Name: La quantification des cellules endothéliales adhésivité In Vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Apprenez à quantifier l'adhésivité des cellules endothéliales in vitro en utilisant des monococytes marqués par fluorescence. Cette méthode fiable permet de mesurer précisément le pourcentage de cellules adhésives après traitement.

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Nous sommes très reconnaissants à Simon Bouffler pour son soutien total et à Public Health England pour son soutien à l’infrastructure. Ce travail a été soutenu par Public Health England par le biais d’une subvention du National Institute for Health Research (NIHR). Ce rapport est un travail commandé par le NIHR. Les opinions exprimées dans cette publication sont celles des auteurs et ne sont pas nécessairement celles du NHS, du NIHR ou du ministère de la Santé. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

1. Préparation de verre Lamelles <ol><li> Stériliser 12 mm de diamètre autour de lamelles de verre en les trempant dans de l&#39;éthanol 70% pendant au moins 10 minutes avec agitation occasionnelle pour assurer une exposition totale de toutes les lamelles couvre-objet à l&#39;éthanol. Verser des lamelles de verre et d&#39;éthanol dans une boîte de culture cellulaire stérile (soit 6 cm ou 10 cm de diamètre). </li><li> Avec une paire de fines stériles 5B forceps, ramasser et placer chaque lamelle de verre individuelle dans un puits d&#39;une plaque de grappe 24. Veiller à ce que les lamelles ne se touchent pas les parois du puits et sont à peu près au milieu du puits. </li><li> Laisser la plaque non couverte 24 ainsi cluster avec des lamelles de verre à sécher dans la hotte à flux. Cela prend environ 10 min </li><li> Pendant cette période, la préparation du mélange de revêtement en diluant 10 mg / ml de fibronectine humaine dans une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) à 0,1 mg / ml. </li><li> Lorsque les lamelles sont secs, pipette 100 pi de solution de revêtement sur chaque co de verreverslip si la solution ne couvre que le verre sans mise en commun autour de l&#39;extérieur du puits. Placer la plaque 24 et pôle couverte dans un incubateur de culture cellulaire pendant au moins une heure. </li><li> Juste avant utilisation, enlever la solution de revêtement. La même solution de revêtement peut être transféré dans un tube stérile et utilisé jusqu&#39;à trois fois sans perte d&#39;efficacité visible. </li></ol> 2. Préparation des cellules endothéliales monocouche <ol><li> Culture des cellules endotheliales coronaires humaines d&#39;artère (CE) dans un milieu à 37 ° C et 5% de dioxyde de carbone. </li><li> Aspirer milieux de culture et rincer monocouche CE avec 10 ml de HBSS </li><li> Aspirer HBSS et ajouter 2 ml de trypsine 0,5%, solution d&#39;EDTA à 0,2%. Incuber à température ambiante pendant environ 5 min. </li><li> Lorsque CE peut être délogé par un robinet sur le côté de la fiole, ajoutez 5 ml d&#39;inhibiteur de trypsine de soja et avec pipette gicler la surface du flacon pour déloger davantage les cellules. </li><li> Transfert des cellules dans un tube de 15 ml et centrifuger le tubeà 200 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer le surnageant et remettre le culot CE dans 5 ml de médias. Compter les cellules avec un hémocytomètre et ajuster la concentration de cellules à 50000 CE par ml de milieu, CE. </li><li> Distribuer 1 ml de la suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à 24 puits contenant des lamelles de verre revêtues. Incuber les cellules S / N, dans une culture de cellules incubateur à 37 ° C plus 5% de dioxyde de carbone. </li><li> Les cellules sont prêtes pour une utilisation dans des expériences où une monocouche confluente est formé, dans les 3 jours. </li></ol> 3. Préparation des monocytes <ol><li> Transférer cellules HL-60 qui sont cultivées dans du RPMI supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, comme une culture en suspension, dans un tube de 15 ml. Centrifuger les cellules à 200 xg pendant 5 min. </li><li> Retirer les cellules du surnageant et remettre en suspension dans 5 ml de milieu et ajuster la concentration de cellules avec des milieux à 2 millions de cellules / ml. Si marquage par fluorescence de la HL-60 est souhaitée, remettre en suspension les cellules dans du RPMI sans sérum et proceed comme décrit dans la section 4. </li><li> Ajouter 0,5 ml de HL-60 suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à 24 puits cluster contenant monocouche CE et incuber la plaque dans un incubateur de culture de cellules à 37 ° C et 5% de dioxyde de carbone pour une période fixe de temps choisi entre 1 et 3 h. Peu de différence est observée entre 1 h et 3 h point dans le temps, où la saturation de liaison est atteint. </li><li> Préparer pour la cellule de