Name: Analyse qPCRTag - un débit élevé, PCR temps réel pour Sc2.0 Génotypage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min
Description: Découvrez la méthode qPCRTag pour le génotypage haut débit du génome de levure synthétique Sc2.0. Cette technique PCR en temps réel élimine l'électrophorèse sur gel et réduit considérablement le temps d'analyse.

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Ce travail a été financé en partie par la National Science Foundation Grant MCB-0718846 et de la Défense Advanced Research Projects Agency contrat N66001-12-C-4020 (à JDB). LAM a été financé par une bourse de recherche postdoctorale du Conseil de recherches en génie du Canada en sciences naturelles et. Publication de cet article est sponsorisé par Roche.

1. Préparer l&#39;ADN génomique de levure (ADNg) <ol><li> Préparer un stock de levure Lysis Buffer 9 qui contient 50 mM de Tris pH 8,0, NaCl 100 mM, SDS à 1% (p / v), 2% de Triton X-100 (v / v), EDTA 1 mM pH 8,0. </li><li> Comme l&#39;utilisation des matériaux à partir ~ 2 x 10 6 cellules, ce qui correspond généralement à ~ 100 ul de culture saturée pour les souches de laboratoire de la BY4741 10 arrière-plan. Les cellules cultivées sont collectés par centrifugation à 1000 g pendant 3 min à température ambiante dans un tube à microcentrifugation de 1,5 ml. Aspirer le surnageant. </li><li> Ajouter 200 ul de tampon de lyse levures et remettre en suspension le culot de cellules par pipetage. </li><li> Ajouter ~ 300 ul d&#39;acide lavé les billes de verre de telle sorte que le niveau de perles est d&#39;environ 1 mm en dessous du niveau de la suspension cellulaire. </li><li> Dans une hotte ajouter 200 ul de phénol / chloroforme / alcool isoamylique (25: 24: 1). Boucher le tube de centrifugeuse et veiller à ce qu&#39;aucun perles sont coincés entre le bouchon et le tube comme cela se traduira par des fuites pendant l&#39;agitation(Étape 1.6). Inversez 3 fois pour mélanger et vérifier le bouchon est scellé. </li><li> Agiter le tube pendant 10 min à température ambiante en utilisant un mélangeur de paillasse comme un Eppendorf 5432. </li><li> Centrifuger à 20 800 g pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Transfert 75 ul de la phase aqueuse dans un nouveau tube de microcentrifugation contenant 1 ml d&#39;éthanol à 100%. Inversez 10 fois pour mélanger. </li><li> Pellet l&#39;ADN par centrifugation à 20 800 g pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant sans déloger le culot d&#39;ADN. Laver le culot avec 500 ul d&#39;éthanol à 70%. </li><li> Centrifuger à 20 800 g pendant 5 min à 4 ° C. </li><li> Aspirer le surnageant sans déloger le culot d&#39;ADN et sécher à l&#39;air le culot avec le bouchon de micro ouvert jusqu&#39;à excès d&#39;éthanol est évaporée, ce qui est généralement autour de 10 min. </li><li> Remettre en suspension le culot d&#39;ADN dans 75 ul de Tris à 10 mM pH 7,4 et vortex pour mélanger. Conserver l&#39;échantillon à -20 ° C indéfiniment. Mesurer la concentration de l&#39;ADN dans l&#39;échantillon en utilisant unpaillasse fluorimètre comme le qubit, qui distingue l&#39;ADN à partir d&#39;ARN. Assurez-vous que la concentration finale de ADNg est ~ 1-2 ng / ul. </li><li> Préparer une dilution 1:10 de l&#39;ADN génomique en utilisant de l&#39;eau et le vortex pour mélanger. </li><li> 30 ul d&#39;aliquote diluée ADNg dans le puits approprié d&#39;une plaque de source qui est compatible avec un distributeur de liquide à l&#39;échelle nanométrique acoustique (étape 3). Si vous utilisez un Labcyte Echo 550, utiliser une plaque de polypropylène de 384 puits (plaque 384PP). REMARQUE: Lorsque scellé convenablement cette plaque peut être conservé pendant au moins un mois à -20 ° C. </li></ol> 2. Préparer et de distribution qPCR Master Mix dans une plaque multipuits 1536 <ol><li> Préparer 850 pi de qPCR mélange maître, comme LightCycler 1536 ADN vert Maître, dans un tube de 1,5 ml et le vortex pour mélanger. Centrifuger le mélange maître qPCR pendant 2 min à 20 800 g à température ambiante pour éliminer les bulles. Les composants du mélange maître qPCR nécessaire pour une seule plaque multipuits 1536 sont les suivantss: <ol><li> Mélanger 170 pi de mélange maître enzyme (Master Green Tube 1, 5x concentré), 42,5 pi de SYBR (Tube Master Vert 4, 20x concentré), et 637,5 pi d&#39;eau. </li></ol></li><li> Distribuer 500 nl / puits dans une plaque multipuits 1536 en utilisant un distributeur de liquide en vrac telles que l&#39;Art Robbins Cobra. (Notez que les étapes 2.2.1-2.2.4 réfèrent spécifiquement à la Cobra.) <ol><li> Créer un programme de distribution avec les paramètres suivants: classe de liquide, de l&#39;eau; Aspirer le volume, 800 pi; passer le volume, 500 nl; le temps de lavage, 20 sec. Dans les paramètres de dépose, vérifier la vitesse de distribution est fixé à 49,6 mm / sec, le décalage distribution est de 0,25 mm, et l&#39;excès de liquide aspiré sera distribué retour dans la source ainsi. </li><li> Placez le tube de centrifugeuse contenant le mélange maître qPCR dans le puits A1 du support de tube de centrifugeuse, qui est situé en position de pont 1. Coupez le capuchon du tube de centrifugeuse ou simplement le laisser ouvert. Réglez le «Aspirer bien» à A1 en éditant le Aspiratparamètres e. </li><li> Effectuer une étape de lavage avant de distribuer qPCR mélange maître par les premiers de-sélectionnant l&#39;aspiration et de distribution étapes du programme mis en place à l&#39;étape 2.2.2, puis frapper &quot;run&quot;. Une fois terminé, re-sélectionnez le aspiration et de distribution étapes avant d&#39;exécuter le programme complet pour distribuer qPCR Master Mix. Si le Cobra a été assis inactif pendant moins de 10 minutes de l&#39;étape de lavage initial, qui sert à amorcer le système, est inutile. </li><li> Hit &#39;run&#39; pour distribuer qPCR mélange maître à chaque puits. </li></ol></li><li> Recueillir le master mix qPCR au fond de chaque puits par une brève centrifugation de la plaque multi-puits 1536 (30 secondes en utilisant une faible vitesse PCR plaque spinner). </li></ol> 3. Distribuer Patron de l&#39;ADN et des amorces dans le 1536 Multiwell Plate <ol><li> Distribuer 5 nl de