Un rendement élevé et Expression System coût-efficace de granzymes humain dans des cellules de mammifères

L’objectif global de cette procédure est de produire des rendements élevés de granzymes foliques glycosylés et enzymatiquement actifs dans les cellules T embryonnaires humaines 2 93. Ceci est accompli en élargissant d’abord les cellules T HEC 2 93 dans des boîtes de culture tissulaire appropriées. La taille habituelle de la préparation après l’expansion se compose de 20 à 25 plats de culture.

La deuxième étape consiste à transfecter transitoirement les cellules expansées avec un plasmide d’expression de granzyme en utilisant la méthode efficace du phosphate de calcium. Ensuite, les cellules supernat sont récoltées et les grandes enzymes sécrétées sont purifiées par chromatographie d’affinité métallique immobilisée. Les dernières étapes consistent à activer les grandes enzymes en entrant dans le traitement kinase et à purifier davantage les protéases par chromatographie échangeuse de cations.

En fin de compte, l’activité enzymatique est testée à l’aide d’un dosage cholémétrique rapide et fiable, car la disponibilité de la protéase active en quantités suffisantes est un facteur limitant dans la recherche sur les granzymes. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine, telles que la caractérisation de nouvelles voies de mort cellulaire dans différents organismes, ou l’identification de nouveaux substrats de protéase dans des approches de protéome entier pour exprimer de grandes enzymes. Cultivez d’abord des cellules T HEC 2 93 dans 20 millilitres de milieu de culture, à l’aide de boîtes de culture tissulaire de 150 x 25 millimètres, divisez les cellules à 80 % de fluidité Co : les cellules se fixent lâchement, mais peuvent être détachées mécaniquement sans trypsine en pipetant rigoureusement la plaque de haut en bas.

Les cellules la nuit précédant la transfection pour donner 60 à 70 % de fluidité au jour de la transfection. La taille habituelle d’une préparation est de 20 à 25 plats de culture. Une heure avant la transfection, le milieu de culture standard a été remplacé par 20 millilitres de milieu de transfection vers la fin de l’étape d’incubation d’une heure, a mélangé 400 microgrammes d’ADN plasmatique avec 10,95 millilitres d’eau distillée deux fois et 1,55 millilitre de chlorure de calcium à deux molaires dans des tubes de 50 millilitres une à deux minutes avant la transfection.

À 12,5 millilitres de deux tas de solution saline tamponnée à 12,5 millilitres de la solution d’ADN et de calcium mélangée par inversion des tubes avant d’incuber pendant 30 secondes. À température ambiante, ajoutez ce mélange, goutte à goutte directement dans les cellules à raison de cinq millilitres par plat, saupoudrez uniformément sur toute la surface, en transformant le milieu en une couleur légèrement orange. Incuber les boîtes de culture pendant sept à 11 heures dans un incubateur de culture tissulaire.

Après l’incubation, un fin précipité est visible. Retirez le milieu de transfection. Rincer soigneusement avec du PBS préchauffé et ajouter 20 millilitres de milieu de culture sans sérum avant d’incuber pendant 72 heures dans un incubateur de culture tissulaire, analyser la transfection et l’efficacité d’expression en analysant un échantillon du surnageant cellulaire sur la page SDS et en colorant avec kumasi.

Bleu brillant. Pour visualiser une bande de granzyme. Après l’incubation, décantez les surnageants de culture cellulaire dans des tubes de 250 millilitres et éliminez-les par centrifugation.

Effectuez un premier essorage qui dégagera le milieu des cellules détachées. Transférez le surnageant dans des tubes frais de 250 millilitres et faites-le tourner à 4 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer tous les débris cellulaires restants. Ensuite, ajoutez cinq millilitres de chlorure de sodium, 6,25 millilitres de tris base et un millilitre de sulfate de nickel plus 250 millilitres de surnageant éliminé.

Filtrez le surnageant à l’aide d’une unité de filtration sous vide de 500 millilitres. Équilibrer une colonne de chromatographie d’affinité d’ions métalliques immobilisée au nickel avec son tampon de liaison. A à l’aide d’un système FPLC approprié.

Appliquez ensuite le surnageant éliminé sur la colonne équilibrée à un débit de 0,5 millilitre par minute à quatre degrés Celsius. Après l’application du surnageant, laver la colonne avec son tampon de liaison jusqu’à ce que la ligne de base absorbant les rayons ultraviolets ou les UV soit atteinte. Éluer les granzymes avec un gradient linéaire de 20 millilitres ILE à un débit de 0,5 millilitre par minute tout en recueillant deux fractions de millilitres.

Analysez les fractions eluciennes par page SDS et coloration kumasi. Tirez le grand zyme contenant les fractions dans un tube étourdi. Conservez un petit échantillon à moins 20 degrés Celsius comme témoin de la pré-entéro kinase.

Ajouter l’entérokinase à raison de 0,02 unité par 50 millilitres de surnageant initial directement à la fraction mélangée dans le tube de dialyse et dialyser pendant la nuit à température ambiante dans un tampon d’entéro kinase. Le lendemain, analysez la kinase traitée grand par rapport au contrôle de la kinase pré-entrée par la page SDS et la coloration au bleu kumasi. Lorsque le traitement final du terminal est terminé.

Remplacez le tampon de dialyse par le tampon S A et dialysez pendant quatre autres heures à température ambiante avant de filtrer le DIALATE huit. Ensuite, équilibrez une colonne S avec un tampon S. A.Chargez l’échantillon sur la colonne à un débit de 0,5 millilitre par minute à quatre degrés Celsius après le chargement de l’échantillon.

Lavez la colonne avec le tampon S A jusqu’à ce que la ligne de base absorbant les UV soit atteinte. Eluter les granzymes avec un gradient linéaire de chlorure de sodium de 30 millilitres ; la granzyme A élue à environ 650 millimolaires de chlorure de sodium, la granzyme B à environ 700 millimolaires de chlorure de sodium et la granzyme M à environ 750 millimolaires de chlorure de sodium. Regrouper les fractions contenant des granzymes et les concentrer à environ 100 micromolaires dans des filtres de spin, aliquote les préparations de granzymes concentrés et les stocker à moins 80 degrés Celsius.

Ensuite, analysez les fractions éluciennes par la page SDS et les dosages métriques chole pour effectuer les dosages métriques chole distribuent de petits échantillons de granzyme à partir de fractions elluciennes ou de stocks concentrés en 96. Les plaques à fond plat comprennent un contrôle positif et un contrôle négatif. Ajoutez 100 microlitres de tampon de dosage à chacun.

Bien incuber l’assiette pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Enfin, mesurez la densité optique à 405 nanomètres dans un lecteur de microplaques. Ce protocole produira des rendements élevés de granzymes purs, comme démontré sur ce gel représentatif de la page SDS coloré au kumasi montrant le granzyme BE de la colonne S.

Les granzymes recombinants présentent une activité similaire à celle des préparations de protéase native, comme le montre ce test métrique couleur comparant l’activité des granzymes B recombinants et natifs. Il est important de noter que le traitement endo H indique que les granzymes produits dans les cellules T HEC 2 93 sont entièrement glycosylées. Les grandes enzymes recombinantes sont capables de cliver les substrats protéiques macromoléculaires, comme le démontre ce test de clivage de granzyme représentatif en utilisant le substrat protéique bactérien et l’UOCD.

Ici, la bande représentant le N-O-U-C-D clivé disparaît lentement avec l’augmentation de la concentration de granzyme. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de produire des grandes enzymes entièrement glycosylées et proactives à des rendements élevés dans les cellules T HK 2 93.