lavage / récolte: Remplir un tube de 120 ml avec 100 ml de HBSS. Distribuer 1 ml de formol dans chaque puits d&#39;une plaque de 24 fraîche. </li><li> Après la période d&#39;incubation, utiliser une paire de pinces acérées et ramasser la lamelle de verre à partir du puits et maintenez la lamelle verticale et tamponner le bord de la lamelle sur un morceau de tissu sur le banc pendant 3 secondes, en prenant soin de ne pas toucher le surface recouverte de cellule de la lamelle couvre-objet avec le tissu. </li><li> En maintenant fermement la lamelle avec une paire de forceps, tremper la lamelle couvre-objet dans et hors de la HBSS à cinq reprises. </li><li> Après le cinquième dunkdans du HBSS, tamponner le bord de la lamelle couvre-objet sur le tissu pendant 3 sec. </li><li> Répétez les procédures de dunk et tamponnant décrites dans 3.6 et 3.7, soit un total de trois séries de 5 dunks suivie d&#39;une noisette. </li><li> Transférer la lamelle dans un puits contenant 10% de formol pour fixer les cellules à température ambiante. La lamelle est prêt pour le dénombrement, pour le stockage à long terme ou à être soumis à d&#39;autres procédures décrites ci-dessous. </li></ol> 4. Étiquetage des cellules HL-60 avec la cellule Tracker (facultatif) <ol><li> Compter et transférer quantité appropriée de cellules HL-60 (par exemple, 10 millions) dans un tube de 15 ml centrifugeuse. Centrifugeuse de cellules HL-60 à 200 g pendant 5 min. Retirer le surnageant. </li><li> Resuspendre le culot cellulaire dans Cell Tracker en milieu RPMI sans sérum à une concentration de 1 million de cellules / ml. Incuber les cellules dans l&#39;incubateur de culture cellulaire pendant 1 heure. </li><li> Centrifuger les cellules à 200 g pendant 5 min et jeter le surnageant. Resuspendre le culot cellulaire dans un milieu à une concentration de 2 millions de cElls / ml. </li><li> Ajouter 0,5 ml de cellules Tracker marqué HL-60 dans chaque puits contenant les cellules endothéliales cultivées sur lamelle de verre. Continuer à 3,3. </li></ol> 5. énumération de cellules endothéliales Adhésif <ol><li> Mont lamelles de microscope sur coulisse avec DAPI contre-coloration pour identifier des cellules individuelles. </li><li> En utilisant un microscope inversé avec un objectif 4X ou 10X, acquérir des images de plusieurs champs (par exemple, 5 champs) et de compter le plus grand nombre de monocytes qui regroupent sur ​​les cellules endothéliales non irradié (Ce devrait être en général 3-5). </li><li> Définissez deux fois ce nombre comme le seuil de monocytes sur une cellule endothéliale à celle définie comme un cluster. Si nécessaire, un critère différent peut être utilisé pour définir une grappe en fonction de la nature de l&#39;expérience. </li><li> Comptez le nombre de grappes et le nombre de cellules endothéliales dans le domaine. Diviser la première par la seconde pour obtenir le pourcentage de cellules endotheliales adhésives. Butde nombreux domaines pour obtenir une moyenne et écart type des comtes. </li></ol> 6. La contre-coloration avec des anticorps <ol><li> Après le test d&#39;adhésion des cellules et sur ​​la lamelle couvre-objet ont été fixés dans 10% de formaline pendant 15 minutes à la température ambiante, soumettre les lamelles couvre-objet à immunofluorescence en utilisant la procédure standard 10 et des anticorps de choix. </li><li> Ajouter et supprimer les diverses solutions très doucement pour éviter de déloger les monocytes qui sont attachés à des cellules endothéliales. </li></ol> 7. La contre la sénescence associée bêta-galactosidase activité <ol><li> Après le test d&#39;adhésion des cellules et sur la lamelle couvre-objet ont été fixés dans de la formaline pendant 15 min, la tache de l&#39;activité bêta-galactosidase associé à la sénescence, comme décrit dans les instructions qui accompagnent le kit de coloration. Ajouter et supprimer les diverses solutions très doucement pour éviter de déloger les monocytes qui sont attachés à des cellules endothéliales. </li></ol>

<ol><li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolution+of+inflammation%3A+an+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li>
<li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Clin+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li>
<li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+endothelial+cells%3A+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li>
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<li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin%2C+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li>
