Préparation Facile et efficace de glycopolymères fluorescentes Tri-composants par polymérisation RAFT-contrôlée

L’objectif global de cette procédure est la synthèse bien contrôlée de glycopolymères linéaires statistiques fluorescents en utilisant la fragmentation par addition réversible, le transfert de chaîne ou la polymérisation en radeau. Ceci est accompli en synthétisant d’abord le glyco monomère deux lacto bio éthyl méthamphétamine, ou L-A-E-M-A. La deuxième étape consiste à utiliser la polymérisation en radeau de L-A-E-M-A-N deux aminéthylméth-méthamide acrylamide, ou A EMA et N deux hydroxyéthyl acrylamide ou un GAA pour synthétiser le glycopolymère à faible dispersion correspondant.

Ensuite, le glycopolymère est modifié sur l’une de ses amines primaires par réaction avec l’ester moyen de carboxy-fluorescéine xito pour produire un glycopolymère fluorescéine. La dernière étape consiste à lier le glycopolymère natif de fluorescéine à des billes recouvertes de lectine dont la spécificité de liaison aux glucides est connue. En fin de compte, la microscopie fluorescente est utilisée pour analyser la liaison des glycopolymères aux billes apparues, confirmant que le glycopolymère possède le glucide d’intérêt et est marqué avec une étiquette fluorescente.

L’avantage de la polymérisation RAF par rapport aux méthodes existantes qui utilisent des polymérisations conventionnelles par radicaux libres est que le procédé Wrath est une technique de polymérisation de contrôle qui minimise le nombre de chaînes dérivées de l’initiateur. Il en résulte des polymères de poids moléculaires prédéterminés et des racks de polydispersité très étroits. Les polymérisations peuvent être appliquées à un mélange défini de monomères pour la préparation de glycopolymères fluorescents spécifiques.

Ces glycopolymères ont des capacités de liaison définies qui peuvent être vérifiées par l’utilisation de billes enrobées de lectine. La préparation efficace de glycopolymères fluorescents devrait s’avérer d’une grande valeur pour la recherche en glycobiologie à l’avenir. Pour commencer, dissolvez deux grammes d’acide lactobionique dans trois millilitres de méthanol anhydre.

Ensuite, ajoutez lentement de l’éthanol absolu goutte à goutte à la solution jusqu’à ce qu’elle devienne trouble. Utilisez un évaporateur rotatif pour éliminer tous les solvants. Répétez ce processus trois fois pour produire 1,94 gramme de lacto bioo one five lactone avec un rendement de 98 %.

Ajoutez une solution d’un gramme de lacto-bio lactone dans trois millilitres de méthanol à une solution d’A, d’EMA et de MEHQ dans deux millilitres de méthanol. Ensuite, ajoutez un millilitre de triéthylamine et remuez le mélange à température ambiante. Après 48 heures, ajoutez 20 millilitres d’eau déminéralisée au mélange et transférez-le dans un évaporateur rotatif.

Évaporer jusqu’à ce qu’il soit complètement sec. Dissoudre le résidu dans 20 millilitres d’eau déminéralisée et appliquer la solution sur le dessus d’une colonne d’échange d’anions de 10 x 20 millimètres. Placez un bécher contenant un milligramme de MEHQ sous la sortie et éluez la colonne dans le bécher.

Après avoir aspiré la solution dans un évaporateur rotatif, dissolvez le résidu dans 20 millilitres d’eau désionisée et ajoutez un milligramme d’aliquotes de résine échangeuse d’ions. Jusqu’à ce qu’un test de bouche d’incendie soit négatif, effectué dans des tests de bouche d’incendie en prélevant un microlitre de la solution et en l’appliquant sur une plaque de chromatographie en couche mince. Vaporisez la plaque avec une solution d’éthanol à 2 % et chauffez à 90 degrés Celsius pendant une minute sur une plaque chauffante.

Le point final a été atteint lorsqu’aucune couleur bleue ne se forme. Ensuite, filtrez la solution à travers un entonnoir en verre fritté dans un tube à essai. Congelez la solution à moins 80 degrés Celsius, puis transférez-la dans un lyophilisateur pour qu’elle soit lyophilisée.

Dissoudre le résidu dans une quantité minimale de méthanol et précipiter le produit en ajoutant moins 20 degrés Celsius et de l’acétone anhydre. Récupérez le L-A-E-M-A précipité par filtration à travers un entonnoir en verre fritté. Transférez l’entonnoir et le précipité dans un dessiccateur sous vide pour le séchage d’abord à 0,5 gramme d’environ 150 nanoparticules d’oxyde d’aluminium à un millilitre de HEAA de qualité commerciale dans un tube à essai de deux millilitres.

Centrifugez le tube à 300 fois G pendant 30 secondes et utilisez la couche supérieure comme HEAA sans inhibiteur, dissolvez soigneusement 32,8 milligrammes de L-A-E-M-A, 1,7 milligramme d’un EMA et 27,5 microlitres de HEAA sans inhibiteur et 0,4 millilitre d’eau déminéralisée et transférez la solution dans un tube de flanc d’un millilitre bien nettoyé. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de réactif de radeau et 50 microlitres de réactif d’initiateur dans le tube et mélangez en tapotant doucement le côté du tube avec la valve fermée. Connectez le tube à une conduite de vide et congelez le contenu à l’aide d’un bain d’éthanol à la glace sèche.

