Préparation de la grande porosité de coordination Polymer Coatings sur macroporeuses Polymer monolithes pour enrichissement accrue des Phosphopeptides

L’objectif global de l’expérience suivante est de préparer un nouveau matériau de support avec des performances améliorées dans l’extraction sélective des peptides phospho. Ceci est réalisé par une préparation appropriée d’un monolithe capillaire polymère poreux avec des groupes fonctionnels appropriés. Tout d’abord, une espèce métallique est immobilisée sur les groupes fonctionnels d’un monolithe polymère, ce qui rend le support sélectif à l’extraction des peptides phospho.

Ensuite, étape par étape, la croissance de plusieurs couches de la structure organique métallique est effectuée afin d’augmenter la quantité de sites métalliques, augmentant ainsi la sélectivité des peptides phospho. Les résultats montrent une meilleure sélectivité pour l’extraction des peptides phospho à partir de digestions de protéines basées sur la désorption laser assistée par matrice, l’ionisation, la spectrométrie de masse à temps de vol. L’enrichissement du peptide O se fait généralement par chromatographie d’affinité avec le lion métallique, qui est effectuée soit sur des particules de silice conventionnelles, soit sur des particules de polymère, qui sont emballées dans une colonne chromatographique.

Notre matériau combine les avantages d’un monolithe polymère macroporeux, qui possède de bonnes propriétés de transport de masse avec la grande capacité de liaison d’un cadre organique métallique. La façon d’y parvenir est de faire croître séquentiellement le cadre organique métallique à partir de la surface du monolithe de sorte qu’à la fin, nous avons plusieurs couches de lignes métalliques disponibles pour interagir avec l’analyte La démonstration visuelle de la préparation du monolithe polymère et la croissance du cadre organique métallique sont toutes deux importantes car elles sont très difficiles à apprendre. Il y a plusieurs étapes importantes auxquelles il faut prêter attention afin d’obtenir un monolithe avec de bonnes propriétés de surface et une bonne porosité.

Pour commencer, coupez deux mètres d’un capillaire en silice fondue recouvert de polyamide et d’un diamètre intérieur de 100 microns relié à une seringue en verre de 25 millilitres et lavez le capillaire avec de l’acétone. Retirez ensuite l’acétone en rinçant le capillaire à l’eau. Ensuite, placez une seringue en verre de 250 microlitres remplie d’hydroxyde de sodium aqueux de 0,2 molaire sur la pompe à seringue et versez la solution au point 25 microlitres par minute à travers le capillaire pendant 30 minutes afin d’activer le revêtement interne de silice.

Au bout de 30 minutes, rincez le capillaire à l’eau jusqu’à ce que l’effluent soit neutre. Utilisez des bandelettes de pH en papier pour vérifier le débit de pH neutre. Ensuite, chargez dans la seringue avec du chlorure d’hydrogène aqueux de 0,2 molaire et pompez la solution à travers le capillaire au point 25 microlitres par minute pour protoniser les groupes ciol après 30 minutes d’écoulement, encore une fois, rincez le capillaire avec de l’eau jusqu’à ce que le débit soit neutre.

Une fois que le pH est neutre, rincez les capillaires avec une seringue de 250 microlitres remplie de 100 % d’éthanol. Ensuite, pompez une solution à 20 % de méthacrylate de triméthylpropyle dans de l’éthanol au point 25 microlitres par minute pendant une heure pour fonctionnaliser la surface avec des groupes vinyles. Ensuite, rincez les capillaires avec de l’acétone, puis séchez-les avec un jet d’azote.

Laissez reposer les échantillons à température ambiante pendant la nuit, puis coupez-les en sections de 20 centimètres de long. Préparez le mélange de polymérisation dans un flacon en verre d’un millilitre avec un septum en caoutchouc, comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Ajouter 1 % d’IBN par rapport aux monomères en tant qu’initiateur et soniquer le mélange pendant 10 minutes.

Ensuite, fixez un capillaire de silice non fonctionnalisé à un flux d’azote et insérez-le à travers le septum en caoutchouc dans le mélange de polymérisation. Desserrez légèrement le bouchon du flacon et faites lentement bouillonner l’azote à travers le mélange pendant 10 minutes. Après 10 minutes, soulevez le capillaire du flux d’azote du mélange de polymérisation jusqu’à l’espace de tête du flacon et fermez bien le bouchon.