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<li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Le test d&#39;adhérence des monocytes décrit ci-dessus a été utilisé avec succès dans des expériences conçues pour étudier les effets biologiques des rayonnements ionisants sur des monocouches endothéliales 10. Bien que ce soit pas la seule méthode permettant d&#39;évaluer l&#39;adhérence d&#39;une monocouche endotheliale, il est la seule méthode qui permet la quantification de la proportion ou le pourcentage de cellules endotheliales au sein d&#39;une monocouche qui est adhésive. Cette distinction est importante car un changement quantitatif global de l&#39;adhérence de monocytes, tel que mesuré par d&#39;autres méthodes peut être attribué soit à une augmentation générale de l&#39;adhérence de toutes les cellules de la monocouche endothéliale ou à l&#39;augmentation de l&#39;adhésivité d&#39;une sous-population de cellules endotheliales au sein de la monocouche, comme le montre l&#39;exemple ci-dessus. L&#39;intérêt de disposer de ces informations est illustré par le fait que la possibilité de quantifier le pourcentage de cellules endotheliales qui présentaient une adhérence améliorée après irradiation a conduit aux inescapable conclusion que cet effet est pas due à une mutation génétique d&#39;un gène particulier comme le pourcentage de cellules qui étaient adhésif était grandement ci-dessus (plus de 1000 fois plus) que ce qui serait attendu de mutation aléatoire d&#39;un gène par des rayons X à cette dose . Le facteur qui permet une bonne reproductibilité des résultats est le régime de lavage. Comme le procédé de lavage implique l&#39;immersion de la lamelle de verre dans le tampon de lavage, puis en tamponnant sur un tissu, la variabilité de la turbulence de la mémoire tampon qui se pose inévitablement de la vieille méthode de l&#39;ajout de la solution de lavage dans un puits est évitée. En effet, il a été l&#39;observation de la variabilité excessive entre les répétitions obtenues en utilisant le procédé de pipetage qui nous contraint de mettre au point un procédé de lavage qui élimine l&#39;élément de variabilité de l&#39;étape de lavage. Certes, les limites de cette analyse se trouvent dans la nécessité de mener à bien comptage manuel des grappes de monocytes, qui ne not lui permettre d&#39;être adapté pour des analyses à haut débit. Deuxièmement, la décision sur la façon dont de nombreux monocytes constituent un cluster doit être déterminée semi-arbitraire et le niveau peut être réglé trop haut et aboutir à l&#39;exclusion de certains groupes d&#39;origine. Le manque de force de cisaillement dans cette méthode peut aussi être considéré comme une limitation des expériences dans lesquelles l&#39;adhérence nettement améliorée des cellules endothéliales est induite (par exemple, + TNF). Dans d&#39;autres situations cependant, le manque de force de cisaillement est un avantage, car elle permet la détection de l&#39;augmentation moins exagérée de l&#39;adhésivité. Modeste augmentation des monocytes adhésivité peut être particulièrement important et pertinent. In vivo, les monocytes ne seraient pas (dans un temps expérimental typique) devraient être de joindre en grand nombre à des cellules endothéliales avec modeste augmentation de l&#39;adhérence, en grande partie due à une force de cisaillement. Dans le temps cependant, certains monocytes ferait probablement, et cela est plus susceptible de représenter l&#39;environnement de l&#39;inflammation chronique. En tant que tel,l&#39;absence de force de cisaillement peut être un avantage, car il offre la possibilité pour les petites augmentations de l&#39;adhérence des cellules endothéliales à être révélé dans les délais expérimentales qui sont généralement de courte durée et peut-être trop éphémère pour permettre modeste augmentation de l&#39;adhérence à être observé sous la contrainte de cisaillement. La possibilité de soumettre les cellules après cet essai à d&#39;autres analyses telles que dosage de la sénescence et immunofluorescence augmente l&#39;utilité de cette méthode, car elle permet à l&#39;association de l&#39;adhérence des cellules endothéliales spécifiques aux particuliers protéines cellulaires ou états cellulaires comme démontré ci-dessus, une caractéristique qui ne sont pas disponibles avec les tests d&#39;adhésion âgées. Cette méthode a été utilisée avec des cellules humaines endothéliales coronaires et des résultats similaires EST2 immortalisées ont également été obtenus avec des cellules endothéliales coronaires humaines primaires 10, démontrant qu&#39;il est pas spécifique à juste une lignée cellulaire particulière. En outre, le bruitption de cette méthode de dosage de l&#39;adhésivité des cellules endothéliales ne font pas obstacle à soumettre les mêmes cellules pour le dosage d&#39;adhérence norme qui mesure la fluorescence des immunocytes marqués. Ensemble, ce rapport démontre que cette méthode est polyvalent, inclusive et fournit beaucoup plus d&#39;informations que le test d&#39;adhésion standard.