diluée ADNg (étape 1.3) dans les puits souhaitées de la plaque multi-1536 en utilisant un système de transfert de liquide acoustique, telles que l&#39;Echo 550. <ol><li> Pour la Echo 550, utiliser le logiciel Plate reformatage ou encore fournir une feuille de calcul Excel personnalisé pour programmer le transfert. Assurer la source sélectionnée pour le bien ADNg dans le programme correspond à la source et dans lequel vous avez physiquement distribué l&#39;ADNg (étape 1.3). Choisir le type de plaque de source «384PP_AQ_BP2&quot;, qui indique le liquide dans la plaque 384PP est un tampon sans tensioactifs. </li></ol></li><li> Répartir 10 ni d&#39;amorces, de pré-mélangés avant et arrière à une concentration finale de 50 pM de chacun, dans les puits souhaitées de la plaque multi-puits 1536 en utilisant un système de transfert de liquide acoustique, tels que l&#39;Echo 550. <ol><li> Pour le système de transfert de liquide, utiliser le logiciel Plate reformatage ou encore fournir une feuille de calcul Excel personnalisé pour programmer le transfert. REMARQUE: Ici, il est possible de se passer des primaires tels que la disposition sur la plaque multipuits 1536 correspond à l&#39;ordre chromosomique des amorces il est donc facile d&#39;inspecter visuellement les résultats de la PCR en temps réelplus tard (étape 6). </li><li> Prémélange les amorces dans une plaque qui est compatible avec le distributeur de liquide acoustique. Pour l&#39;Echo 550, utiliser une plaque Labcyte 384LDV (faible volume mort) et de choisir le type de plaque de source »384LDV_AQ_B &#39;lors de la programmation de l&#39;Echo pour indiquer le liquide est un simple tampon sans protéines. </li></ol></li></ol> 4. Seal et Centrifugeuse 1536 Multiwell Plate <ol><li> Grâce à un système d&#39;étanchéité de microplaques comme le PlateLoc microplaques thermique Sealer, fermer immédiatement la plaque multipuits 1536 en utilisant joint optiquement clair qui est compatible avec l&#39;instrument d&#39;un scellant à la chaleur. Ne touchez pas la surface du joint pour éviter les traces de maculage. <ol><li> Si vous utilisez le PlateLoc thermique microplaques Sealer, utilisez les paramètres suivants: sceller temps 2.0 sec, la température d&#39;étanchéité 162 ° C, la pression d&#39;air de 82 psi. Cet instrument prend ~ 5 min à chauffer et ainsi doit être activé à l&#39;avance. </li><li> Si vous utilisez le PlateLoc microplaques thermique Sealer, un ADAPTEr doit être utilisé pour augmenter la hauteur de la plaque multipuits 1536 sur la scène de l&#39;instrument pour assurer une bonne étanchéité. REMARQUE: Bien qu&#39;il soit préférable d&#39;acheter une plaque de platine pour la PlateLoc microplaques thermique Sealer, une solution alternative consiste à insérer quatre ~ 2 mm rondelles standard épais disponibles à tout magasin de matériel dans les coins pour augmenter la hauteur de la plaque à puits multiples 1536. </li></ol></li><li> Centrifuger immédiatement la plaque 1536 multipuits scellé à 2000 g pendant 3 min à température ambiante pour recueillir tous les réactifs au fond de chaque puits. </li></ol> 5. PCR en temps réel <ol><li> Programme qPCR un instrument 1536, tel que le LightCycler 1536, avec un protocole d&#39;amplification en deux étapes suivi d&#39;une analyse de courbe de fusion. Utilisation du logiciel LightCycler 1536 a mis en place un programme comme suit: <ol><li> La pré-incubation: 95 ° C, 1 min attente, le taux de rampe de 4,8 ° C / s, aucune acquisition. </li><li> L&#39;amplification en deux étapes: 30 cycles de [95 ° C, pas de prise,Taux de rampe de 4,8 ° C / sec, pas d&#39;acquisition; 64 ° C, attente de 30 secondes, le taux de rampe de 2,5 ° C / sec, seule acquisition]. </li><li> Faire fondre la courbe: 95 ° C, 10 sec, le taux de rampe de 4,8 ° C / sec, pas d&#39;acquisition; 60 ° C, 1 min, le taux de rampe de 2,5 ° C / sec, pas d&#39;acquisition; 97 ° C, le taux de rampe de 0,1 ° C / sec, 5 acquisitions / ° C (continu). </li><li> Cool: 40 ° C, 30 sec, le taux de rampe de 2,5 ° C / s, aucune acquisition. </li></ol></li><li> Réglez le Format de détection de &#39;Green intercalant Dye »dans l&#39;onglet Run Définition. </li><li> Réglez la commande de pipetage pour &#39;Master Control&#39; dans l&#39;onglet Run Définition. Cette fonction sert de contrôle interne et détecte la présence de qPCR Master Mix dans chaque puits de la plaque à puits multiples 1536, ce qui est utile pour identifier les faux négatifs putatifs. </li><li> Insérez la plaque multipuits 1536 préparé dans les étapes 2-4 dans la qPCR instrument 1536 et exécuter le programme. </li></ol> 6. Analyse des données <ol><li> Perform inspection visuelle des données dans le logiciel qPCR. REMARQUE: Le logiciel 1536 permet de visualiser à la fois l&#39;amplification et la fonte des courbes, ainsi que d&#39;une carte de chaleur montrant l&#39;appel (positif, négatif, invalide, N / A; Figure 2), la valeur du point de passage (coulissant échelle de couleurs pour le positif ou gris pour le négatif; Figure 3), ou une fluorescence point final (EPF) valeur (échelle mobile de couleur). </li><li> Exporter des données à partir du logiciel 1536 sous la forme d&#39;un fichier .txt (les résultats de la table) ou un fichier .xml soit avec les données brutes ou des données calculées pour le traitement hors ligne à partir de l&#39;instrument. NOTE: Le point de passage automatisé propriétaire (Cp) algorithme appelant intégré dans le logiciel 1536 tient compte de la forme et la pente de la courbe d&#39;amplification tout en déterminant négatifs et Cp appels positifs / valeur avec une grande confiance, à faible sous des volumes de réaction de microlitre avec relativement faible valeurs de fluorescence. </li><li> Si le LightCycler ADN vert Maître était utilisationd pour qPCR, vérifier que tous les puits ont passé le «contrôle de maître». Un fail indique le bien n&#39;a pas reçu qPCR Master Mix et le point de données manquantes devrait être considéré comme un faux négatif potentiel. Vérifiez que tous les puits ont passé le «contrôle de maître». Un fail indique le bien n&#39;a pas reçu l&#39;ADN mastermix et examiner le point de données manquant un faux négatif potentiel. </li></ol>

