Name: Selected Reaction Monitoring spectrométrie de masse pour Absolute quantification des protéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Découvrez la quantification absolue de protéines par spectrométrie de masse SRM couplée à la chromatographie liquide. Cette méthode rapide et multiplexée évite la réactivité croisée des anticorps pour l'analyse d'échantillons biologiques complexes.

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Cette recherche a été soutenue par le programme de recherche intra-muros du NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Absolute quantification de protéine est essentielle pour une gamme très diversifiée d&#39;applications biomédicales telles que la validation de biomarqueurs et la transduction du signal de modélisation de la voie. Récemment, la protéomique ciblées utilisant LC-SRM a bénéficié des améliorations apportées à de nombreuses technologies, y compris peptide préparation standard, HPLC, QQQ-MS et LC-SRM analyse des données. Par conséquent, il est devenu une alternative puissante aux immunoessais. Immunoessais peuvent être extrêm...

Expériences protéomiques qui utilisent la spectrométrie de masse (MS) peuvent être conçus pour utiliser soit non ciblée (fusil de chasse) ou des méthodes ciblées. protéomique de découverte repose généralement sur ​​shotgun bottom-up MS, soit en utilisant un mode d&#39;acquisition traditionnelle dépendant des données, ou en utilisant l&#39;une des techniques de données indépendante récemment développés (par exemple, MS E, COULOIR) 1,2. Protéomique fusil de chasse est un outil puissant pour l&#39;identification à haut débit de peptide et la quantification relative, mais il est généralement impropre à la quantification absolue ou pour cibler les petits ensembles définis (~ RTE) de protéines. La méthode de MS le plus souvent utilisé pour la protéomique ciblées est sélectionné surveillance de réaction (SRM) en raison de sa haute sensibilité, la vitesse, et la gamme dynamique 3-5. Alternatives à SRM comprennent la surveillance de réaction parallèle, qui tire parti de haute résolution, MS balayage complet 6. SRM est habituellement effectuée en utilisant un rever nano-débitChromatographie sed phase liquide à haute performance (nano-RP-LC) couplée à un instrument ionisation nano-électrospray (nano-ESI) source d&#39;ions attaché à un spectromètre de masse triple quadripôle (QQQ-MS). Dans une expérience typique, les protéines de l&#39;échantillon sont digérés par protéolyse, et les peptides obtenus sont séparés par chromatographie, désorbés, et ionisés. Les ions précurseurs qui en résultent sont m / z filtré par le premier quadrupôle (Q1) et fragmentée dans le deuxième quadrupôle (Q2) par les collisions avec un gaz de collision. Les ions fragments résultant sont m / z-filtré dans le troisième quadrupôle (Q3) et quantifié par une dynode. Chaque paire de précurseur et ion de fragment est considéré comme une transition, et chaque transition est surveillée pour une période déterminée de temps (le temps de séjour; typiquement 2-50 msec). Pendant LC-SRM, les cycles QQQ-MS à travers une liste prédéfinie de transitions (le cycle de service est généralement ≤3 sec), et un chromatogramme de chaque transition est produite. Alternative stratégs pour la quantification des protéines utilisent généralement des dosages immunologiques tels que des transferts de points, des transferts de Western, ELISA, anticorps, puces inverse des puces à protéines de phase, immunoessais microfluidiques, ELISA numériques et immunoessais base microsphères-7. Les meilleurs dosages immunologiques peuvent être beaucoup plus sensibles que les LC-SRM, et le débit de l&#39;échantillon des immunodosages peuvent être significativement supérieur à celui de LC-SRM 5. Cependant, immunoessais en développement peuvent être coûteux et / ou de temps, et les dosages en résultent peuvent être vulnérables à la réactivité croisée et / ou des interférences, incompatible avec la cellule / lyse des tissus / méthodes d&#39;homogénéisation et / ou ne se prêtent pas au multiplexage 5,8. Certains de ces problèmes peuvent être résolus par couplage techniques anticorps-et MS. Par exemple, les protéines cibles peuvent être enrichies en utilisant une immunoprécipitation préalable à la protéolyse et LC-SRM 12/09. En variante, la technique d&#39;immunoprécipitation SISCAPA emploie ultérieure à la protéolyse à la leve peptidiquel 13,14. En plus des stratégies immunoenrichment, immunodéplétion