td>Colonne S</td></tr><tr><td>N-&alpha ;-Cbz-L-lysine thiobenzylester (BLT)</td><td>Sigma</td><td>C3647</td><td>Substrat GzmA</td></tr><tr><td>Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl (AAD)</td><td>MP Biomedicals</td><td>2193608 _10mg</td><td>Substrat GzmB</td></tr><tr><td>Suc-Ala-Ala-Pro-Leu-p-nitroanilide (AAPL)</td><td>Substrat Bachem</td><td></td><td>GzmM</td></tr><tr><td>5,5&prime ;-dithio-bis(2-nitrobenzoïque) (DTNB)</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td>Réactif d’Ellman</td></tr></tbody></table>

un rendement élevé et expression system coût-efficace de granzymes humain dans des cellules de mammifères

A High Yield and Cost-efficient Expression System of Human Granzymes in Mammalian Cells

Lorsque les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) ou les cellules tueuses naturelles (NK) reconnaissent des cellules tumorales ou des cellules infectées par des pathogènes intracellulaires, ils libèrent leur contenu en granules cytotoxiques pour éliminer les cellules cibles et l’agent pathogène intracellulaire. La mort des cellules hôtes et des agents pathogènes intracellulaires est déclenchée par les protéases à sérine granulaires, granzymes (Gzms), délivrées dans le cytosol de la cellule hôte par la protéine perforine formant les pores (PFN) et dans les agents pathogènes bactériens par la granulysine procéphine perturbatrice de la membrane procaryote (GNLY). Pour étudier les mécanismes moléculaires de la mort cellulaire cible médiée par les Gzms dans des contextes expérimentaux in vitro, des systèmes d’expression et de purification des protéines qui produisent de grandes quantités d’enzymes actives sont nécessaires. Les systèmes d’expression des protéines sécrétées par les mammifères impliquent le potentiel de produire des protéines correctement repliées et entièrement fonctionnelles qui supportent des modifications post-traductionnelles, telles que la glycosylation. Par conséquent, nous avons utilisé une méthode de précipitation calcique rentable pour la transfection transitoire de cellules HEK293T avec des Gzms humains clonés dans le plasmide d’expression pHLsec. La purification de Gzm à partir du surnageant de culture a été réalisée par chromatographie d’affinité de nickel immobilisée à l’aide de l’étiquette de polyhistidine C-terminale fournie par le vecteur. L’insertion d’un site d’entérokinase à l’extrémité N-terminale de la protéine a permis la génération d’une protéase active qui a finalement été purifiée par chromatographie d’échange cationique. Le système a été testé en produisant des niveaux élevés de Gzm A, B et M humains cytotoxiques et devrait être capable de produire pratiquement toutes les enzymes du corps humain à des rendements élevés.

Dans la section suivante, nous allons présenter une documentation complète d&#39;une préparation GZMA pour éclairer la méthode. Nous avons également purifié succès GZMB et GzmM, produisant des résultats similaires en ce qui concerne l&#39;efficacité et l&#39;activité purification. Cependant, à partir de ces préparations plus tard nous ne montrer quelques morceaux choisis de données. Préparations GZMB à partir de cellules 293T en suivant le protocole actuel ont été utilisés dans plusieurs études publiées, mettant en évid...

Nous décrivons ici un système d’expression de granzyme rentable utilisant des cellules HEK293T qui produit des rendements élevés de protéase pure, entièrement glycosylée et enzymatiquement active.

Un rendement élevé et Expression System coût-efficace de granzymes humain dans des cellules de mammifères

When cytotoxic T lymphocytes (CTL) or natural killer (NK) cells recognize tumor cells or cells infected with intracellular pathogens, they release their ...