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<li>Dymond, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+chromosome+arms+function+in+yeast+and+generate+phenotypic+diversity+by+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Synthetic chromosome arms function in yeast and generate phenotypic diversity by design.</a> Nature. 477 (7365), 471-476 (2011).</li>
<li>Goffeau, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+with+6000+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Life with 6000 genes.</a> Science. 274 (5287), 546-547 (1996).</li>
<li>Dymond, J., Boeke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Saccharomyces+cerevisiae+SCRaMbLE+system+and+genome+minimization%5BTitle%5D)+AND+%22Bioeng+Bugs%22%5BJournal%5D)">The Saccharomyces cerevisiae SCRaMbLE system and genome minimization.</a> Bioeng Bugs. 3 (3), 168-171 (2012).</li>
<li>Richardson, S. M., Nunley, P. W., Yarrington, R. M., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GeneDesign+3.0+is+an+updated+synthetic+biology+toolkit%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">GeneDesign 3.0 is an updated synthetic biology toolkit.</a> Nucleic Acids Res. 38 (8), 2603-2606 (2010).</li>
<li>Richardson, S. M., Liu, S., Boeke, J. D., Bader, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design-A-Gene+with+GeneDesign%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Design-A-Gene with GeneDesign.</a> Methods Mol Biol. 852, 235-247 (2012).</li>
<li>Lajoie, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+limits+of+genetic+recoding+in+essential+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Probing the limits of genetic recoding in essential genes.</a> Science. 342 (6156), 361-363 (2013).</li>
<li>Jovicevic, D., Blount, B. A., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+synthesis+of+a+eukaryotic+chromosome%3A+Redesigning+and+SCRaMbLE-ing+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Bioessays%22%5BJournal%5D)">Total synthesis of a eukaryotic chromosome: Redesigning and SCRaMbLE-ing yeast.</a> Bioessays. 36 (9), 855-860 (2014).</li>
<li>Dymond, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+genomic+DNA+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of genomic DNA from Saccharomyces cerevisiae.</a> Methods Enzymol. 529, 153-160 (2013).</li>
<li>Brachmann, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designer+deletion+strains+derived+from+Saccharomyces+cerevisiae+S288C%3A+a+useful+set+of+strains+and+plasmids+for+PCR-mediated+gene+disruption+and+other+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications.</a> Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).</li>
</ol>

LAM, NAP, JAM et JDB ont rien à révéler. RC et AL sont employés par Roche Life Science, des États-Unis et a travaillé sur le développement de l&#39;application avec LAM dans le cadre d&#39;une preuve de l&#39;expérience principe.