de protéines de grande abondance peut être utilisé pour augmenter la sensibilité LC-SRM en réduisant les interférences par coélution analytes 15,16. Quantification des protéines MS peut être divisé en quantification relative et absolue, et aussi dans et stable sans marqueur isotopique étiquetage (par exemple, l&#39;étiquetage métabolique, l&#39;étiquetage des produits chimiques, et de protéines lourde marqué et peptidiques normes internes). Techniques sans étiquette peut être utile pour la quantification des protéines rapport, mais ne conviennent pas pour la quantification absolue précision. Par comparaison, les techniques de marquage ont réduit erreur associée à la préparation de l&#39;échantillon et la variance MS, et sont souvent utilisés pour la protéine par rapport quantification 17. Par exemple, les normes (Silap) des isotopes stables du protéome marqué préparés en utilisant une lignée cellulaire humaine cultivées permis quantification relative de biomarqueurs potentiels via LC-SRM de sérum humain 18. Absolue précise la quantification des protéines par MS exige que les normes internes purifiée, quantifiés, protéines ou peptides marqués par des isotopes être dopés-en échantillons biologiques avant MS. L&#39;incorporation des normes internes marqués d&#39;isotopes lourd dans un flux de travail LC-SRM permet une quantification absolue qui a été montré pour être hautement reproductible et transférable entre les laboratoires 16,19. Isotopes stables étiquetés normes internes pour la protéine absolue quantification par MS comprennent des normes peptidiques préparés en utilisant la synthèse en phase solide 20, composées de protéines normes peptidiques de la protéase clivable concaténés 21, et 22 normes protéines pleine longueur. Cible de modification covalente de protéines et de préparation de l&#39;échantillon incomplet (c.-à-lyse incomplète de l&#39;échantillon et l&#39;homogénéisation, et incomplète solubilisation de la protéine, dénaturation, alkylation, et la protéolyse) peut nuire à une quantification précise. P internerotein normes sont les moins susceptibles d&#39;être affectés par la plupart de ces problèmes potentiels, mais ils sont généralement les plus difficiles à préparer. Une alternative consiste à analyser chaque protéine cible à l&#39;aide de multiples normes de peptides internes qui sont conçues pour inclure des résidus flanquant natifs amino et du carboxy terminal. Indépendamment du type de l&#39;étalon interne est utilisé, il doit être enrichi dans les échantillons-biologiques au plus tôt un point lors de la préparation de l&#39;échantillon que possible. En outre, les techniques de préparation d&#39;échantillons multiples (par exemple, différentes conditions de dénaturation) doivent être testés. L&#39;utilisation de plusieurs techniques expérimentales orthogonales (cross-validation expérimentale) est une stratégie viable pour surmonter les plus quantification potentiel défis 23-25. LC-SRM quantification de protéines est une technique très souple qui a été utilisée dans une grande variété d&#39;applications. Notamment, il a été utilisé pour étudier peptides et de protéines à l&#39;intérieur de biomarqueurséchantillons cliniques tels que le sérum, les biopsies de base, et des aspirations à l&#39;aiguille fine 5. LC-SRM a également été utilisée pour mesurer la stoechiométrie des complexes protéiques 5,26, pour détecter des neurotoxines botuliniques 27, pour quantifier la dynamique de phosphorylation de protéine à l&#39;intérieur des voies de signalisation 5, et à quantifier des changements dans la conformation des protéines 28. Notre laboratoire utilise LC-SRM pour quantifier les protéines de signalisation qui interviennent dans le chimiotactisme des macrophages pour soutenir le développement de simulations de la voie de la chimiotaxie. Le schéma global du protocole (Figure 1) commence avec le classement des peptides cibles provisoires. Par la suite, les normes peptidiques externes bruts sont synthétisés et utilisés pour développer des tests LC-SRM pour des analyses qualitatives des échantillons biologiques. Si le peptide cible biologique de l&#39;échantillon dérivé est détectée, les normes lourds marqué purifiés peptidiques internes sont préparés pour quantitative LC-SRM. Ce protocole peut être utilisé pour acquantifier curately protéines à partir d&#39;une grande variété d&#39;échantillons biologiques, et d&#39;appuyer les enquêtes d&#39;une grande variété de protéines cibles.

