La quantification des cellules endothéliales adhésivité In Vitro

L’objectif global de cette procédure est de quantifier l’adhérence des cellules endothéliales in vitro. Ceci est accompli en préparant d’abord des lamelles enrobées de fibronectine dans une plaque de grappe de 24 mondes. Les cellules endothéliales de l’artère coronaire humaine sont ensuite appliquées sur les lamelles de verre et laissées à incuber jusqu’à ce qu’une monocouche de cellules endothéliales confluentes se forme.

Après l’administration du traitement souhaité aux cellules endothéliales, les monocytes marqués par fluorescence ajoutés aux lamelles de verre sont incubés et incubés avec la monocouche de cellules endothéliales. La dernière étape est l’élimination des monocytes non liés de la monocouche endothéliale par une procédure méticuleuse de trempage et de lavage des lamelles. En fin de compte, cette méthode permet de quantifier le pourcentage d’une population de cellules endothéliales qui est adhésive après un traitement particulier.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle mesure le nombre ou le pourcentage réel de cellules endothéliales adhésives par opposition à l’adhérence globale d’une monocouche endothéliale telle que mesurée par toutes les méthodes actuelles. Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous avons tenté de mesurer les DJA des cellules endothéliales à l’aide des méthodes actuellement disponibles et que nous avons rencontré une variation inacceptable des résultats en raison des défis techniques inhérents à ces méthodes. Des lamelles en verre rond stérilisées de 12 millimètres de diamètre en les trempant dans de l’éthanol à 70 % pendant au moins 10 minutes avec une agitation occasionnelle pour assurer une exposition totale de toutes les lamelles à l’éthanol.

Ensuite, tout le couvercle en verre glisse et l’éthanol dans une boîte de culture cellulaire stérile avec une paire de pinces fines stériles à cinq B. Prenez et placez chaque glissière de couvercle en verre dans un puits d’une plaque de grappe de 24 puits. Prenez soin de vous assurer que les lamelles ne touchent pas la taille du puits et se trouvent à peu près au milieu du puits, laissez sécher la plaque de cluster 24 monde découverte avec des lamelles de recouvrement en verre dans l’armoire à flux.

Cela prend environ 10 minutes. Lorsque les lamelles sont sèches, j’applique 100 microlitres de solution de revêtement sur chaque lamelle de verre afin que la solution ne recouvre que le verre sans tirer sur l’extérieur du puits. Placez la plaque de grappe de 24 puits couverte dans un incubateur de culture cellulaire pendant au moins une heure.

Culture, les cellules endothéliales de l’artère coronaire humaine dans un milieu à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone aspirent le milieu de culture et rincent la monocouche de cellules endothéliales avec 10 millilitres de solution saline équilibrée de Hank ou HBSS, puis aspirent le HBSS à deux millilitres de 0,5 % dans une solution d’EDTA à 0,2 % et incubent à température ambiante pendant environ cinq minutes lorsque les cellules endothéliales peuvent être délogées par un tapotement sur le côté de la fiole. À cinq millilitres d’inhibiteur de trypsine de soja giclant la surface du flacon. Pour déloger davantage les cellules, transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres et centrifugez le tube à 200 fois G pendant cinq minutes, aspirez le supinate et remettez en suspension la pastille endothéliale dans cinq millilitres de milieu.

Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre et ajustez la concentration cellulaire à 50 000 cellules endothéliales par millilitre de milieu. Versez un millilitre de suspension cellulaire dans chaque puits de la plaque à 24 puits contenant des lamelles de couverture en verre revêtu Incuber les cellules pendant la nuit dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius plus 5 % de dioxyde de carbone. Les cellules sont prêtes pour le traitement souhaité.

Lorsqu’une monocouche confluente se forme dans les trois jours, transfère les cellules HL 60 qui sont cultivées dans le RPMI et est complétée par 10 % de sérum de veau fœtal dans un tube de 15 millilitres et centrifuge les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes. Ensuite, retirez le supinate et remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de milieu sans sérum pour le marquage par fluorescence des cellules HL 60. Comptez et transférez la quantité appropriée de cellules dans un tube à centrifuger de 15 millilitres.

Centrifugez les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes. Après avoir retiré le supinate, mettez à nouveau en suspension la pastille cellulaire dans le traqueur cellulaire dans notre milieu PMI sans sérum. À une concentration de 1 million de cellules par millilitre, incuber les cellules dans l’incubateur de culture cellulaire pendant une heure après l’incubation, centrifuger les cellules à 200 fois G pendant cinq minutes et jeter le supinate Reese.