L&#39;infiltration de cellules immunitaires telles que les monocytes à travers la couche de cellules endotheliales qui tapissent les vaisseaux sanguins est une étape importante dans le processus d&#39;inflammation 1. Cela permet à la domiciliation des cellules immunitaires (immunocytes) à un site de la lésion. Dans d&#39;autres cas et des endroits tels que l&#39;artère coronaire et l&#39;artère carotide, l&#39;infiltration de monocytes à travers la couche endotheliale peut conduire à la résidence à long terme de ces cellules indésirables dans la paroi de l&#39;artère, pouvant conduire à la formation de plaques 2. Dans tous les cas d&#39;infiltration immunocytes, la première étape implique l&#39;activation des cellules endothéliales dans une région localisée du vaisseau sanguin. Les cellules endotheliales sont activés par des cytokines pro-inflammatoires telles que le TNF-α et IL-6 pour augmenter l&#39;expression des protéines de la surface cellulaire tels que VCAM, ICAM et la E-sélectine qui facilitent le recrutement et la fixation des immunocytes sur la surface des cellules endotheliales 3- 6. 7 endotheliales monocouche. Les limites de cette méthode en termes de précision ont conduit à l&#39;utilisation de lymphocytes radiomarqué ou un monocyte, suivie par la quantification des matières radioactives qui correspond à des lymphocytes ou monocytes adhérence 4. Cette méthode a été éventuellement remplacée par un procédé à base de fluorescence, grâce à quoi immunocytes d&#39;intérêt ont été marquées avec un colorant fluorescent et soumis à la même procédure que ci-dessus avec la différence étant que la fluorescence à la place de la radioactivité est mesurée 8. Actuellement, cette méthode a émergé comme le plus pratique et est vendu sous forme de kit par plusieurs fournisseurs commerciaux. Bien que ce test peut mesurer les niveaux relatifs de l&#39;adhérence entre les contrôles et les échantillons expérimentaux, il ne révèle pas si un changement de fluorescence est due à un changement uniforme de l&#39;adhérence sur l&#39;ensemble du endothelial population de cellules ou si le changement est dû à une différence de adhésivité dans une sous-population de cellules. Il est également évident que la rigueur du lavage exerce un profond effet sur le résultat, et plus important encore, l&#39;uniformité de rincer monocytes non liés entre différentes monocouches de cellules endothéliales aura un grand impact sur la proximité des résultats de répétitions et la reproductibilité des résultats entre les échantillons . Plus récemment, plusieurs systèmes qui pompent des monocytes dans un milieu à travers une monocouche de cellules endotheliales ont été utilisés pour remédier à ce problème 9. En outre, ces systèmes d&#39;écoulement récapitulent également l&#39;effet de la force de cisaillement sur les cellules endothéliales. Bien que les avantages de ces systèmes sont claires et très attrayant, il est également important de comprendre que, bien que l&#39;adhérence des cellules endotheliales peut être considérablement augmentée, comme cela est le cas dans l&#39;inflammation aiguë, par des facteurs tels que le TNFa, d&#39;autres activateurs, par exemple un rayonnement ionisant 10 Susciter change tchapeau ne sont pas facilement détectée dans des délais expérimentaux in vitro par ces systèmes très strictes. Bien que de tels changements minimes de l&#39;adhésivité des cellules endothéliales sont facilement manqués ou rejetés in vitro, il est pas nécessairement bénigne in vivo, où ces petites variations à l&#39;intérieur d&#39;un temps de vie, ce qui est caractéristique d&#39;une inflammation chronique, peuvent exercer des effets très significatifs. Ainsi, un procédé robuste, mais sensible et spécifique pour détecter et mesurer l&#39;adhésivité des cellules endothéliales est nécessaire. Nous rapportons ici une méthode pour mesurer l&#39;adhérence des cellules endothéliales directement. Ce procédé ne repose pas sur la mesure de la fluorescence comme indicateur de substitution indirect de adhésivité des cellules endothéliales. Il révèle si des changements dans l&#39;adhésivité sont dues au changement uniforme dans toutes les cellules ou limitée à une sous-population. En outre, il permet la co-coloration des cellules endotheliales avec des marqueurs tels que la sénescence associée à la bêta-galactosidase, la viabilité cellulaire marker, Calcien AM et des anticorps contre la surface de la cellule et des protéines intracellulaires, permettant à l&#39;association de cellules endothéliales adhésives individuelles à certains états de la cellule ou l&#39;expression de protéines spécifiques.

