Lecture simple de vrac numériques acide nucléique quantification dosages

L'objectif général de cette procédure est de simplifier la lecture des tests en gouttelettes numériques à l'aide d'un appareil de PCR en temps réel classique permettant de mesurer la fluorescence globale du test. Cette approche s'effectue en deux étapes : premièrement, la préparation des réactions d'amplification à partir des échantillons d'intérêt et de deux standards, suivie de la formation de gouttelettes afin de répartir chacun de ces échantillons en milliers de réacteurs de taille nanolitrique. La deuxième étape consiste à incuber les gouttelettes afin d'amplifier les acides nucléiques présents dans chacune d'elles.

Ensuite, la fluorescence globale de chaque échantillon ou étalon est mesurée à l’aide d’un QPC standard ou d’un thermocycleur. La dernière étape consiste à prédire la fraction de gouttelettes fluorescentes dans les échantillons d’intérêt à l’aide d’une courbe standard générée à partir des échantillons étalons. Pour vérifier les performances de cette méthode, la microscopie fluorescente peut être utilisée afin d’évaluer indépendamment la performance de quantification du test de fluorescence globale.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le comptage de gouttelettes est qu'elle ne nécessite pas d'instrumentation spécialisée avant le début de cet essai de réparation. Tous les réactifs nécessaires, comme indiqué dans le texte du protocole, sont deux standards : un contrôle sans matrice, tel que de l'eau sans nuclease, et une concentration élevée de matrice, telle que de l'ADN lambda. Dénaturez 3,3 microlitres de chaque standard avec 3,3 microlitres de tampon de dénaturation dans un tube A-Q-P-C-R.

Incubez-le à température ambiante pendant trois minutes. Éteignez chaque réaction avec 3,3 microlitres de tampon de neutralisation. De même, dénaturez 3,3 microlitres du modèle d'intérêt avec 3,3 microlitres de tampon de dénaturation, incubé à température ambiante pendant trois minutes.

Éteindre avec 3,3 microlitres de tampon de neutralisation. Préparer 11 microlitres de mélange maître par échantillon pour réduire les faux positifs. Exposer le mélange maître à la lumière UV avant la formation des gouttelettes.

Préparez d'abord 10 microlitres de mélange prémix par échantillon dans un tube transparent de 0,5 millilitre ou 1,5 millilitre placé sur de la glace. Le mélange prémix est composé d'un oligonucléotide randomisé, d'un tampon de réaction de polymérase B-S-A-D-N-A, de dn, de NTPs et d'eau sans nucléase. Placez le tube dans de l'eau sur de la glace et exposez-le à la lumière UV après l'exposition aux UV.

Associer le colorant de liaison A-D-S-D-N-A et l'aliment témoin au mélange de prémélange. Ajouter la polymérase ADN PHI 29 en dernier afin de s'assurer que la polymérase n'entre pas en contact avec des niveaux de pH nettement supérieurs ou inférieurs à 7,5. Bien mélanger, combiner 10 microlitres de matrice dénaturée ou d'étalon et 10 microlitres du mélange maître, puis bien mélanger.

Étant donné que les gouttelettes peuvent être très sensibles à l'électricité statique et aux contraintes de cisaillement, l'expérimentateur doit retirer les vêtements susceptibles de produire de l'électricité statique et se mettre à la terre avant de former les gouttelettes. Le dispositif microfluidique utilisé pour cette démonstration a été fabriqué en interne et comporte une entrée pour l'huile et deux entrées aqueuses, ainsi qu'un point de convergence hydrodynamique permettant la génération de gouttelettes. Utilisez deux pompes à seringue pour contrôler les débits de 55 microlitres d'huile contenant un tensioactif et de 20 microlitres de mélange réactionnel à travers la puce microfluidique.

Pour générer 20 001 gouttelettes de nanolitre, l'une des étapes les plus difficiles consiste à recueillir les gouttelettes sans perturber l'émulsion. Il est important de pipeter lentement et de préférence d'utiliser une pointe large.

Recueillir toutes les gouttelettes dans des tubes PCR pour chaque échantillon. Répartir 30 microlitres d’huile dans des tubes PCR neufs munis de bouchons optiques à l’aide d’une pointe à large orifice et en pipetant très lentement. Transférer 20 microlitres de gouttelettes au-dessus de l’huile.

Les volumes constants garantissent que le test soit aussi précis que possible. Fermer hermétiquement les bouchons des tubes, car des bouchons desserrés permettraient à l'huile de s'évaporer ; manipuler les tubes contenant l'émulsion par le haut du tube, le plus loin possible de l'émulsion. Un thermocycleur PCR, un thermocycleur A-Q-P-C-R ou une plaque chauffante peut être utilisé pour l'amplification isotherme.

Un thermocycleur A-Q-P-C-R est utilisé dans cette démonstration. Incubez les échantillons pendant sept heures à 30 degrés Celsius et inactiver pendant une minute à 75 degrés Celsius. Immédiatement après la réaction et l'activation.

Mesurez les niveaux de fluorescence pour tous les échantillons à l'aide du thermocycleur QPCR. Pour chaque échantillon, divisez l'intensité de fluorescence du colorant D DS liant l'ADN par l'intensité de fluorescence du colorant de référence.

Soustrayez la fluorescence de fond ou la fluorescence normalisée du témoin sans matrice à toutes les échantillons. Établissez une courbe standard linéaire en utilisant les mesures de fluorescence corrigées des étalons. Le témoin sans matrice représente la fluorescence d’un échantillon contenant 0 % de gouttelettes fluorescentes et une concentration élevée de matrice.

La mesure de fluorescence correspond à la fluorescence attendue pour un échantillon présentant 100 % de gouttelettes fluorescentes, en utilisant la courbe standard correspondante. Prédire les rapports intermédiaires de gouttelettes positives et négatives en fonction de leur fluorescence en volume. Cette méthode utilise un appareil conventionnel de PCR en temps réel pour mesurer la fluorescence en volume des tests digitaux basés sur des gouttelettes.

Des gouttelettes fluorescentes et non fluorescentes ont été pré-mélangées selon différents rapports, et une comparaison a été effectuée entre la fluorescence en volume et la fraction de gouttelettes positives. Comme prévu, la fluorescence en volume et le nombre de gouttelettes positives augmentent linéairement avec la fraction d'entrée de gouttelettes fluorescentes. Les rapports prédits, basés sur des étalons, ont été comparés aux fractions d'entrée fluorescentes attendues.

La ligne indique la valeur attendue dans le cas d'une relation linéaire. Les résultats montrent une bonne performance dans la quantification du rapport de gouttelettes sur deux ordres de grandeur de la plage dynamique. Pour tester cette méthode dans un dosage réel de multiplication génomique quantitative, les niveaux de fluorescence et les fractions de gouttelettes positives d'une gouttelette numérique.

Des mesures de l'essai MDA ont été effectuées avec des concentrations croissantes d'ADN matrice Lambda. La ligne indique la fraction fluorescente attendue, calculée à l'aide de la distribution de Poisson pour modéliser les données expérimentales. Des images fluorescentes représentatives des gouttelettes sont présentées ; la fluorescence globale ainsi que la fraction de gouttelettes positives issues des échantillons MDA numériques évoluent comme prévu en fonction du nombre moyen de matrices par gouttelette, indiquant que la mesure en masse peut fidèlement refléter le résultat d'un essai numérique.

Cette méthode peut bénéficier à d'autres tests numériques, comme la PCR numérique, en accélérant la parallélisation et en simplifiant la lecture des résultats des tests.