Incorporation de détection de PCR en temps réel dans le test de génotypage PCRTag est un développement important pour le projet Sc2.0 car elle permet un débit nettement plus élevé. Le workflow précédente spécifié 2,5 réactions ul dans des plaques de 384 puits PCR, 1,5 heures de temps d&#39;exécution de cyclage thermique, électrophorèse sur gel d&#39;agarose, et d&#39;annotation manuelle du gel. Le flux de travail présenté ici, appelée analyse qPCRTag, surmonte plusieurs principaux goulets d&#39;étranglement. Tout d&#39;abord, une course de qPCRTag condense 4 x 384 plaques ainsi dans une expérience unique qui peut être traitée, début à la fin (plaque mis en place, plus le temps de fonctionner), en une heure environ. Il est important de noter que le coût de réactif par puits pour l&#39;analyse qPCRTag est à égalité avec l&#39;approche inférieure à base de gel agarose-débit. Cependant, en contournant électrophorèse sur gel et annotation manuelle, le workflow qPCRTag offre des économies substantielles de temps et de travail, qui sont les principaux avantages. Surtout le flux de travail est en qPCRTagtièrement compatible avec l&#39;automatisation. Une préoccupation majeure avec l&#39;utilisation de la détection réelle de temps que la sortie de l&#39;essai PCRTag est le taux de faux positifs et de faux négatifs. Depuis les amorces PCRTag ont pas été initialement conçus pour une utilisation dans la PCR en temps réel, il est prévu que tous les couples d&#39;amorces seront appropriées pour une utilisation avec cette sortie. A cette fin, il est important de valider la fonction et la spécificité de toutes les paires d&#39;amorces PCRTag à exclure le sous-ensemble qui ne fonctionne pas dans le dosage réel basé sur le temps à l&#39;avant. Par exemple, chromosome 3 PCRTag faux positifs et négatifs sont des sous-grand-et reproductible dans la PCR en temps réel des données (figures 2 et 3) et ceux-ci peuvent être exclues d&#39;autres analyses. En outre, les paires d&#39;amorces connues à l&#39;échec (évalués par électrophorèse sur gel et présentés dans les figures S6 et S7 de Annaluru et al. 1) peuvent également être exclus. Ceci est facilement accompli simplement excluding les paires d&#39;amorces défectueux lors de la mise en place du protocole de transfert acoustique. Comme la plupart des analyses à haut débit, nous avons l&#39;intention d&#39;utiliser la détection de PCRTag en temps réel comme un écran primaire pour identifier les transformants qui méritent une validation supplémentaire en aval. Par la suite, l&#39;étalon-or pour le dépistage secondaire restera analyse PCRTag avec électrophorèse sur gel que la lecture. Au-delà de l&#39;application de l&#39;analyse PCRTag pour Sc2.0, combinant des systèmes de manipulation des liquides à l&#39;échelle nanométrique état-of-the-art avec la technologie haut débit de PCR en temps réel permet une analyse rapide et automatisé et a le potentiel d&#39;avoir un impact de nombreux domaines. Par exemple, ce flux de travail pourrait être appliquée à de dépistage grande capacité de la bibliothèque, le diagnostic des maladies infectieuses, l&#39;analyse sur le microbiome, et pointe édition du génome approches tentant de modifier loci multiples simultanément.