<table><tbody><tr><td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td><td>Sigma</td><td>H6648</td><td></td></tr><tr><td>Lamelles en verre Rond 12 mm de diamètre</td><td>Menzel-Glaser</td><td>CB00120RA1</td><td></td></tr><tr><td>Plaque d’amas à 24 puits</td><td>Costar</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Meso-Endo Cell media Cell</td><td>Applications</td><td>212-500</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Sigma</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Soja inhibiteur de la trypsine</td><td>Life Technologies</td><td>17075-029</td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Green Life</td><td>Technologies</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Sigma</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal</td><td>Life Technologies</td><td>10500064</td><td></td></tr><tr><td>Beta glasctosidase Kit de dosage &nbsp ;</td><td>CellSignaling</td><td>9860</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>Sigma</td><td>F0895</td><td></td></tr></tbody></table>

la quantification des cellules endothéliales adhésivité<em&gt; in vitro</em

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

L&#39;un des procédés cardinaux de l&#39;inflammation est l&#39;infiltration de cellules immunitaires de la lumière du vaisseau sanguin vers le tissu environnant. Cela se produit lorsque les cellules endotheliales, qui tapissent les vaisseaux sanguins, deviennent adhésif pour faire circuler des cellules immunitaires telles que les monocytes. In vitro mesure de cette adhésivité a jusqu&#39;à présent été effectuée en quantifiant le nombre total des monocytes qui adhèrent à une couche endotheliale soit comme un comptage direct ou par mesure indirecte de la fluorescence de monocytes adhérents. Bien que de telles mesures font indiquer l&#39;adhérence moyenne de la population de cellules endothéliales, ils se confondent en un certain nombre de facteurs, comme le nombre de cellules, et ne révèlent pas la proportion des cellules endotheliales qui sont réellement adhésif. Ici, nous décrivons et démontrons une méthode qui permet le dénombrement des cellules adhérentes dans une population éprouvée de monocouche endothéliale. Les cellules endothéliales sont cultivées sur des lamelles de verre et suivants souhaitéstraitement sont mis au défi avec des monocytes (qui peut être marqué par fluorescence). Après incubation, une procédure de rinçage, impliquant de multiples cycles d&#39;immersion et drainage, les cellules sont fixées. Adhésif cellules endotheliales, qui sont entourés par les monocytes sont facilement identifiés et dénombrés, ce qui donne un indice d&#39;adhérence révèle que la proportion réelle des cellules endotheliales au sein de la population qui sont adhésif.

Cette méthode permet la détection de cellules endotheliales adhésifs individuels au sein d&#39;une population. Par exemple, alors qu&#39;une monocouche de cellules endothéliales non irradié conservé quelques sporadiques HL-60 monocytes après incubation et lavage, monocouche endothéliale à 7 jours après l&#39;irradiation 10Gy avant l&#39;incubation avec des monocytes ont été liés par les monocytes en grappes autour des cellules endothéliales individuels ( Figure 1). Bien que ce phénomène est facilement observable sous microscope à contraste de phase, de microscopie par fluorescence révèle une image encore plus claire des grappes de monocytes. Après avoir effectué le test d&#39;adhésion décrit, il est possible de procéder à la coloration des cellules à membrane, cytoplasmique ou nucléaire (figure 2) des protéines en utilisant des anticorps appropriés avec les méthodes d&#39;immunofluorescence standard. De plus, un dosage à base d&#39;enzymes telles que la bêta-galactosidase de sénescence associée (figure 3) peut également être performed. Etant donné que chaque groupe de monocytes correspond à une cellule endothéliale individu, le dénombrement des grappes révèle le nombre réel de cellules endothéliales d&#39;adhésif à l&#39;intérieur de la monocouche (figure 4), et donc le pourcentage de cellules endotheliales adhésifs au sein de la population (tableau 1, figure 6) . Ceci est la seule méthode qui permet à ce jour de tels quantification adhésivité des cellules endothéliales. Il est à noter que les cellules endotheliales utilisés dans les expériences ici sont inhibées par contact et ne pas augmenter en nombre, après avoir atteint la confluence. Ceci élimine la complexité potentiel posé par l&#39;augmentation du nombre des cellules endotheliales à des points de temps ultérieurs. Si on le souhaite, les monocytes attachés aux monocouches endotheliales peuvent être délogées par une solution de trypsine-EDTA 0,2% 0,5% (au lieu de la fixation à 3,9) et leur fluorescence mesurées en utilisant un lecteur de plaque, comme cela est le cas dans les méthodes actuelles (Figure 5). </p&gt; <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> Figure 1. L&#39;adhérence des monocytes sur la monocouche de cellules endothéliales. Sur les cellules endothéliales non irradié, les monocytes adhérant sous forme de cellules individuelles d&#39;une manière sporadique et aléatoire (panneaux de gauche) et dans