L'objectif général de cette procédure est d'obtenir de forts rendements de granzymes glycosylés de manière fucosylée et enzymatiquement actifs dans des cellules rénales embryonnaires humaines 293T. Cela est réalisé en premier lieu en amplifiant les cellules HEK 293T dans des boîtes de culture tissulaire appropriées. La taille habituelle de la préparation après l'amplification comprend 20 à 25 boîtes de culture.La deuxième étape consiste à transfecter de manière transitoire les cellules étendues avec un plasmide d'expression de la granzyme en utilisant la méthode efficace du phosphate de calcium. Ensuite, les surnageants cellulaires sont récupérés et les enzymes granzymes sécrétées sont purifiées par chromatographie d'affinité aux métaux immobilisés. Les étapes finales consistent à activer les enzymes granzymes par un traitement à l'entérokinase et à purifier davantage les protéases par chromatographie d'échange cationique.En fin de compte, l'activité enzymatique est testée à l'aide d'un dosage chole métrique rapide et fiable. Étant donné que la disponibilité de protéase active en quantités suffisantes constitue un facteur limitant dans la recherche sur les granzymes, cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans ce domaine, telles que la caractérisation de nouvelles voies de mort cellulaire chez différents organismes ou l'identification de nouveaux substrats de protéase dans des approches protéomiques complètes. Pour exprimer les enzymes grand, commencez par cultiver des cellules HEC 293 T dans 20 millilitres de milieu de culture, en utilisant des boîtes de culture tissulaire de 150 par 25 millimètres. Scindez les cellules à une confluence de 80 % : les cellules adhèrent faiblement, mais peuvent être détachées mécaniquement sans trypsine en pipetant vigoureusement plusieurs fois vers le haut et vers le bas sur la plaque.Les cellules la nuit précédant la transfection afin d'obtenir une confluence de 60 à 70 % le jour de la transfection. Une préparation habituelle comprend 20 à 25 boîtes de culture. Une heure avant la transfection, remplacer le milieu de culture standard par 20 millilitres de milieu de transfection. À la fin de l'étape d'incubation d'une heure, mélanger 400 microgrammes d'ADN plasmidique avec 10,95 millilitres d'eau doublement distillée et 1,55 millilitre de chlorure de calcium à deux molaire dans des tubes de 50 millilitres, une à deux minutes avant la transfection.Ajouter 12,5 millilitres de solution saline tamponnée deux fois concentrée à 12,5 millilitres de la solution de calcium ADN, puis mélanger par retournement des tubes avant d'incuber pendant 30 secondes. À température ambiante, ajouter ce mélange goutte à goutte directement sur les cellules, à raison de cinq millilitres par boîte, en le répartissant uniformément sur toute la surface, ce qui fait virer le milieu à une couleur légèrement orangée. Incuber les boîtes de culture de sept à onze heures dans un incubateur pour culture tissulaire.Après l'incubation, un fin précipité est visible. Éliminez le milieu de transfection. Rincez soigneusement avec du PBS préchauffé et ajoutez 20 millilitres de milieu de culture sans sérum avant d'incuber pendant 72 heures dans une étuve à culture tissulaire. Analysez l'efficacité de la transfection et de l'expression en analysant un échantillon du surnageant cellulaire par électrophorèse sur gel de SDS-PAGE et en colorant avec du bleu de Coomassie.Bleu brillant. Pour visualiser une bande de granzyme. Après l'incubation, versez délicatement les surnageants de culture cellulaire dans des tubes de 250 millilitres et clarifiez par centrifugation.Effectuez une première centrifugation afin d’éliminer le milieu des cellules détachées. Transférez le surnageant dans de nouveaux tubes de 250 millilitres et centrifugez à 4 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer tous les débris cellulaires résiduels. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de chlorure de sodium, 6,25 millilitres de tris base et un millilitre de sulfate de nickel, puis 250 millilitres de surnageant clarifié.Filtrer le surnageant à l’aide d’un système de filtration sous vide de 500 millilitres. Équilibrer une colonne de chromatographie d’affinité sur métal immobilisé au nickel avec le tampon de liaison his. A à l’aide d’un système FPLC approprié.Ensuite, appliquer le surnageant clarifié sur la colonne équilibrée à un débit de 0,5 millilitre par minute à quatre degrés Celsius. Après l'application du surnageant, laver la colonne avec le tampon de liaison jusqu'à l'obtention d'une ligne de base d'absorbance ultraviolette ou UV. Éluer les granzymes à l'aide d'un gradient linéaire de 20 millilitres d'ILE à un débit de 0,5 millilitre par minute, en collectant des fractions de deux millilitres.Analyser les fractions éluantes par électrophorèse SDS-PAGE et coloration au Comassie. Rassembler les fractions contenant la grand zyme dans un tube de centrifugation. Conserver un petit échantillon à moins 20 degrés Celsius comme témoin pré-entérokinase.Ajouter l'entérokinase à raison de 0,02 unité par 50 millilitres de surnageant initial directement dans la fraction regroupée contenue dans le tube de dialyse, puis effectuer une dialyse toute la nuit à température ambiante dans un tampon d'entérokinase. Le jour suivant, analyser le produit traité par l'entérokinase par rapport au témoin avant traitement à l'entérokinase par électrophorèse SDS-PAGE et coloration au bleu de Kumasi. Lorsque le traitement des extrémités terminales est terminé.Changer le tampon de dialyse contre le tampon S A et dialyser pendant quatre heures supplémentaires à température ambiante avant de filtrer le DIALATE huit. Ensuite, équilibrer une colonne S avec le tampon S A. Charger l'échantillon sur la colonne à un débit de 0,5 millilitre par minute à quatre degrés Celsius après le chargement de l'échantillon.Lavez la colonne avec le tampon S A jusqu'à ce que la ligne de base d'absorbance UV soit atteinte. Éluerez les granzy mes à l'aide d'un gradient linéaire de chlorure de sodium de 30 millilitres : le granzy me A s'élue à environ 650 millimolaire de chlorure de sodium, le granzy me B à environ 700 millimolaire de chlorure de sodium et le granzy me M à environ 750 millimolaire de chlorure de sodium. Rassemblez les fractions contenant les granzy mes et concentrez-les à environ 100 micromolaire à l'aide de filtres centrifuges, aliquotez les préparations concentrées de granzy mes et stockez-les à moins 80 degrés Celsius.Ensuite, analyser les fractions éluantes par électrophorèse SDS-PAGE et par des dosages colorimétriques. Pour effectuer les dosages colorimétriques, répartir de petits échantillons de granzyne provenant des fractions éluantes ou de stocks concentrés dans des plaques de 96 puits à fond plat. Inclure un contrôle positif et un contrôle négatif. Ajouter 100 microlitres de tampon de dosage à chaque puits.Incuber correctement la plaque pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Enfin, mesurer la densité optique à 405 nanomètres à l’aide d’un lecteur de microplaques. Ce protocole permettra d’obtenir des rendements élevés de granzymes purs, comme le montre ce gel représentatif de SDS-PAGE coloré au kumasi, montrant la granzyme BE de la colonne S.Les granzymes recombinantes présentent une activité similaire à celle des préparations de protéases natives, comme le montre cet essai colorimétrique comparant l'activité de la granzyme B recombinante et native. De manière importante, le traitement par l'endo H indique que les granzymes produites dans les cellules HEC 2 93 T sont entièrement glycosylées. Les granzymes recombinantes sont capables de cliver des substrats protéiques macromoléculaires, comme le démontre cet essai représentatif de clivage de la granzyme A utilisant le substrat protéique bactérien et UOCD.Ici, la bande représentant la forme clivée de N-O-U-C-D disparaît lentement avec une concentration croissante de granzyme. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de produire des enzymes granzytiques entièrement glycosylées et proactives en haut rendement dans des cellules HEK293T.