Sc2.0, ou le projet de génome de la levure synthétique ( <a href="http://www.syntheticyeast.org" target="_blank">www.syntheticyeast.org</a> ), a fixé l&#39;objectif de concevoir et de construire un génome eucaryote entièrement synthétique. Utilisation de la séquence du génome hautement organisée de Saccharomyces cerevisiae 3 comme point de départ, chacun des chromosomes linéaires seize a été re-conçu pour répondre à un ensemble de principes de conception qui spécifient maintien de la forme des cellules, l&#39;amélioration de la stabilité du génome, et accroître la flexibilité génétique. Par exemple, des éléments de déstabilisation tels que les répétitions sont supprimés de chromosomes Sc2.0. Toutes les instances de codons stop TAG sont re-codés pour TAA à &#39;libérer&#39; un codon dans la souche finale pour l&#39;introduction d&#39;un acide aminé non génétiquement codé. En outre, un système d&#39;évolution inductible, Scramble, permis par le système Cre-lox, permet une capacité sans précédent de générer des génomes dérivés avec 4 nouvelles structures. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Un autre élément de conception majeur dans le génome de Sc2.0 est l&#39;introduction de PCRTags, qui servent de filigranes ADN pour permettre le suivi de l&#39;ADN de type synthétique et sauvage. PCRTags sont courts segments de re-codées dans les ORF sur les chromosomes synthétiques; tandis que les séquences PCRTag diffèrent au niveau de l&#39;ADN entre les chromosomes de type sauvage et synthétiques, les protéines codées sont identiques à la séquence d&#39;acides aminés et, par conséquent, probablement, de la fonction. PCRTag séquences sont spécifiquement conçus comme des sites de liaison d&#39;amorces pour faciliter l&#39;amplification sélective (Figure 1A). PCRTag conception est effectuée en utilisant l&#39;algorithme &quot;le plus différent» dans GeneDesign 5,6, donnant recodé séquences synthétiques qui sont typiquement ~ 60% différente de celle des séquences natives (minimum 33%) avec des températures de fusion entre 58 ° C et 60 ° C et amplicon longueurs entre 200-500 paires de base 2. Recodage est interdit dans le premier 100 pb de chaque ORF, que ces régions sont connues pouravoir des préférences particulières en termes d&#39;utilisation de codon 7. Ensemble, ces règles de conception favorisent haute performance de presque tous PCRTags sous un seul ensemble de conditions de PCR lequel paires d&#39;amorces de type PCRTag synthétiques et sauvages se lient exclusivement et amplifier l&#39;ADN synthétique et native, respectivement (figure 1B). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig1.jpg" /> Figure 1:. PCRTag schématique (A) PCRTags sont séquences à l&#39;intérieur des cadres de lecture ouverts (ORF) des gènes sur les chromosomes Sc2.0 recodées. (B) synthétique (SYN) et de type sauvage (WT) amorces PCRTag lient exclusivement et amplifient l&#39;ADN génomique de type synthétique et sauvage (ADNg), respectivement. On voit ici une analyse d&#39;un segment du bras gauche du chromosome six ~ 30 kb, tester treize PCRTag paires d&#39;amorces utilisant soit WT ou semi-synVIL2 gDNA comme modèle. Dans de nombreux cas, une seule ORF code plus d&#39;un PCRTag. Présence / absence d&#39;amplicons PCRTag est évaluée par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. Amplicons PCRTag varient en taille de 200 pb à 500 pb. Les espèces migrant plus vite dans le bas des panneaux sont des dimères d&#39;amorces. PCRTag analyse a prouvé être un outil important dans l&#39;assemblage de chromosomes Sc2.0. Dans une expérience typique de 30 à 50 kb de l&#39;ADN synthétique, codant pour 20 à 30 PCRTags, est transformé dans des cellules de levure pour remplacer le type sauvage correspondant ADN 1,2,8. PCRTag analyse est ensuite utilisée pour identifier les transformants qui codent synthétiques mais pas sauvage PCRTags de type couvrant ce segment d&#39;ADN, ou soi-disant «gagnants». Il est généralement nécessaire de tester plusieurs transformants d&#39;identifier les «gagnants», de sorte débit et le coût de l&#39;analyse PCRTag sont des considérations importantes. Actuellement deux chromosomes Sc2.0 ont été réalisées (une synIII et synIXR 2), ce qui représente moins de 10% du génome de Sc2.0, altHough plus de la moitié des chromosomes restants sont actuellement en cours de synthèse et l&#39;assemblage. L&#39;échelle d&#39;analyse PCRTag requis pour ce projet est plus rapide que rapide la possibilité d&#39;exécuter manuellement les gels et marquer la présence de l&#39;ADN synthétique et l&#39;absence d&#39;ADN de type sauvage. Pour améliorer le débit de l&#39;essai PCRTag nous avons développé un flux de travail en utilisant la PCR en temps réel pour contourner l&#39;utilisation d&#39;une électrophorèse sur gel d&#39;agarose. Le workflow permet l&#39;utilisation d&#39;un distributeur de liquide en vrac à distribuer qPCR mastermix dans chaque puits d&#39;une plaque multipuits 1536, un distributeur de liquide acoustique échelle nanométrique pour transférer l&#39;ADN de matrice et des amorces, et un cycleur thermique 1536 qPCR, ce qui nous permet de miniaturiser les réactions à 500 nl et maximiser le débit. En outre l&#39;analyse peut être automatisée. Ce type de haut débit protocole de génotypage devrait être généralisables à tout projet nécessitant l&#39;analyse de nombreux clones à des loci multiples.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Préparation de l’ADNg</td></tr> de <tr>levure Modèle <td></td><td>personnalisé</td> personnalisé<td>d’ADNg de levure</td><td>pour PCR en temps réel</td></tr><tr><td>Perles de verre lavées à l’acide (0,5 mm)</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>Lyse cellulaire de levure</td></tr><tr><td>Phénol ultrapur :Chloroforme :Alcool isoamylique (25:24:1, v/v)</td><td>Invitrogen</td><td>15593-031</td><td>Lyse cellulaire de levure</td></tr><tr><td>5432 Mélangeur</td><td>Eppendorf</td><td>5432</td><td>Lyse cellulaire de levure</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>22621807</td><td>lyse cellulaire de levure</td></tr><tr><td>Fluorimètre Qubit 3.0 Life</td><td>Technologies</td><td>Q33216</td><td>Quantification de l’ADNg</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA BR Kit de dosage</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td>Quantification de l’ADNg</td></tr><tr><td>Labcyte 384PP plaque</td><td>Labcyte</td><td>P-05525</td><td>Plaque source d’ADNg</td></tr><tr><td colspan="4">DNA Green Mastermix prep et distribution</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 DNA Green</td><td>Roche</td><td>5573092001</td><td>realtime PCR mastermix</td></tr><tr><td>1,5 ml Support de tube de microfuge</td><td>ARI</td><td>EST BD060314-1</td><td>support de tube de microfuge pour pont de Cobra</td></tr><tr><td>LightCycler 1536 Multiwell Plate</td><td>Roche</td><td>5358639001</td><td></td></tr><tr><td>Cobra système de manipulation de liquide</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>630-1000-10</td><td>distribuer le master mix qPCR dans 1536 plaque</td></tr><tr><td>PCR Plate Spinner</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>censure de 1536 plate</td></tr><tr><td colspan="4">Dosage de gabarits et d’amorces</td></tr><tr><td>PCRTag amorces</td><td>IDT</td><td>prémélangées sur mesure</td><td>en marche avant et arrière, 50 &mu ; M chaque</td></tr><tr><td>feuille d’étanchéité perforable TempPlate, stérile</td><td>USA Scientific</td><td>2923-0110</td><td>joint temporaire pour plaques d’amorçage PCRTag</td></tr><tr><td>Plaque à puits Labcyte LDV 384 Plaque</td><td>source d’amorce pré-mélangée</td><td>Labcyte</td><td>LP-0200</td></tr><tr><td>Echo 550 Liquid Handler</td><td>Labcyte</td><td></td><td>transfert de 2,5 gouttes nl d’amorce et d’ADN modèle dans la plaque 1536</td></tr><tr><td>Plateloc Thermo Microplate</td><td>Sealer Agilent</td><td>Thermoscellage G5402-90001</td><td>pour plaque 1536 avant le passage LC1536</td></tr><tr><td>Joint permanent transparent</td><td>Agilent</td><td>24212-001</td><td>thermosoudable optiquement transparent pour plaque multipuits LC1536</td></tr><tr><td>PlateLoc Roche/LightCycler 1536 Plate Stage</td><td>Agilent</td><td>G5402-20008</td><td>peut remplacer des rondelles de ~2 mm d’épaisseur</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XTR</td><td>Thermo Scientfic</td><td>75-004-521</td><td>centrifugeuse thermoscellée 1536 plaque</td></tr><tr><td>Compresseur d’air industriel</td><td>Jun Air</td><td>1795011</td><td>pour faire fonctionner l’écho et la thermosoudeuse</td></tr><tr><td colspan="4">Real Time PCR</td></tr><tr><td>LightCycler 1536</td><td>Roche</td><td></td><td>nécessite une prise de 220 V</td></tr></tbody></table>