Suspendez le pal cellulaire dans le milieu à une concentration de 2 millions de cellules par millilitre. Ajoutez un millilitre de suspension de cellules HL 60 dans chaque puits de la plaque de grappe de 24 puits contenant la monocouche de cellules endothéliales et incubez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une période de temps fixe choisie entre une et trois heures après la période d’incubation. À l’aide d’une paire de pinces fines à cinq B, ramassez la lamelle en verre du puits, en ne déchirant que le bord extérieur de la lamelle de couverture, à la fois la lamelle et tamponnez le bord de la couverture.

Glissez un morceau de mouchoir sur le banc pendant trois secondes. En prenant soin de ne pas toucher la surface recouverte de cellules de la gaine avec le mouchoir qui maintient fermement la gaine à l’aide d’une paire de pinces. Dunkez le couvercle glisser dans et hors du HBSS cinq fois après le cinquième dunk.

HBSS tamponnez le bord du couvercle. Glissez sur le mouchoir pendant trois secondes. Répétez les procédures de dunk et de dabbing pour un total de trois séries de cinq dunks suivis d’un dab.

Ensuite, transférez le couvercle dans un puits contenant la formule Tencent pour fixer les cellules à température ambiante. La lamelle de couleur est prête pour le dénombrement en vue d’un stockage à long terme ou pour être soumise à une contre-coloration pour les anticorps ou à l’activité bêta-galacto sase associée à la sénescence, comme décrit dans le protocole de texte pour énumérer les cellules endothéliales adhésives, monter les lamelles de couverture sur des lames de microscope avec contre-coloration DPI pour identifier les cellules individuelles à l’aide d’un microscope inversé avec un objectif fourex ou 10 x. Acquérez des images de plusieurs champs et comptez le plus grand nombre de monocytes qui s’agrègent sur des cellules endothéliales non éradiquées.

Fixez deux fois ce nombre comme seuil de monocytes sur une cellule endothéliale à définir comme un cluster si nécessaire. Un critère différent peut être utilisé pour définir un cluster en fonction de la nature de l’expérience. Comptez le nombre de grappes et le nombre de cellules endothéliales dans le champ.

Divisez la forme par cette dernière pour obtenir le pourcentage de cellules endothéliales adhésives. Évaluez de nombreux champs pour obtenir une moyenne et un écart-type des comptes. Les monocouches endothéliales, sept jours après le rayonnement gris avant l’incubation avec des monocytes, étaient liées par des monocytes en grappes autour des cellules endothéliales individuelles.

Bien que ce phénomène soit facilement observable sous contraste de phase, la microscopie à fluorescence révèle une image encore plus claire des amas de monocytes. Après avoir effectué le test ADI décrit, il est possible de procéder à la coloration des cellules pour les protéines cytoplasmiques ou nucléaires membranaires à l’aide d’anticorps appropriés. Avec les méthodes d’immunofluorescence standard, faites attention aux étapes de lavage car une force excessive peut déloger les monocytes.

De plus, des tests enzymatiques tels que la bécyase associée à la sénescence peuvent être effectués. Cela fait que les lysosomes des cellules sénescentes deviennent bleus, comme en témoigne la cellule endothéliale qui est sélectivement liée par de nombreux monocytes identifiés en raison de leur petite taille et de leur forme sphérique. Étant donné que chaque amas de monocytes correspond à une cellule endothéliale individuelle, le dénombrement des amas révèle le nombre réel de cellules endothéliales adhésives au sein de la monocouche et donc le pourcentage de cellules endothéliales adhésives au sein de la population.

C’est la seule méthode à ce jour qui permet de quantifier l’adhérence des cellules endothéliales si on le souhaite Les monocytes attachés aux monocouches endothéliales peuvent être délogés par une solution de trypsine EDTA, et la fluorescence mesurée à l’aide d’un lecteur de plaques comme c’est le cas dans les méthodes contemporaines. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures et avec très peu de temps pratique. Il est important de se rappeler que toutes les étapes de lavage et de trempage doivent être effectuées de manière identique et avec le même nombre de répétitions entre tous les échantillons suivant cette procédure.

D’autres méthodes telles que les dosages bêta-galacto associés à l’immunofluorescence et à la sénescence peuvent être effectuées afin de répondre à des questions nationales telles que quelles sont les caractéristiques des cellules endothéliales qui sont adhésives par rapport à celles qui ne le sont pas.