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Dans l'ère post-génomique humaine, la disponibilité de protéines recombinantes dans des conformations natives est cruciale pour la recherche structurelle, fonctionnelle et thérapeutique et le développement. Ici, nous décrivons un test et à grande échelle du système expression des protéines dans les cellules embryonnaires humaines de rein 293T qui peuvent être utilisés pour produire une variété de protéines recombinantes.

Une plate-forme d&#39;expression pratique et général pour la production de protéines sécrétées à partir de cellules humaines

L’expression de protéines recombinantes par des systèmes mammifères devient une méthode attrayante pour produire des complexes protéiques pour la biologie structurale. Nous présentons ici un système d’expression simple mais très efficace utilisant des cellules de mammifères cultivées en suspension pour purifier des complexes protéiques pour des études structurales.

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Dans cette étude, l’expression d’une protéine recombinante humaine cible dans différentes plateformes de production a été comparée. Nous nous sommes concentrés sur les cultures traditionnelles à base de fermenteurs et sur les plantes, en décrivant la configuration de chaque système et en mettant en évidence, sur la base des résultats rapportés, les limites et les avantages inhérents à chaque plateforme.

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Il s’agit d’un protocole rapide et rentable pour la production de protéines de mammifères glycosylées sécrétées et la purification ultérieure en une seule étape avec des rendements suffisants de protéines homogènes pour la cristallographie aux rayons X et d’autres études biophysiques.

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Un rendement élevé et Expression System coût-efficace de granzymes humain dans des cellules de mammifères

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