des clusters sur des cellules endotheliales individuelles des 7 jours après l&#39;irradiation de 10 Gy monocouche (des panneaux de droite). Panneaux inférieurs sont des images de fluorescence des panneaux supérieurs, confirmant que les petites et lumineuses cellules sphériques visibles en contraste de phase sont en effet des monocytes qui ont été pré-étiquetés avec Cell-Tracker vert. Certaines des grappes de monocytes sont indiqués par des flèches blanches. Les images ont été prises en utilisant un objectif 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <html><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> Figure 2. Coloration des cellules endotheliales pour le dosage des protéines post-adhésion. Après avoir effectué le test d&#39;adhésion décrit, les cellules sur les lamelles de verre ont été soumis à immunofluorescence pour la détection de (A) la protéine de membrane (CD44), b) une protéine cytoplasmique (Tubulin) ou c) une protéine nucléaire (γ-H2AX). Panneaux de gauche de (A) et (B) (vu avec objectif 20X) montrent des monocytes pré-étiquetés avec la revue Cell Tracker vert et l&#39;image semblable sur les panneaux de droite révèlent CD44 et des microtubules (rouge) et les noyaux DAPI-colorés (bleus). Les flèches blanches dans (C) le point de noyaux de cellules endothéliales irradiées qui ont été colorées avec des anticorps contre γ-H2AX. noyaux de monocytes qui sont colorées d&#39;un bleu plus lumineux par DAPI sont facilement distingués des ovales noyaux des cellules endothéliales. Les images ont été prises avec l&#39;objectif 20X.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> Figure 3. La sénescence associée à la bêta-galactosidase coloration des cellules endotheliales. Après analyse de l&#39;adhérence, les cellules sur des lamelles ont été soumises à une coloration de la sénescence associée à la bêta-galactosidase qui provoque lysosomes des cellules sénescentes à virer au bleu, comme on le voit dans la cellule endotheliale que est sélectivement lié par de nombreux monocytes, qui sont facilement identifiables en raison de leur petite taille et de forme sphérique. Image vue à travers l&#39;objectif 20X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; Figure 4. Énumération des grappes de monocytes sur les cellules endothéliales individuels. Après analyse de l&#39;adhérence, des images de cellules ont été prises à partir de plusieurs positions différentes et des grappes de monocytes identifiés et encerclé (en vert). Un groupe a été défini comme une agglomération de 10 ou plus de monocytes sur une cellule endothéliale. Le nombre de grappes de monocytes et le nombre de 12 jours cellules endothéliales post-irradiés (pointillé rouge) dans l&#39;image ont été comptées et le pourcentage de cellules endothéliales adhérentes calculées comme indiqué dans le tableau 1. Image prise par objectif 10X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une plus grande version de ce chiffre.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> Figure 5. Quantification de la fluorescence de monocytes adhérents. Après adhé<html> sion de dosage, les cellules sur des lamelles de verre ont été trypsinées et la fluorescence de monocytes pré-marqué avec CellTracker vert a été mesurée en utilisant un lecteur de plaques de fluorescence, comme un indicateur indirect de l&#39;adhésivité de la monocouche endothéliale. Les résultats de ces mesures à des jours indiqués post-irradiation ont été obtenus et tressé sur le graphique ci-dessus. <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> Figure 6. Représentation de dosage d&#39;adhérence scores au tableau 1. Les cellules endothéliales adhésives dans cinq endroits différents sur trois lamelles de verre ont été marqués comme décrit dans la figure 4 et les résultats sous forme de tableau ci-dessus démontre que 12 jours après 10 Gy d&#39;irradiation, de 8 à 10 pour cent des irradié les cellules endothéliales sont devenus adhésif. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; Pourcentage d&#39;adhésif cellules endotheliales </td></tr><tr><td></td><td> Disc 1 </td><td> Disc 2 </td><td> Disc 3 </td></tr><tr><td> Champ 1 </td><td> 8,65 </td><td> 8.29 </td><td> 8.21 </td></tr><tr><td> Champ 2 </td><td> 10,44 </td><td> 7.27 </td><td> 7.21 </td></tr><tr><td> Champ 3 </td><td> 9,63 </td><td> 9.05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> Champ 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7,09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> Champ 5 </td><td> 10,55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> Moyenne </td><td> 10.07 </td><td> 8.22 </td><td> 8,75 </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Essai d&#39;adhésion scores. Cellules endothéliales adhésives dans cinq endroits différents sur trois lamelles de verre ont été marqués comme décrit dans Figure 4 et les résultats sous forme de tableaux ci-dessus montrant que 12 jours après l&#39;irradiation de 10 Gy, de 8 à 10 pour cent des cellules endothéliales irradiées est devenu adhésif.

Nous rapportons une méthode in vitro qui permet de quantifier le nombre réel de cellules adhésives au sein d’une monocouche de cellules endothéliales.

