Lecture simple de vrac numériques acide nucléique quantification dosages

L’objectif global de cette procédure est de simplifier la lecture des dosages numériques de gouttelettes à l’aide d’un instrument PCR conventionnel en temps réel pour mesurer la fluorescence apparente du test. Pour ce faire, il faut d’abord préparer des réactions d’amplification des échantillons d’intérêt, deux étalons, et former des gouttelettes pour les répartir en milliers de réacteurs de taille nanométrique. La deuxième étape consiste à incuber les gouttelettes pour amplifier les acides nucléiques dans chaque gouttelette.

Ensuite, la fluorescence apparente de chaque échantillon ou étalon est mesurée à l’aide d’un QPC ou d’un thermocycleur standard. La dernière étape consiste à prédire la fraction de gouttelettes fluorescentes dans les échantillons d’intérêt à l’aide d’une courbe standard générée à partir des échantillons standard. Pour vérifier les performances de cette méthode, la microscopie fluorescente peut être utilisée pour évaluer indépendamment les performances de quantification du test de fluorescence en vrac.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que le comptage de gouttelettes est qu’elle ne nécessite pas d’instrumentation spécialisée avant de commencer cette réparation de test. Tous les réactifs nécessaires, tels que décrits dans le texte du protocole, deux étalons sont requis. L’un, sans contrôle de matrice, tel que l’eau exempte de nucléases, et une concentration élevée de matrice telle que lambda, l’ADN, dénaturent 3,3 microlitres de chaque étalon avec 3,3 microlitres de tampon de dénaturation dans le tube A-Q-P-C-R.

Incuber à température ambiante pendant trois minutes. Tremper chacun avec 3,3 microlitres de tampon de neutralisation. De même, dénaturer 3,3 microlitres du modèle d’intérêt avec 3,3 microlitres de tampon de dénaturation incubé à température ambiante pendant trois minutes.

Trempe avec 3,3 microlitres de tampon de neutralisation. Préparez 11 microlitres de mélange maître par échantillon pour moins de positifs ou de faux positifs. Exposez le mélange principal à la lumière UV avant de former des gouttelettes.

Tout d’abord, préparez 10 microlitres de mélange de prémélange par échantillon dans un tube transparent de 0,5 millilitre ou 1,5 millilitre sur de la glace. Le mélange de prémélange se compose d’oligo randomisés, d’un tampon réactionnel polymérase B-S-A-D-N-A, de dn, de NTP et d’eau exempte de nucléases. Placez le tube dans de l’eau sur de la glace et exposez-le à la lumière UV après l’exposition aux UV.

Colorant liant A-D-S-D-N-A et régime de référence au mélange de prémélange. Ajoutez l’ADN polymérase PHI 29 en dernier pour vous assurer que la polymérase ne rencontre pas de niveaux de pH beaucoup plus élevés ou inférieurs à 7,5. Bien mélanger, combiner 10 microlitres de gabarit dénaturé ou standard et 10 microlitres du mélange maître, bien mélanger.

Étant donné que les gouttelettes peuvent être très sensibles à l’électricité statique et au stress pur, l’expérimentateur doit retirer les vêtements qui peuvent provoquer de l’électricité statique et se mettre à la terre avant de former des gouttelettes. Le dispositif microfluidique utilisé pour cette démonstration a été produit en interne et dispose d’une entrée d’huile et de deux entrées aqueuses avec une jonction de focalisation d’écoulement pour générer des gouttelettes. Utilisez deux pousse-seringues pour contrôler les débits de 55 microlitres d’huile avec tensioactif et de 20 microlitres de mélange réactionnel à travers la puce microfluidique.

Pour générer 20 001 nanolitres de gouttelettes, l’une des étapes les plus difficiles consiste à collecter les gouttelettes sans perturber l’émulsion. Il est important de pipeter lentement et de préférence. Utilisez une pointe de planche large.

Collectez toutes les gouttelettes dans des tubes PCR pour chaque échantillon. Aliquote 30 microlitres d’huile dans des tubes PCR frais avec des capuchons optiques à l’aide d’une pointe à large alésage et en pipetant très lentement. Transférez 20 microlitres de gouttelettes sur l’huile.

Les volumes constants garantissent que le test est aussi précis que possible. Fermez hermétiquement les bouchons des tubes, car les bouchons desserrés permettront à l’huile de s’évaporer par le haut du tube, aussi loin que possible de l’émulsion. Un thermocycleur PCR, un thermocycleur A-Q-P-C-R ou une plaque chauffante peuvent être utilisés pour l’amplification isotherme.

Le thermocycleur A-Q-P-C-R est utilisé dans cette démonstration. Incuber les échantillons pendant sept heures à 30 degrés Celsius et les inactiver pendant une minute à 75 degrés Celsius. Immédiatement après la réaction et l’activation.

Mesurez les niveaux de di fluorescence pour tous les échantillons à l’aide du thermocycleur QPCR. Pour chaque échantillon. Divisez l’intensité de fluorescence du colorant de liaison à l’ADN D DS par l’intensité de fluorescence du colorant de référence.

Soustrayez la fluorescence de fond ou la fluorescence normalisée du témoin sans matrice de tous les échantillons. Créez une courbe standard linéaire à l’aide des mesures de fluorescence correctives des étalons. L’étalon de contrôle sans matrice représente la fluorescence d’un échantillon avec 0 % de gouttelettes fluorescentes et la concentration élevée de la matrice.

La mesure de fluorescence est la fluorescence attendue pour un échantillon avec des gouttelettes fluorescentes à 100 % en utilisant la courbe standard correspondante. Prédisez les rapports intermédiaires de gouttelettes positives et négatives en fonction de leur fluorescence globale. Cette méthode utilise un instrument de PCR en temps réel conventionnel pour mesurer la fluorescence apparente des tests numériques basés sur des gouttelettes.

Des gouttelettes fluorescentes et non fluorescentes ont été pré-mélangées dans des proportions différentes et une comparaison a été faite entre la fluorescence en vrac et la fraction de gouttelettes positives. Comme prévu, la fluorescence en vrac et le nombre de gouttelettes positives évoluent linéairement avec la fraction d’entrée des gouttelettes fluorescentes. Les rapports prédits basés sur les normes ont été comparés aux fractions d’entrée fluorescentes attendues.

La ligne indique la valeur attendue compte tenu d’une relation linéaire. Les résultats montrent de bonnes performances dans la quantification du rapport de gouttelettes sur deux logarithmes de plage dynamique. Tester cette méthode dans un test quantitatif réel d’amplification du génome entier, les niveaux de fluorescence et les fractions de gouttelettes positives d’une gouttelette numérique.

Des tests MDA avec des concentrations croissantes d’ADN Lambda matrice ont été mesurés. La ligne indique la fraction fluorescente attendue en utilisant la distribution poissant pour modéliser les données de l’expérience. Des images fluorescentes représentatives des gouttelettes sont montrées à la fois fluorescentes en vrac et en fraction de gouttelettes positives à partir de l’échelle des échantillons numériques MDA, comme prévu avec la matrice moyenne par gouttelette, indiquant que la lecture en vrac peut capturer fidèlement le résultat d’un asay numérique.

Cette méthode peut bénéficier à d’autres tests numériques comme la PCR numérique en accélérant la parallélisation et en simplifiant la lecture du test.