Microbead implantation dans l'embryon de poisson zèbre

L'objectif général de l'expérience suivante est d'utiliser l'implantation de microbilles pour introduire des modifications dans l'environnement tissulaire local à des points spatiaux et temporels spécifiques au cours de l'embryogenèse du poisson zèbre. Cela est réalisé en préparant tout d'abord un plateau d'implantation de billes afin de faciliter la manipulation et l'implantation précises des microbilles. Dans un deuxième temps, les œufs de poisson zèbre sont incubés jusqu'au stade de développement souhaité.

Les microbilles sont ensuite préparées dans les solutions expérimentales appropriées et transférées délicatement à l'emplacement souhaité à l'intérieur de l'embryon. En fin de compte, l'implantation de microbilles peut être réalisée sans perturber le développement normal du poisson zèbre, permettant ainsi d'évaluer les effets des molécules d'intérêt sur l'embryogenèse du poisson zèbre. Cette méthode peut aider à répondre à des questions fondamentales dans le domaine de la biologie du développement, telles que : comment différentes molécules influencent-elles le processus d'organogenèse ?

En général, les personnes novices dans cette méthode éprouveront des difficultés, car il faut de la pratique pour acquérir de l'habileté dans la manipulation des microbilles. Pour préparer le plateau d'implantation des microbilles, chauffez d'abord une solution d'aro à 2 % fraîchement préparée pendant 90 secondes. Dans un flacon Erlenmeyer de 250 millilitres, tournez le flacon toutes les 30 secondes afin d'empêcher le gel de déborder par bouillonnement.

Placez ensuite le couvercle d'une boîte de Pétri de 60 par 15 millimètres dans une boîte de Pétri de 150 par 15 millimètres, le côté intérieur du couvercle étant orienté vers le haut. Fixez alors le couvercle de la plus petite boîte de Pétri avec l'index. Versez le gel d'agarose chaud dans la plus grande boîte.

Laisser se former une fine couche d'agarose sous le petit couvercle afin d'éviter la formation de condensation et de faciliter l'observation des billes au microscope pendant le refroidissement de l'agarose. Avant que celle-ci ne durcisse, incliner lentement un moule à puits dans la partie supérieure du gel pour permettre un positionnement plus aisé des embryons. Une fois le gel solidifié, utiliser une spatule microchirurgicale pour retirer délicatement le moule à puits.

Ensuite, ajoutez la solution E trois à la boîte et conservez-la à quatre degrés Celsius. Pour récolter les embryons de poisson zèbre, remplissez une chambre d'accouplement avec de l'eau du système. Puis placez un séparateur au milieu de la chambre et ajoutez des poissons zèbres mâles et femelles adultes dans les côtés appropriés de la chambre.

Le lendemain matin, utilisez un tamis fin en maille métallique pour recueillir les œufs fécondés. Retournez le tamis à l’envers dans une boîte de Pétri propre de 10 centimètres de diamètre, puis rincez la maille avec un filet fin d’eau E3 jusqu’à ce qu’il ne reste plus aucun œuf dans le tamis et qu’il y ait environ 25 millilitres de solution E3 dans la boîte. Répartissez ensuite les œufs dans plusieurs boîtes, avec 50 à 60 œufs par boîte, afin d’éviter la surpopulation, et incubez les œufs dans la solution E3 à 28,5 degrés Celsius. Avant d’implanter les microbilles, incubez-les dans le volume approprié de la molécule d’intérêt ou d’un véhicule témoin pendant la durée requise.

Ensuite, lorsque les embryons ont atteint le stade de développement souhaité, utilisez des pinces fines pour retirer leurs kons et incubez les poissons zèbres dans une solution de Ringer filtrée, complétée par des antibiotiques, pendant 10 minutes, le temps que les embryons s'acclimatent. Transférez les microbilles dans la plaque de microbilles préparée au préalable, placée dans le plateau d'implantation, puis rincez les billes et la solution de Ringer pendant 10 minutes.

Moins de 50 minutes après le lavage de l'ensemble de billes, manipulez un embryon à la fois dans la cavité du plateau d'implantation, de manière à ce que la zone destinée à l'implantation des microbilles soit accessible. À l'aide d'une aiguille en tungstène, pratiquez une petite incision sur l'embryon, puis appuyez doucement sur l'ampoule d'une pipette capillaire de transfert pour aspirer délicatement une microbille dans la colonne capillaire, puis relâchez la pression afin de délivrer la microbille dans le plateau d'implantation, ce qui facilite sa manipulation. Poussez délicatement la bille pour la faire pénétrer dans la solution de Ringer à l'intérieur du moule.

Ensuite, à l'aide de la microlame, déplacez la microbille sur l'embryon et à l'intérieur de l'incision. Enfin, utilisez l'outil « poil de pinceau » pour éloigner la microbille du site d'incision afin qu'elle ne soit pas expulsée pendant la cicatrisation. Le succès de l'implantation de la microbille peut alors être évalué immédiatement au microscope stéréo, la bille restant stablement positionnée dans le tissu.

Dans cette expérience, des microbilles uniques de deux tailles différentes, rincées uniquement avec une solution de Ringer, ont été implantées dans des embryons de poisson zèbre au stade de bourgeon caudal ou à des points temporels ultérieurs pendant une certaine myogenèse, afin de s'assurer que la position des billes n'a pas changé au cours de l'expérience en raison de la morphogenèse tissulaire endogène. Les échantillons d'embryons peuvent être visualisés par photographie en cours de vie ou examinés à intervalles réguliers, comme le montrent les images d'implantation de microbilles. En l'absence de tout conjugué, des petites molécules peuvent être obtenues sans effets morphologiques importants pendant le développement normal de l'embryon de poisson SPR.

Après cette procédure, d'autres méthodes telles que l'hybridation in situ sur préparations entières peuvent être réalisées afin d'étudier l'effet du microbead sur l'expression génique. Dans l'ensemble, la compréhension de la position du microbead au fil du temps est essentielle pour l'interprétation des résultats, par exemple pour évaluer les effets d'une petite molécule sur un tissu cible ou sur un processus développemental.