<table><tbody><tr><td>Acétonitrile (ACN), grade LC-MS</td><td>Fisher</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage des protéines BCA (acide bicinchoninique)</td><td>Fisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Perles pour battre les billes, zircone-silice, 0,1 mm</td><td>BioSpec Products</td><td>11079101z</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de béstatine</td><td>Sigma</td><td>B8385-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Culture cellulaire DMEM (avec glucose, sans L-glutamine)</td><td>Lonza</td><td>12-614F</td><td></td></tr><tr><td>Culture cellulaire EDTA, 500 mM, pH8</td><td>Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>Culture cellulaire sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>Culture cellulaire L-glutamine</td><td>Sigma</td><td>G8540-25G</td><td></td></tr><tr><td>Culture cellulaire solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pH 7,4</td><td>Gibco</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>Culture cellulaire Coloration de viabilité au bleu trypan, 0,4 % p/v</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Cellomètre Compteur de cellules Auto T4</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellomètre Auto T4</td><td></td></tr><tr><td>Chambres de comptage jetables Auto T4</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>CHT4-SD100-014</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D5545-5G</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique, grade LC-MS, ampoules</td><td>Fisher</td><td>A117-10X1AMP</td><td></td></tr><tr><td>Hémocytomètre, amélioré par Neubauer, 0,1 mm de profondeur</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>0640030</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, 1 M, pH 7,2</td><td>Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique, 37 % p/p</td><td>VWR</td><td>BDH3028-2,5LG</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacétamide</td><td>Sigma</td><td>I1149-5G</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipettes à base laser</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-2000</td><td></td></tr><tr><td>Capillaire en silice revêtu de LC, 50 & micro ; Polymicro</td><td>Technologies</td><td>1068150017</td><td></td></tr><tr><td>flacon LC, passeur d’échantillons, polypropylène 12 mm x 32 mm</td><td>SUN SRI</td><td>200-268</td><td></td></tr><tr><td>LC bouchon à vis, passeur d’échantillons, PTFE/silicone pré-fendu</td><td>SUN SRI</td><td>500-061</td><td></td></tr><tr><td>Luciférase, de Photinus pyralis</td><td>Sigma</td><td>L9506-1MG</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatine A</td><td>EMD Millipore</td><td>516481-25MG</td><td></td></tr><tr><td>bandelettes de pH colorpHast (pH 0.0-6.0)</td><td>EMD Chemicals</td><td>9586-1</td><td></td></tr><tr><td>PhosStop cocktail inhibiteur de phosphatase</td><td>Roche</td><td>04906837001</td><td></td></tr><tr><td>RapiGest SF</td><td>Waters</td><td>186001861</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, C18 1 ml 100 mg</td><td>cartouche Waters</td><td>WAT023590</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, collecteur d’extraction, 20 positions</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak SPE, ampoule en caoutchouc à surface plane</td><td>Fisher</td><td>03-448-25</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Fisher</td><td>S318-500</td><td></td></tr><tr><td>Concentrateur sous vide SpeedVac</td><td>Fisher</td><td>SPD111V</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique (TFA), grade LC-MS</td><td>Fisher</td><td>A116-50</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine, grade de séquençage,</td> tube <td>Promega</td><td>V5113</td><td></td>modifié</tr><tr><td> décapsuleur pour tubes Micronic</td><td>USA Scientific</td><td>1765-4000</td><td></td></tr><tr><td>Tubes, microcentrifugeuse de 2 ml, joint torique à vis, stérile</td><td>Sarstedt</td><td>72.694.006</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma</td><td>U0631-500g</td><td></td></tr><tr><td>Eau, grade LC-MS</td><td>Fisher</td><td>W6-1</td><td></td></tr></tbody></table>

selected reaction monitoring spectrométrie de masse pour absolute quantification des protéines

