Selected Reaction Monitoring spectrométrie de masse pour Absolute quantification des protéines

L’objectif global de cette procédure est d’utiliser la chromatographie liquide, la surveillance de réactions sélectionnées ou L-C-S-R-M pour quantifier l’abondance absolue des protéines cibles dans des échantillons biologiques complexes. Après la sélection des cibles peptidiques, des étalons peptidiques externes bruts sont synthétisés et utilisés pour développer des tests SRM à l’aide de la chromatographie liquide, de la spectrométrie de masse ou de la CML. Les tests qui en résultent sont utilisés pour effectuer des analyses qualitatives lc, SRM d’échantillons biologiques préparés.

Si le peptide cible dérivé de l’échantillon biologique est détecté, les échantillons biologiques sont analysés à l’aide de tests quantitatifs lc SRM en ajoutant une série d’étalons de peptide internes par dilution d’isotopes stables. En fin de compte, le SRM lc peut être utilisé pour quantifier avec précision les protéines d’une grande variété d’échantillons biologiques et pour soutenir les investigations d’une grande variété de cibles protéiques. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les immunoessais est que la mise au point du test est relativement rapide et peu coûteuse, et que les tests qui en résultent se prêtent au multiplexage et ne sont pas vulnérables à la réactivité croisée des anticorps.

Pour commencer, préparer des étalons de peptides lyophilisés comme décrit dans le protocole de texte. Ajoutez ensuite 100 microlitres de solution d’acétonitrile d’acide formique à chaque M d’étalon peptidique lyophilisé pour produire une concentration peptidique de 10 micromolaires. Agitez les échantillons pendant deux minutes et baignez.

Sonicez-les pendant cinq minutes pour vous assurer que la dissolution du peptide est complète. Tirez les peptides dissous et concentrez le mélange obtenu dans un concentrateur sous vide jusqu’à un volume final de 80 microlitres. Ajoutez 20 microlitres d’acétylnitrile pour dissoudre tout peptide précipité.

L’échantillon contient maintenant 10 micromolaires de chaque peptide, ainsi que 20 % d’acétylnitrile volume à volume et peut être utilisé Pour préparer les étalons de peptides internes et externes, analysez les mélanges des étalons de peptides externes à environ un à 10 picomoles de chaque peptide par injection par spectrométrie de masse shotgun à l’aide d’un système HPLC à nano-flux couplé à un spectromètre de masse triple quadruple. Comme détaillé dans le protocole texte, assurez-vous que chaque exécution LCMS comprend un gradient linéaire de 60 minutes, une étape de régénération de colonne et une étape d’équilibrage de colonne ree. Analysez les données de fusil de chasse résultantes à l’aide d’une base de données, en recherchant les séquences des étalons de peptides externes.

Examinez manuellement toutes les identifications de peptides pour vous assurer qu’elles sont toutes sans ambiguïté, en éliminant toute identification de peptides ambiguë. Utilisez le fusil de chasse Ms Peptide identifications pour construire une bibliothèque de spectre à l’aide d’un logiciel tel que Skyline Line. Préparez une liste de transitions lc SRM en utilisant les trois à 10 transitions les plus intenses par ion précurseur.

Utilisez les listes de transition résultantes pour effectuer une analyse lc SRM des mélanges des étalons de peptides externes. Examinez manuellement les données L-C-S-R-M résultantes et supprimez tous les tests peu performants. Pour préparer les échantillons biologiques.

Tout d’abord, récoltez les cellules comme décrit dans le protocole de texte. Ajoutez 400 microlitres de tampon de lyse d’urée fraîchement préparé et mélangez chaque échantillon à l’aide d’un pipetage doux. Transférez chaque échantillon dans un tube de deux millilitres muni d’un bouchon à vis avec un joint torique contenant environ 100 microlitres de billes de silice de zircone de 0,1 millimètre, cellules de lyce en vortex les échantillons pendant cinq minutes à pleine vitesse.

Sonicer les échantillons pendant 10 minutes à température ambiante pour favoriser l’homogénéisation et la maturation des protéines. Effectuez ensuite un dosage de la concentration en protéines des lysats, tel qu’un dosage de l’acide bissy pour une analyse qualitative. Préparez-vous à des aliquotes de 200 microgrammes de lysat cellulaire pour une série de dilutions d’isotopes stables.

Ajouter aux échantillons la série de dilution des isotopes stables du mélange d’échomolaires des étalons peptidiques internes. Réduire les résidus de protéine cystéine en ajoutant 0,7 microlitre d’une molaire de DTT à chaque échantillon et en incubant les échantillons à 60 degrés Celsius pendant 30 minutes. Cystines de protéines alkylates en ajoutant sept microlitres d’acétamide ITO tamponné à chaque échantillon et en incubant les échantillons à température ambiante pendant 20 minutes dans l’obscurité.

Pour chacun des échantillons, ajoutez 482 microlitres de 100 millimolaires d’urée, ajustés avec de l’hydroxyde de sodium, de sorte que la concentration finale d’urée soit d’une molaire. Ensuite, triplement, digérez les protéines en peptides. Ajoutez huit microlitres de trypsine de séquençage de 0,5 microgramme par microlitre à chaque échantillon contenant du lysat cellulaire.

Ensuite, incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 18 heures. Après l’incubation, ajoutez 440 microlitres de 2 % de volume à volume centrifuger tous les échantillons à 21 000 G pendant 20 minutes à température ambiante pour granuler tous les précipités qui obstrueraient une cartouche de C 18 SPE en phase solide. Extrayez chacun des SUP natin à l’aide d’une cartouche jetable C 18 SPE en rafale.

Mouillez la colonne en appliquant un millilitre de tampon B et équilibrez-la en appliquant deux fois un millilitre de tampon a. Forcez les phases mobiles à travers la cartouche C 18 SPE à l’aide d’une surface plane sur une poire en caoutchouc et un collecteur d’extraction. Appliquez l’échantillon et lavez ensuite la cartouche avec un millilitre de tampon A éluez deux fois les peptides en appliquant un millilitre de tampon B. Concentrez lentement chaque ilu dans un concentrateur sous vide jusqu’à un volume final de 100 microlitres pour évaporer l’acétyl nitrile.

Ajoutez ensuite deux microlitres, l’acide formique de 5 % en volume dans l’acétylnitrile à chaque échantillon. Analysez les échantillons à l’aide d’un appareil qualitatif L-C-S-R-M comme précédemment. Pour l’analyse quantitative L-C-S-R-M, exécutez la série de dilution isotopique de chaque échantillon biologique La spectrométrie de masse a été utilisée pour analyser les étalons de peptides externes.

Les 10 transitions les plus intenses par précurseur ont été sélectionnées pour L-C-S-R-M. L-C-S-R-M a ensuite été utilisé pour analyser les étalons peptidiques externes. Les identifications peptidiques qui en résultent doivent être sans ambiguïté.

L’analyse qualitative L-C-S-R-M des échantillons biologiques a généralement donné lieu à un signal de fond plus important, mais la plupart des cibles peptidiques ont été identifiées avec confiance. L’analyse quantitative L-C-S-R-M a été réalisée à l’aide d’étalons peptidiques internes ajoutés aux échantillons biologiques. Les valeurs d’abondance protéique résultantes étaient cohérentes entre les réplicats biologiques et les deux peptides cibles par protéine cible.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de développer et d’effectuer des tests L-C-S-R-M pour quantifier l’abondance absolue des protéines cibles dans des échantillons biologiques complexes.