La quantification des cellules endothéliales adhésivité<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

L'objectif général de cette procédure est de quantifier l'adhésivité des cellules endothéliales in vitro. Cette étape est réalisée en préparant d'abord des lamelles recouvertes de fibronectine dans une plaque à 24 puits. Des cellules endothéliales de l'artère coronaire humaine sont ensuite appliquées sur les lamelles en verre et incubées jusqu'à la formation d'une monocouche confluente de cellules endothéliales.Après l'administration du traitement souhaité aux cellules endothéliales, des monocytes marqués au fluorochrome sont ajoutés sur les lamelles de verre et incubés avec la monocouche de cellules endothéliales. La dernière étape consiste à éliminer les monocytes non liés de la monocouche endothéliale par une procédure de trempage et de lavage minutieuse des lamelles. En fin de compte, cette méthode permet de quantifier le pourcentage d'une population de cellules endothéliales adhésives après un traitement particulier.L'avantage principal de cette technique est qu'elle mesure le nombre réel ou le pourcentage de cellules endothéliales adhésives, par opposition à l'adhérence globale d'une monocouche endothéliale telle qu'elle est mesurée par toutes les méthodes actuelles. Nous avons eu l'idée de cette méthode lorsque nous avons tenté de mesurer les ADI des cellules endothéliales à l'aide des méthodes actuellement disponibles, en rencontrant des variations inacceptables dans les résultats dues à des difficultés techniques inhérentes à ces méthodes. Stérilisez des lamelles rondes en verre de 12 millimètres de diamètre en les faisant tremper dans de l'éthanol à 70 % pendant au moins 10 minutes, avec une agitation occasionnelle pour garantir une exposition totale de toutes les lamelles à l'éthanol.Ensuite, placez tous les lamelles en verre et l'éthanol dans une boîte de culture cellulaire stérile à l'aide d'une paire de fines pinces stériles n°5 B. Saisissez et placez chaque lamelle en verre individuellement dans un puits d'une plaque multicellulaire 24 puits. Veillez à ce que les lamelles ne touchent pas les parois du puits et soient positionnées approximativement au centre. Laissez la plaque multicellulaire 24 puits non couverte, avec les lamelles en verre, sécher dans l'enceinte de flux laminaire.Cela prend environ 10 minutes. Lorsque les lamelles sont sèches, j'ajoute délicatement 100 microlitres de solution d'encollage sur chaque lamelle en verre de manière à ce que la solution recouvre uniquement le verre, sans s'étendre à l'extérieur du puits. Placer la plaque multicellulaire 24 puits recouverte dans une étuve à culture cellulaire pendant au moins une heure.Incubez les cellules endothéliales humaines de l'artère coronaire dans un milieu à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Aspirez le milieu de culture et rincez la monocouche de cellules endothéliales avec 10 millilitres de solution saline équilibrée de Hank (HBSS). Aspirez ensuite le HBSS et ajoutez 2 millilitres d'une solution de 0,5 % de trypsine contenant 0,2 % d'EDTA. Incubez à température ambiante pendant environ cinq minutes, jusqu'à ce que les cellules endothéliales se détachent suite à une tape légère sur le flacon. Ajoutez alors 5 millilitres d'inhibiteur de la trypsine de soja en pulvérisant la surface du flacon. Pour faciliter le détachement des cellules, transférez-les dans un tube de 15 millilitres et centrifugez le tube à 200 × g pendant cinq minutes. Aspirez le surnageant et resuspendez le culot endothélial dans 5 millilitres de milieu.Compter les cellules à l'aide d'un hémocytomètre et ajuster la concentration cellulaire à 50 000 cellules endothéliales par millilitre de milieu. Distribuer un millilitre de la suspension cellulaire dans chaque puits d'une plaque de 24 puits contenant des lamelles de verre revêtues, puis incuber les cellules toute la nuit dans une incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Les cellules sont alors prêtes pour le traitement souhaité.Lorsqu'une monocouche confluente est formée en trois jours, transférez les cellules HL 60 cultivées dans du RPMI supplémenté avec 10 % de sérum de veau fœtal dans un tube de 15 millilitres et centrifugez les cellules à 200 ×g pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le surnageant et resuspendez les cellules dans cinq millilitres de milieu sans sérum pour l'étiquetage par fluorescence des cellules HL 60. Comptez et transférez la quantité appropriée de cellules dans un tube de centrifugation de 15 millilitres.Centrifuger les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes. Après avoir retiré le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans le traceur de cellules dans notre milieu PMI sans sérum. À une concentration d'un million de cellules par millilitre, incuber les cellules dans l'incubateur de culture cellulaire pendant une heure ; après l'incubation, centrifuger