analyse qpcrtag - un débit élevé, pcr temps réel pour sc2.0 génotypage

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

Le projet de génome de la levure synthétique (Sc2.0) vise à construire 16 concepteur chromosomes de levure et les combiner en une cellule de levure seule. A ce jour, un chromosome synthétique, synIII 1, et un bras de chromosome synthétique, synIXR 2, ont été construits et leur fonction in vivo validé en l&#39;absence des chromosomes de type sauvage correspondantes. Une importante caractéristique de conception de chromosomes Sc2.0 est l&#39;introduction de PCRTags, qui sont courtes, recodé séquences au sein des cadres de lecture ouverts (ORF) qui permettent la différenciation des chromosomes synthétiques de leurs homologues de type sauvage. PCRTag amorces hybrident sélectivement soit à des chromosomes de type sauvage ou de synthèse et la présence / absence de chaque type d&#39;ADN peuvent être testés en utilisant un dosage PCR simple. La lecture de la norme d&#39;essai est d&#39;évaluer PCRTag présence / absence d&#39;amplicons par électrophorèse sur gel d&#39;agarose. Cependant, avec une densité de PCRTag amplicon une moyenne de 1,5 kb et par agenome taille de ~ 12 Mo, le génome de Sc2.0 complété va encoder environ 8.000 PCRTags. Pour améliorer le débit, nous avons développé un test de détection basé sur la PCR en temps réel pour le génotypage PCRTag que nous appelons analyse qPCRTag. Le flux de travail spécifie 500 réactions nl dans une plaque multipuits 1536, ce qui nous permet de tester jusqu&#39;à 768 PCRTags avec les deux paires synthétiques et sauvages de type amorce dans une seule expérience.