Selected Reaction Monitoring Mass Spectrometry for Absolute Protein Quantification

La quantification absolue des protéines cibles dans des échantillons biologiques complexes est essentielle à un large éventail d’applications de recherche et cliniques. Ce protocole fournit des instructions étape par étape pour le développement et l’application de tests quantitatifs à l’aide de la spectrométrie de masse (MS) de surveillance de réaction (SRM) sélectionnée. Tout d’abord, les peptides cibles quantotypiques probables sont identifiés sur la base de nombreux critères. Cela comprend l’identification des peptides protéotypiques, l’évitement des sites de modification post-traductionnelle et l’analyse de l’unicité du peptide cible par rapport à la protéine cible. Ensuite, des étalons peptidiques externes bruts sont synthétisés et utilisés pour développer des tests SRM, et les tests résultants sont utilisés pour effectuer des analyses qualitatives des échantillons biologiques. Enfin, des étalons peptidiques internes purifiés, quantifiés et marqués aux isotopes lourds sont préparés et utilisés pour effectuer des tests SRM en série de dilution isotopique. L’analyse de toutes les données MS résultantes est présentée. Ce protocole a été utilisé pour tester avec précision l’abondance absolue des protéines de la voie de signalisation de la chimiotaxie dans les cellules RAW 264.7 (une lignée cellulaire de monocytes/macrophages de souris). La quantification de Gi2 (une sous-unité α-protéine G hétérotrimérique) est décrite en détail.

Le développement de modèles informatiques de prévision de voies de signalisation est l&#39;un des objectifs fondamentaux de la biologie des systèmes 53. Malheureusement, même pour les voies qui ont été largement étudiés et ont une haute signification clinique de signalisation, il est encore généralement pas possible de prédire quantitativement le comportement voie en réponse à des perturbations (par exemple, cela est vrai pour le / ERK MAPK 54). Récemment, une enquête employée protéomique,...

Ce protocole décrit comment effectuer des tests de quantification absolue de protéines cibles dans des échantillons biologiques complexes à l’aide d’une surveillance de réaction sélectionnée. Il a été utilisé pour quantifier avec précision les protéines de la voie de signalisation de la chimiotaxie des macrophages de souris. La sélection des peptides cibles, la mise au point d’essais et les essais qualitatifs et quantitatifs sont décrits en détail.

Selected Reaction Monitoring spectrométrie de masse pour Absolute quantification des protéines

Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This ...

L'objectif général de cette procédure est d'utiliser la chromatographie liquide couplée à la surveillance de réactions sélectionnées, ou L-C-S-R-M, afin de quantifier l'abondance absolue de protéines cibles dans des échantillons biologiques complexes. Après sélection des peptides cibles, des étalons peptidiques externes bruts sont synthétisés et utilisés pour développer des tests SRM par chromatographie liquide et spectrométrie de masse, ou LCM ms. Les tests obtenus sont ensuite utilisés pour réaliser une analyse qualitative lc-SRM d'échantillons biologiques préparés.Si le peptide cible issu de l'échantillon biologique est détecté, les échantillons biologiques sont analysés à l'aide de dosages SRM en chromatographie liquide (lc SRM) quantitatifs en ajoutant une série de dilution d'isotopes stables composée d'étalons internes peptidiques. En fin de compte, la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en mode sélection de réaction (lc SRM) peut être utilisée pour quantifier précisément des protéines provenant d'une grande variété d'échantillons biologiques et pour soutenir l'étude d'une large gamme de cibles protéiques. Le principal avantage de cette technique par r

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Selected Reaction Monitoring spectrométrie de masse pour Absolute quantification des protéines

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