Insérez l’un des capillaires fonctionnalisés à travers le septum dans le mélange de polymérisation. Utilisez l’excès de pression généré par l’azote pour pomper le mélange de polymérisation dans le capillaire fonctionnalisé. Laissez plusieurs gouttes du mélange de polymérisation s’écouler de l’effluent du capillaire pour vous assurer qu’il est complètement rempli, puis fermez-le avec un septum en caoutchouc.

Sortez le capillaire du flacon très soigneusement et fermez l’entrée avec un septum en caoutchouc, placez un mélange contenu dans le capillaire dans un bain-marie chauffé à 60 degrés Celsius pendant six heures pour polymériser. Une fois terminé, refroidissez le capillaire à température ambiante, puis coupez quelques millimètres des deux extrémités du capillaire. Ensuite, utilisez une pompe HPLC pour rincer la colonne avec de l’acétonitrile à quatre microlitres par minute pendant 30 minutes.

Cela éliminera tous les monomères non réactifs et les agents de formage médiocres. Vérifiez la contre-pression de la colonne capillaire. Ensuite, rincez le monolithe capillaire par cycles avec les réactifs présentés ici pour faire croître le revêtement organique métallique final.

L’épaisseur du revêtement est déterminée par le nombre de cycles effectués. Rincer les capillaires avec le revêtement organique métallique préparé à l’aide de 100 microlitres d’un mélange quatre pour un d’essai d’acétonide et d’acide triou acétique aqueux à 0,1 %. Ensuite, pompez une digestion protéique à travers la colonne à deux microlitres par minute.

Pendant 30 minutes, lavez à nouveau les peptides non phosphorylés avec un mélange quatre pour un d’acétyle NI essai et d’acide tri-fluoroacétique aqueux à 0,1 % pendant 10 minutes à un débit d’un microlitre par minute. Laver à l’eau pendant 10 minutes à un débit d’un microlitre par minute. Éluez les peptides phospho à l’aide d’une solution tampon de phosphate de 250 micromolaires à pH sept en la pompant à travers le capillaire à raison d’un microlitre par minute pendant 15 minutes, recueillez l’ellu dans un flacon et dessalez la solution à l’aide d’un protocole standard.

Ensuite, préparez une solution de deux milligrammes par millilitre d’acide dihydroxybenzoïque dans du méthanol et mélangez deux microlitres de cette solution avec deux microlitres de la solution peptidique phospho mentionnée. À l’intérieur d’une pointe de pipette, placez ce mélange directement sur la plaque d’ionisation par désorption laser assistée par matrice et laissez la tache sécher complètement. Analyser les taches par laser assisté par matrice : Désorption, ionisation, temps de vol, spectrométrie de masse, enfin régénérer la colonne en la rinçant abondamment à l’eau, suivie de capillaires de méthanol modifiés avec plusieurs couches de fer disponible.

Trois groupes sont idéaux pour une utilisation dans la chromatographie d’affinité d’ions métalliques immobilisés. On voit ici des spectres obtenus à partir de protéines digérées avant et après enrichissement, montrant une sélectivité remarquable pour 12 peptides phospho différents. Les expériences de caractérisation représentative fournissent des informations précieuses sur l’émergence de nouveaux pores. Voici une image d’un monolithe de poudre en vrac après 30 cycles de polymère de coordination poreuse connus sous le nom de cycles PCP à l’aide d’un microscope électronique à balayage.

Après 30 cycles de PCP, la taille des largeurs de pores dans le matériau s’est avérée inférieure à trois nanomètres de diamètre par rapport au polymère en vrac. L’hybride a une grande quantité de surface incrémentielle avec de petits pores. Cela conduit à une augmentation de l’absorption d’azote à travers une gamme de pressions à l’aide de la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier.

L’incorporation initiale des groupes fonctionnels carboxyliques était visible ainsi que la croissance du revêtement après 10, 20 et 30 cycles de PCP. Enfin, l’analyse thermogravimétrique a été utilisée pour mesurer la quantité de sites métalliques supplémentaires qui se sont accumulés à chaque cycle. L’analyse gravimétrique à travers une gamme de températures est illustrée, ce qui confirme la présence d’un nombre accru de sites métalliques avec un nombre de cycles accru.

En suivant ce protocole, une procédure similaire peut être développée pour différents centres métalliques dans les ligands organiques afin de cibler des séparations efficaces de différents analytes en fonction de leur affinité pour un cadre particulier. Je crois que les matériaux composites comme le nôtre, qui combinent des polymères macroporeux avec des cadres organiques métalliques, sont très prometteurs dans le domaine de la science de la séparation, car ils peuvent améliorer considérablement la sélectivité, la capacité de liaison et l’efficacité globale des séparations, à la fois à l’échelle analytique et préparative.