Nous avons testé synthétique et sauvage de type chromosome 3 PCRTag des paires d&#39;amorces 1 avec l&#39;ADN génomique de levure (de ADNg) extraite de quatre souches différentes. Chromosome 3 dispose de 186 PCRTag paires d&#39;amorces qui couvrent la longueur du chromosome (synIII est ~ 270 kb et de type sauvage chromosome 3 est ~ 315 ko). Pour tester chacune des quatre souches avec deux jeux d&#39;amorces, nous avons divisé la plaque multi-puits en quatre quadrants, un pour chaque type de ADNg, attribuant amorces PCRTag synthétiques à la moitié supérieure de chaque quadrant et de type sauvage à la moitié inférieure. L&#39;ADN génomique a été extrait à partir des souches de levure, dont deux codent type sauvage chromosome 3 (de type sauvage, synIXR 2), tandis que les deux codent chromosome restant synthétique 3 (synIII 1, synIII synIXR). qPCR Master Mix a été distribué dans chaque puits d&#39;une plaque multipuits 1536 en utilisant un distributeur de liquide en vrac, suivie par ADNg et PCRTag amorces en utilisant les Echo 550. amorces étaient vêtus à l&#39;identique danschaque quadrant de la plaque multi-puits pour la comparaison visuelle facile. La plaque multi-puits a ensuite été scellé à chaud avec joint optiquement clair et soumis à une analyse PCR en temps réel. Dans cette expérience, nous avons observé qPCRTag, pour la plupart, l&#39;amplification comme prévu, de sorte que des amorces de synthèse exclusivement amplifiés de l&#39;ADN synthétique et vice versa (figures 2 et 3). Cependant, nous avons également observé plusieurs écarts par rapport à la tendance, ce qui suggère des faux négatifs et de faux positifs dans l&#39;ensemble de données. Dans cette expérience, le contrôle de maître a été détecté dans 100% des puits, indiquant le distributeur de vrac liquide distribué avec succès mastermix dans tous les puits sur la plaque (données non présentées). Cela exclut une source potentielle de faux négatifs. En outre, certains chromosomes 3 PCRTags sont connus à l&#39;échec (représenté sur les figures S6 et S7 de Annaluru et al. 1), comprenant au moins deux SYN et une WTdes paires d&#39;amorces; Ainsi, ces puits peuvent être ignorés dans chaque quadrant. Les vrais faux négatifs pourraient découler d&#39;un manque de transfert de ADNg de modèle ou amorces, cependant, dans notre expérience, compte tenu de la calibration correcte de l&#39;Echo 550 ainsi que la préparation d&#39;ADNg et des amorces telles que décrites, cela n&#39;a pas été une source importante d&#39;erreur. Globalement dans cette expérience le taux de faux négatifs était extrêmement faible pour les amorces WT avec WT gabarit (~ 2%), même si un peu plus élevé pour les amorces SYN SYN avec l&#39;ADN (~ 8%). Les faux positifs, la détection du signal dans les puits où les amorces sont mélangées avec SYN WT ADNg (et vice versa), peuvent résulter de l&#39;amplification croix ou des dimères d&#39;amorces. En effet, les dimères d&#39;amorces sont souvent visibles par électrophorèse sur gel (figure 1B) et représentent une source d&#39;erreur raisonnable. Pour l&#39;application de qPCR, l&#39;examen des courbes de fusion peut être utile pour déterminer si les différentes espèces, telles que des dimères d&#39;amorces, peuvent contribuer à un signal. En outre, performer une expérience de contrôle dans lequel les amorces sont distribués en l&#39;absence de matrice d&#39;ADN peuvent aider à identifier les amorces avec une propension à se dimériser. Cross amplification peut être observée par électrophorèse sur gel, en particulier si un trop grand nombre de cycles de PCR sont réalisées ou si la température de recuit est trop faible. Nous avons essayé de minimiser le nombre de faux positifs en raison de l&#39;amplification croix en optimisant ces deux paramètres pour le protocole qPCRTag. Enfin, en examinant les valeurs point de passage (Cp) pour chaque puits peut aider à identifier des amorces qui ne sont pas adaptés à la détection en temps réel sur la base (Figure 3, par exemple, BB22, FB22, Bb46, FB46). Globalement dans cette expérience le taux de faux positifs était faible pour les amorces SYN avec WT gabarit (~ 5%) et plus élevé pour les amorces WT avec SYN gabarit (~ 10%). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig2.jpg" /> Figure 2: Plaque carte de chaleur figurent présence / abappel sence d&#39;une expérience qPCRTag. Quatre types différents de l&#39;ADN génomique (quadrants séparés par des lignes blanches continues) ont été soumis à une analyse PCRTag utilisant synthétique (SYN) et de type sauvage (WT) chromosome 3 amorces PCRTag (pointillés lignes blanches pour séparer SYN (en haut ) et WT (en bas) dans chaque quadrant). WT et synIXR gDNA codent type sauvage chromosome 3, ce qui donne une amplification avec des amorces WT PCRTag. SynIII et synIII synIXR gDNA codent chromosome synthétique 3, ce qui donne une amplification avec des amorces SYN PCRTag. Amorces sont disposées selon leur positionnement chromosomique de gauche à droite et positionnés de manière identique dans les quatre quadrants pour la comparaison. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52941/52941fig3.jpg" /> Figure 3: chaleur à plaquescarte affichant point de passage (Cp) valeur pour une expérience qPCRTag. Ceci est le même ensemble de données comme dans la figure 2 et le plan de plaque est donc identique. N / A se réfère à «pas d&#39;amplification. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52941/52941fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Les chromosomes concepteurs du projet Synthetic Yeast Genome, Sc2.0, peuvent être distingués de leurs homologues natifs à l’aide d’un test de génotypage basé sur la PCR appelé PCRTagging, qui a un critère de présence/absence. Nous décrivons ici une méthode de détection PCR en temps réel à haut débit pour le génotypage PCRTag.

Analyse qPCRTag - un débit élevé, PCR temps réel pour Sc2.0 Génotypage

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...

