Corrélative confocale et microscopie électronique 3D d'une cellule sensorielle spécifique

L’objectif global de cette procédure est de documenter l’ultrastructure complète d’une cellule sensorielle intestinale spécifique dispersée parmi d’autres cellules épithéliales dans le tissu intestinal natif. Ceci est accompli en obtenant d’abord un segment de tissu de 300 par 50 microns de l’intestin. Ensuite, on obtient des empilements optiques Z du segment à l’aide de la microscopie confocale.

Ensuite, les données confocales servent de guide pour traiter et imager le tissu à l’aide de la microscopie électronique à balayage en série ou SBEM. Enfin, les données SBEM sont segmentées pour restituer l’ultra-structure d’une cellule de capteur intestinal spécifique en 3D. En fin de compte, la microscopie confocale corrélative et le balayage en série des visages de blocs.

La microscopie électronique est utilisée pour montrer une cellule spécifique dans son tissu natif et révéler son ultra structure en 3D. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire, telles que les interactions spécifiques de cellule à cellule qui ne pourraient pas être visualisées autrement au niveau de la microscopie optique. En utilisant cette méthode, nous avons précédemment rapporté une relation physico-chimique cachée entre les cellules endocriniennes sensorielles et les cellules ggl entrantes.

Après avoir isolé le côlon de la souris, selon le protocole de texte, placez-le dans du PBS bien froid et, pendant qu’il est immergé, coupez le tissu ouvert le long du mésentaire, transférez le tissu en quelques gouttes de PBS sur une feuille de cire dentaire et à l’aide d’un scalpel, prélevez environ six petits segments de tissu du côlon distal. Après avoir préparé des aros à faible point de fusion de 5 % dans du PBS, utilisez-le pour intégrer les segments de tissu dans un petit récipient en plastique tel que le moule cryogénique Tissue Tech de taille standard, montez les sections intégrées sur un microtome à lame vibrante et utilisez du PBS glacé pour remplir le plateau tampon. Ensuite, coupez des bandes de tissu de 300 microns à une amplitude de 0,8 et à une vitesse de 0,04 millimètre par seconde.

Peignez les bandes de tissu de 300 microns en aros et montez-les sur un microton perpendiculairement à la lame. Ensuite, coupez des bandes de tissu d’une épaisseur de 50 microns en vous référant au protocole de texte pour plus de détails avant de stocker les blocs dans du PBS à quatre degrés Celsius. Après imagerie de blocs tissulaires à l’aide de la microscopie confocale selon le protocole textuel pour infiltrer et intégrer des coupes de tissus dans la résine.

Retirez le tissu du PBS et utilisez un tampon de couche de 0,1 molaire pour le rincer trois fois pendant cinq minutes chacune. Une fois que la résine a été préparée et que les tissus ont été colorés pour la microscopie électronique, selon le protocole textuel, utilisez-le pour prendre en sandwich des blocs de tissu entre des lames de verre durcies avec un agent de démoulage liquide après que les blocs de tissu ont été intégrés, polymérisez à plat les blocs pendant 48 heures supplémentaires à 60 degrés Celsius. Ensuite, écartez les lames pour libérer les blocs sous une lunette de dissection, faites correspondre l’orientation des blocs de tissu incrustés dans la résine avec celle des micrographies confocales.

Pour faciliter l’identification des régions contenant les cellules d’intérêt, montez le bloc à plat sur une broche contenant un époxy conducteur et séchez-le pendant 30 minutes. Ensuite, posez le bloc à plat sur une surface et séchez-le pendant la nuit à 60 degrés Celsius le lendemain. Enduisez le bloc d’un liquide d’argent colloïdal.

Maintenez les sections de tissu à plat pour assurer le découpage du bloc à angle droit afin de faciliter la corrélation entre les micrographies faciales et confocales du bloc en série. Après avoir effectué la microscopie électronique à balayage selon le protocole texte, convertissez les images SPEM du format DM brut à trois en images TIFF huit bits à l’aide d’un filtre de flou gaussien de 0,8 en Fidji. Filtrez les images TIFF.

Réduisez l’ensemble de données à 25 % de la taille d’origine et enregistrez-le en tant que pile TIFF pour minimiser la quantité de mémoire RAM nécessaire pour gérer l’ensemble de données avec le plug-in Fidji alignement de pile linéaire avec sift en mode traduction. Alignez la pile d’images SPEM et utilisez le plugin de recadrage 3D pour les recadrer. Pour afficher les données, utilisez l’outil surfaces en mode dessin et l’option contour en mode dessin de 50 millisecondes pour segmenter et afficher manuellement le volume de la cellule d’intérêt.

Tracez les contours sur chaque tranche de la cellule pour un rendu plus fluide ou toutes les cinq tranches pour un rendu plus rapide. Utilisez l’outil d’instantané pour exporter les images finales à une résolution de 300 DPI ou plus à l’aide de la souris P-Y-Y-G-F-P. Toutes les cellules entéroendocrines de la partie distale de l’intestin grêle sont identifiées et traitées pour le SBEM, comme indiqué ici.

Un segment de tissu sélectionné a été imagé par microscopie confocale pour obtenir des images de Zack, qui sont espacées optiquement d’un micron. L’optimisation des dimensions des blocs tissulaires est essentielle pour la corrélation topographique entre les données confocales et SBEM. Cette vue rendue en volume d’une cellule entéroendocrine dans l’iléon de la souris montre un neuropod proéminent étendu sous les cellules épithéliales sur environ 60 microns.

En corrélant les empilements confocaux Z avec une image SBEM de l’ensemble de la face du bloc, la cellule d’intérêt est identifiée ici dans un bloc du côlon distal de la souris A-P-Y-Y-G-F-P. Il est important de maintenir l’orientation du bloc aussi plate que possible pour correspondre aux coupes optiques dans les images SBEM. Une fois la cellule identifiée, l’imagerie SBEM est effectuée à une résolution suffisamment élevée pour identifier les sles sécrétoires et les autres organites cellulaires.

Cette vidéo contient un rendu en 3D de la cellule entéroendocrine. L’ensemble de données contient 643 images qui couvrent 45 microns de profondeur tissulaire. La cellule contient un neuropod rempli de sécrétoires ainsi que de microvillosités.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de documenter l’ultra-structure complète d’un intestin spécifique La cellule sensorielle est dispersée parmi d’autres cellules épithéliales dans le tissu intestinal natif en utilisant la fluorescence comme guide pour identifier la cellule ou les cellules d’intérêt et traiter le tissu pour la microscopie électronique à balayage en phase de bloc en série.