Planar Gradient système de diffusion d'enquêter Chimiotactisme dans une matrice de collagène 3D

L’objectif global de cette procédure est de créer une chambre de diffusion à gradient de rabotage pour étudier les taxes de chimiothérapie dans une matrice de collagène 3D. Ceci est accompli en fabriquant d’abord un moule en silicone 3D à l’aide d’une chambre d’imagerie de cellules vivantes. La deuxième étape consiste à fabriquer des lamelles hydrophiles et hydrophobes et à les utiliser pour assembler le moule en silicone 3D.

Ensuite, le mélange de cellules de collagène est ajouté au compartiment central et laissé polymériser. La dernière étape consiste à retirer les lamelles hydrophobes du moule après l’incubation et à ajouter un média ordinaire dans un réservoir et un milieu contenant un attractif de chimiothérapie dans l’autre réservoir. En fin de compte, la microscopie confocale est utilisée pour suivre la chimiotaxie cellulaire au fil du temps et visualiser le déplacement cellulaire dans la matrice de collagène.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux techniques existantes telles que la chambre de boin et la micro-athlétisme, est qu’elle permet une configuration simple pour étudier la migration dans l’espace 3D avec un simple gradient de diffusion, non en utilisant une pipette jetable. Mesurez 150 microlitres d’aminoseline A-P-T-M-S et versez-le dans un tube de 50 millilitres. Ajoutez ensuite 30 millilitres d’éthanol à 100 % dans le tube à l’aide d’une deuxième pipette jetable et fermez le couvercle.

Agitez la solution pendant deux minutes pour assurer un mélange complet. Versez ensuite la solution dans une boîte de Pétri en verre et mettez-la de côté. Ensuite, versez 15 millilitres d’alcool 100 % éthylique dans une deuxième boîte de Pétri et placez-la avec la première boîte à l’aide d’une pipette jetable neuve.

Mesurez 30 millilitres d’eau déminéralisée et versez la solution dans un tube de 50 millilitres. Ensuite, utilisez une nouvelle pipette jetable pour ajouter 1,875 millilitres de glu aldéhyde dans le tube et fermez le couvercle. Agitez la solution pendant deux minutes, puis versez le mélange dans une troisième boîte de Pétri.

À l’aide d’une pince, retirez 1 capot en verre rond de 22 millimètres et rincez les deux côtés avec un mélange à 100 % d’éthanol. À l’aide d’une pipette jetable, placez le couvercle du verre de rinçage dans le premier plat contenant de l’amino-seline et laissez-le reposer dans la solution pendant cinq minutes à l’aide d’une pince. Sortez la lamelle en verre et rincez-la à nouveau avec de l’éthanol à 100 %.

Ensuite, déposez le couvercle en verre rincé, glissez-le dans le plat avec du glutaraldéhyde et mettez-le de côté pendant 30 minutes. Après 30 minutes, retirez la lamelle en verre à l’aide d’une pince et rincez-la à l’eau déminéralisée. Placez la housse rincée sur un mouchoir en papier pour qu’elle sèche toute la nuit à température ambiante.

Pour préparer des lamelles hydrophobes, ajoutez d’abord 500 microlitres de TTS, 100 microlitres d’acide acétique et 19,4 millilitres de heane dans un tube de 50 millilitres et agitez-le pendant deux minutes. Ensuite, versez la solution dans une boîte de Pétri en verre et utilisez des pinces propres pour déposer un couvercle en verre dans la solution préparée et laissez-le là pendant deux minutes. Au bout de deux minutes, retirez la lamelle en verre à l’aide d’une pince et rincez-la à l’eau désionisée à l’aide d’une pipette jetable, placez la lamelle sur un mouchoir en papier et laissez-la sécher à température ambiante pendant la nuit.

Conservez les lamelles de recouvrement séchées dans une boîte de Pétri en plastique jusqu’à ce qu’elles soient nécessaires pour commencer, assemblez la chambre d’imagerie de cellules vivantes comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Ensuite, mélangez les solutions d’élastomère de silicone selon les instructions du fabricant pour fabriquer cinq millilitres d’élastomère. Ensuite, utilisez une spatule de laboratoire jetable pour verser lentement la solution d’élastomère de silicone dans la configuration de la chambre d’imagerie de cellules vivantes afin de ne pas perturber les composants du moule.

Mettez le moule de côté dans un endroit sûr pour conserver la température ambiante pendant la nuit. Le lendemain matin, retirez le moule à l’aide d’une pince et extrayez soigneusement le cube métallique en aluminium usiné du moule. Ensuite, allez à l’évier et rincez le moule à l’eau déminéralisée, puis placez le moule sur une serviette en papier pour sécher.