les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes et éliminer le surnageant Reese.Suspendre les cellules dans le milieu à une concentration de 2 millions de cellules par millilitre. Ajouter un millilitre de suspension de cellules HL-60 marquées au traceur cellulaire dans chaque puits de la plaque multicellulaire à 24 puits contenant la monocouche de cellules endothéliales, puis incuber la plaque dans une étuve à culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une durée fixe choisie comprise entre une et trois heures. Après la période d'incubation, utiliser une paire de forceps fins n°5, soulever la lame de verre du puits en ne déchirant que le bord externe de la lame, puis tamponner le bord de la lame.Glissez un morceau de papier absorbant sur la paillasse pendant trois secondes. Veillez à ne pas toucher la surface du coverslip recouverte de cellules avec le papier absorbant, tout en tenant fermement le coverslip avec une pince. Immergez le coverslip dans le HBSS et retirez-le cinq fois ; après la cinquième immersion.HBSS, tamponnez le bord de la lame. Faites glisser le tissu pendant trois secondes. Répétez les procédures d'immersion et de tamponnement pour un total de trois séries de cinq immersions suivies chacune d'un tamponnement.Ensuite, transférez la lame couvre-objet dans un puits contenant la formule Tencent pour fixer les cellules à température ambiante. La lame est prête à être utilisée pour le dénombrement, pour un stockage à long terme ou pour subir une contre-coloration pour la détection d'anticorps ou de l'activité de la bêta-galactosidase associée au vieillissement cellulaire, comme décrit dans le protocole. Pour dénombrer les cellules endothéliales adhérentes, montez les lames couvre-objets sur des lamelles de microscope avec une contre-coloration DPI afin d'identifier les cellules individuelles à l'aide d'un microscope inversé muni d'un objectif x4 ou x10. Acquérez des images de plusieurs champs et comptez le nombre maximal de monocytes s'agrégeant sur les cellules endothéliales non irradiées.Définissez le double de ce nombre comme seuil de monocytes sur une cellule endothéliale pour être considérée comme un agrégat, si nécessaire. Un critère différent peut être utilisé pour définir un agrégat selon la nature de l'expérience. Comptez le nombre d'agrégats et le nombre de cellules endothéliales dans le champ.Divisez le nombre de cellules par ce dernier pour obtenir le pourcentage de cellules endothéliales adhérentes. Analysez plusieurs champs afin d'obtenir une moyenne et un écart-type des dénombrements. Les monocouches endothéliales sept jours après une irradiation grise, avant incubation avec les monocytes, présentaient des monocytes adhérés en amas autour de cellules endothéliales individuelles.Bien que ce phénomène soit facilement observable en contraste de phase, la microscopie à fluorescence révèle une image encore plus nette des agrégats de monocytes. Après avoir réalisé le test ADI décrit, il est possible de procéder à la coloration des cellules pour les protéines membranaires, cytoplasmiques ou nucléaires à l'aide d'anticorps appropriés. En utilisant des méthodes standard d'immunofluorescence, veillez à bien effectuer les étapes de lavage, car une force excessive peut détacher les monocytes.En outre, des dosages enzymatiques, tels que la bécyase associée à la sénescence, peuvent être réalisés. Ce dosage fait virer au bleu les lysosomes des cellules sénescentes, comme on peut l'observer dans la cellule endothéliale qui est spécifiquement colonisée par de nombreux monocytes, identifiables par leur petite taille et leur forme sphérique. Puisque chaque agrégat de monocytes correspond à une cellule endothéliale individuelle, le dénombrement des agrégats permet de déterminer le nombre réel de cellules endothéliales adhésives au sein de la monocouche, et donc le pourcentage de cellules endothéliales adhésives dans la population.Il s'agit à ce jour de la seule méthode permettant, si souhaité, la quantification de l'adhésivité des cellules endothéliales. Les monocytes fixés sur des monocouches endothéliales peuvent être détachés à l'aide d'une solution de trypsine-EDTA, et la fluorescence peut être mesurée à l'aide d'un lecteur de plaques, comme c'est le cas dans les méthodes contemporaines. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures avec très peu de manipulation directe. Il est important de se rappeler que toutes les étapes de lavage et d'immersion doivent être effectuées de manière identique et avec le même nombre de répétitions pour tous les échantillons selon cette procédure.D'autres méthodes, telles que l'immunofluorescence et les dosages de bêta-galactosidase associés à la sénescence, peuvent être réalisées afin de répondre à des questions complémentaires, comme quelles sont les caractéristiques des cellules endothéliales adhésives par rapport à celles qui ne le sont pas.

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