Réduisez ensuite la pression du tube pour tendre à 50 millitorr avec une pompe et fermez la vanne. Retirez le bain de glace carbonique et laissez le contenu décongeler. Répétez le cycle de congélation, d’aspiration et de décongélation deux fois plus soigneusement.

Inspectez le tube pour vous assurer que le contenu est complètement dissous et utilisez un léger vortex si nécessaire. Avant de vous asseoir, retirez le tube fermé de la conduite d’aspiration et placez-le dans un sac sous vide en plastique transparent. Évacuez l’air du sac à l’aide d’une pompe à main en plastique.

Placez ensuite le sac dans un bain-marie couvert à 70 degrés Celsius pendant 24 heures. Ensuite, retirez le tube du sac et transférez son contenu dans un sac de dialyse avec une coupure de poids moléculaire de 3 500 Daltons. Placez le sac de dialyse dans un bécher et dialysez contre deux litres d’eau déminéralisée pendant 24 heures.

Transférez le contenu du sac de dialyse dans un tube à essai et placez-le dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius. Une fois congelé, transférez-le dans un lyophilisateur et lyophilisez-le. Pour obtenir d’abord le glycopolymère blanc moelleux PMA LA EMA, préparez une solution de cinq milligrammes de PMA LA EMA dans 0,9 millilitre de PBS.

Ensuite, ajoutez lentement 0,6 milligramme de carboxy-fluorescéine cin, milieu dans 100, microlitres de diméthylformamide à la solution rapidement agitée, le microtube et la feuille, et remuez lentement pendant 16 heures à température ambiante, transférez la solution dans un sac de dialyse avec une coupure de poids moléculaire de 3 500 Daltons. Placez le sac dans un bécher et dialysez contre deux litres d’eau déminéralisée pendant 16 heures tout en le gardant à l’abri de la lumière. Transférez le contenu du sac de dialyse dans un tube à essai.

Après avoir congelé la solution à moins 80 degrés Celsius, lyophiliser. Pour obtenir le glycopolymère glycopolymère P-M-A-L-A-E-M-A, marqué en fluorescence jaune duveteux, déterminez le poids moléculaire moyen en nombre, le poids, le poids moléculaire moyen et la dispersion des glycopolymères avec un système HPLC. D’abord à 1,5 millilitres de PBS à une suspension de 50 microlitres de billes d’aro enrobées de lectine dans un tube à centrifuger.

Ensuite, centrifugez le tube à 300 fois G pendant une minute. Ensuite, jetez le surnageant et répétez le lavage deux fois de plus avant d’ajouter enfin 0,5 millilitre de PBS. Ajoutez une solution de trois microgrammes de fluorescéine marquée PMA LA EMA dans six microlitres de PBS dans le tube contenant les billes enrobées de lectine.

Utilisez la fluorescéine marquée P-M-A-G-A-E-M-A comme contrôle négatif. Ensuite, enveloppez les tubes dans du papier d’aluminium et incubez-les à température ambiante pendant une heure. Centrifugez le tube pendant une minute et jetez le surnageant.

Ensuite, suspendez les perles dans 1,5 millilitres de PBS frais et répétez le lavage trois fois. Enfin, mettez les billes en suspension dans 0,2 millilitre de PBS Transférez quatre microlitres des billes en suspension dans un puits d’un microscope à immunofluorescence. Faites glisser et couvrez avec un couvercle en verre.

Images de la lame à l’aide d’un microscope fluorescent équipé d’un filtre FITC 10 x et d’une caméra. Les glycopolymères ont été analysés par chromatographie par perméation de gel. Les polymères synthétisés sans utiliser de radeau ont une dispersité beaucoup plus élevée que ceux fabriqués à l’aide de radeau.

Lorsqu’il est étiqueté à la fluorescéine, l’aspect physique du glycopolymère passe du blanc à une couleur jaune vif affichée sous la lumière UV. Une solution de polymère non marqué reste sombre tandis que le polymère marqué à la fluorescéine brille en vert vif, confirmant la présence de l’étiquette, la liaison spécifique aux billes enrobées de lectine ne se produit qu’avec des polymères portant des résidus de sucre pendants, les billes brillent en vert lorsqu’elles sont liées, tandis qu’elles restent sombres lorsqu’elles sont traitées avec des polymères dépourvus de résidus de sucre suspendus. Cette technique de polymérisation basée sur le radeau permet une grande flexibilité dans le type de glycopolymères pouvant être synthétisés.

Le marquage ultérieur des glycopolymères peut également être réalisé avec une grande variété de réactifs fluorescents, capables de réagir avec des moyens primaires dans un environnement aqueux. Les chercheurs dans le domaine de la glycobiologie peuvent utiliser cette technique pour obtenir facilement des glycopolymères très polyvalents et définis. Ces glycopolymères peuvent être utilisés comme outils pour explorer les spécificités de liaison aux glucides, telles que celles observées dans la voie respiratoire des patients atteints de mucoviscidose ou ceux impliqués dans de nombreux types de cancers humains.