Une fois sec, utilisez un couteau utilitaire pour couper les fentes à 2,34 millimètres de chaque extrémité longitudinale à l’intérieur du moule en silicone. Assurez-vous que le moule reste dans un endroit sûr et sec jusqu’à ce qu’il soit nécessaire pour l’expérience avant de l’utiliser. Rincez le moule avec de l’éthanol à 90 % et placez le moule dans une boîte de Pétri remplie d’eau déminéralisée pour reposer toute la nuit.

Le lendemain matin, transférez le moule sur une serviette en papier et laissez-le sécher à l’air libre pendant que le moule sèche. Utilisez un outil de traçage en diamant de haute précision pour couper le carré. Le couvercle hydrophile se glisse en deux rectangles, légèrement plus grands que 3,95 millimètres sur 5,99 millimètres.

Ensuite, glissez chacun des glissements du couvercle rectangulaire découpé dans les fentes, coupez dans le moule en silicone, retournez le moule et appliquez de la graisse sous vide le long du fond du moule en silicone à l’aide d’une pipette jetable. Ensuite, retournez le moule à l’endroit et appuyez le bas du moule sur la lamelle circulaire en verre hydrophile. Pour créer un joint, préparez un mélange de milieu et d’attractif de chimiothérapie dans un tube de 15 millilitres à la concentration souhaitée, pipetez cinq millilitres du mélange dans un nouveau tube d’un millilitre et cinq millilitres de milieu ordinaire dans un deuxième tube.

Placez les deux tubes dans un bain-marie chauffé à 37 degrés Celsius. Ensuite, pipetez 30 microlitres de 10 XPBS dans un microtube à centrifuger. Ajoutez six microlitres d’une solution normale d’hydroxyde de sodium dans le même microtube à centrifuger et agitez pendant 15 secondes.

Ajoutez ensuite 18 microlitres de carboxylate fluorescent jaune-vert, des microsphères modifiées dans un micro tube de centrifugation et 168,3 microlitres de glace froide. Tapez un collagène de queue de rat. Agitez le mélange pendant 30 secondes.

Ensuite, ajoutez 77,7 microlitres de la cellule souhaitée. Taper à deux fois 10 aux six cellules par millilitre dans le milieu du microtube de centrifugation et mélanger. À l’aide d’une pointe de pipette pendant 20 secondes, pipetez 300 microlitres du mélange de cellules de collagène dans le puits central de l’ensemble de moule préparé.

Ensuite, placez le moule sur une boîte de Pétri jetable et déplacez-le dans un incubateur standard pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone Après la période d’incubation, utilisez une pince pour retirer les deux lamelles hydrophobes en les fixant sur le dessus de chaque lamelle, puis en tirant vers le haut et en l’éloignant du moule. Déplacez l’ensemble du système vers le microscope et examinez la chambre pour vous assurer que les côtés du moule de collagène sont toujours droits, ce qui permet un gradient de diffusion de raboteur avec un système toujours sous le microscope. Ajoutez 100 microlitres de milieu cellulaire dans le premier puits.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de milieu cellulaire avec la concentration souhaitée d’attractif de chimiothérapie dans le puits de l’autre côté de la matrice. Suivez la migration cellulaire en référence aux microsphères marquées par fluorescence, comme décrit dans le protocole de texte d’accompagnement. La série d’images présentée ici montre la diffusion de la rumine se déplaçant à travers un gel de collagène d’un milligramme par millilitre.

Cet exemple montre le véritable gradient de diffusion planaire du système, qui peut également être attendu de tout attractif de chimiothérapie introduit. Dans l’exemple présenté ici, l’intensité du signal rumin a été mesurée au fil du temps aux endroits identifiés par les carrés rouges. La concentration à chacun de ces endroits est indiquée sur ce graphique sous la forme d’une ligne distincte qui, lorsqu’elle est mesurée à l’état d’équilibre, produit un gradient de concentration linéaire basé sur la position dans le gel.

Cette relation reste linéaire à travers une gamme de concentrations de matrice de collagène, ce qui rend ce système très utile pour les expériences cellulaires. Sur cette image, un neutrophile de couleur rouge est représenté dans une matrice de collagène dispersée par des microsphères vertes fluorescentes qui sont utilisées comme références de position. Les trois images suivantes montrent la migration dirigée du neutrophile alors qu’il se déplace vers le haut d’un gradient d’attractif de chimiothérapie, qui est représenté par la flèche blanche.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de créer une chambre de diffusion simple pour étudier la migration cellulaire dans une matrice de collagène 3D.