L'objectif général de l'analyse QPCR TAG est d'améliorer le débit du test de génotypage PCR TAG du projet de génome synthétique de levure en mettant en œuvre un système de détection par PCR en temps réel et des réactions miniaturisées. Cela est réalisé en utilisant d'abord un distributeur liquide en volume pour répartir le mélange maître QPCR dans chaque puits d'une plaque multipoits 1536. Ensuite, un robot d'éjection de gouttelettes acoustique à l'échelle nanométrique transfère l'ADN matrice et les amorces dans les puits de la plaque multipoits.Ensuite, la plaque est scellée et les réactions sont effectuées dans un thermocycleur A-Q-P-C-R. Enfin, les données de PCR en temps réel sont analysées pour déterminer la présence ou l'absence de marqueurs PCR synthétiques ou de type sauvage à chaque locus. En définitive, le flux de travail avec les marqueurs QPCR améliore le débit.Le principal avantage de cette technique par rapport au test PCR TAG actuel est qu'elle nous permet d'éviter le recours à l'électrophorèse sur gel et à l'annotation manuelle de ces gels. Nous avons eu l'idée de cette méthode en réalisant à quel point le marquage PCR sur les chromosomes plus longs allait être chronophage et laborieux. Après avoir cultivé et récolté environ 2 millions de cellules de levure, ajoutez 200 microlitres de tampon de lyse de levure et pipetez pour resuspendre.Ajouter au culot 300 microlitres de billes de verre traitées à l'acide, jusqu'à environ un millimètre sous le niveau de la cellule, trouble. Ensuite, dans une hotte, ajouter 200 microlitres de phénol-chloroforme-alcool isoamylique, retourner le tube trois fois pour homogénéiser et vérifier que le bouchon est bien fermé. Puis, à l’aide d’un agitateur de banc, agiter le tube pendant 10 minutes à température ambiante ; après centrifugation, transférer 75 microlitres de la phase aqueuse dans un nouveau tube microfuge contenant un millilitre d’éthanol à 100 %.Retournez le tube 10 fois pour mélanger après une nouvelle centrifugation, aspirez le surnageant sans déloger le culot et utilisez 500 microlitres d'éthanol à 70 % pour laver le culot. Après avoir éliminé le surnageant, utilisez 75 microlitres de Tris 10 millimolaire à pH 7,4 pour resuspendre le culot et vortexez pour homogénéiser. Après dilution de l'ADN au ratio de 1 à 10, aliquotez 30 microlitres d'ADN génomique dilué dans le puits approprié d'une plaque source destinée à la distribution acoustique de liquides à l'échelle nanométrique.Préparer 850 microlitres de mélange maître de PCR quantitative dans un tube microfuge de 1,5 millilitre et vortexer pour homogénéiser. Ensuite, centrifuger la solution à 20 800 ×g et à température ambiante pendant deux minutes afin d'éliminer les bulles éventuelles. Puis, à l’aide d’un distributeur multipuits, distribuer 500 nanolitres par puits dans une plaque multipuits 1536.Recueillir le mélange maître de QPCR au fond de chaque puits en centrifugeant brièvement la plaque. Ensuite, à l’aide du système de transfert acoustique de liquide et selon les détails indiqués dans le protocole écrit, distribuer cinq nanolitres d’ADN génomique dilué et dix nanolitres d’amorces avant et arrière prémélangées à 50 micromolaires dans les puits souhaités de la plaque multipuits. La technologie acoustique de gouttelettes utilise le son pour transférer verticalement de petits volumes de liquide d’une plaque source vers une plaque cible inversée.Ici, le modèle, l'ADN et les amorces sont transférés en gouttelettes multiples de 2,5 nanolitre dans les puits d'une plaque multipoits 1536 afin de préparer les réactions de marquage QPCR. Ensuite, utilisez un scellant optiquement transparent et un système de scellage de microplaque pour sceller immédiatement la plaque multipoits 1536.Centrifuger immédiatement la plaque scellée à 2000 G pendant trois minutes à température ambiante afin de rassembler tous les réactifs au fond des puits, puis lancer le programme de PCR en temps réel sur l'appareil de QPCR conformément aux instructions du protocole écrit, et appuyer sur « exécuter » une fois prêt. Vérifier que tous les puits ont passé le contrôle principal, ce qui indique que le mélange maître de QPCR a été détecté dans le puits. Tout puits en échec représente un point de données potentiellement faux négatif.Pour analyser les données, les inspecter visuellement dans le logiciel de PCR quantitative et/ou les exporter pour un traitement hors ligne à partir de l'appareil. Dans cette expérience, des paires d'amorces spécifiques des marqueurs de la chromosome trois sauvage et synthétique ont été testées avec de l'ADN génomique de levure extrait de quatre souches différentes : deux possédant la chromosome trois de type sauvage et deux contenant une chromosome synthétique.Trois amorces synthétiques, comme prévu, amplifient généralement l'ADN synthétique et non l'ADN de type sauvage. De même, les amorces de type sauvage produisent des amplicons exclusivement à partir d'ADN de type sauvage. L'apparition d'un petit nombre de faux positifs et de faux négatifs est attendue, et les sources possibles de ces erreurs sont décrites dans le protocole accompagnant.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en environ une heure du début à la fin. Merci d'avoir regardé et bonne chance dans vos expériences.

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Analyse qPCRTag - un débit élevé, PCR temps réel pour Sc2.0 Génotypage

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