Name: Quantification des cytosolique vs Vacuolar Salmonella Dans les macrophages primaires par différentiel Perméabilisation (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: Découvrez la quantification de Salmonella typhimurium cytosolique et vacuolaire dans les macrophages dérivés de moelle osseuse par perméabilisation différentielle au digitonin. Cette méthode FACS permet d'étudier les interactions hôte-pathogène.

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Nous tenons à remercier Mathias S. Dick, Roland F. Dreier et Sebastian Rühl de discussion. Ce travail a été soutenu par un professeur FNS PP00P3_139120 / 1 et une Université de Bâle subvention de projet ID2153162 à PB

1. Digitonine Assay avec mCherry exprimant Salmonella (FACS-base Analyse) <ol><li> Préparation des bactéries Remarque: Salmonella de type sauvage SL1344 (Résistance à la streptomycine) exprimant mCherry partir d&#39;un plasmide (pFPV codant mCherry sous le promoteur de RPSM) est utilisé dans cet essai. Phagocytose bactérienne et la prolifération où pas modifiée par l&#39;expression constitutive de mCherry (données non présentées) 16. <ol><li> Inoculer la souche 1 jour avant l&#39;infection dans 3 ml de milieu LB additionné de streptomycine (90 ug / ml) et de l&#39;ampicilline (100 ug / ml, vecteur exprimant mCherry) dans un agitateur à 37 ° CO / N. </li></ol></li><li> Étalement des cellules de l&#39;infection. <ol><li> BMDMs de type sauvage de semences dans une plaque à 24 puits à une densité de 1,25 x 10 5 cellules / puits dans 1 ml de milieu de macrophages primaire (DMEM supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal (FCS, inactivé à la chaleur, 56 ° C, 30 min ), 1% HEPES, 1% d&#39;acides aminés non essentiels (AENA), 1% de L-glutamine et 10% L929 surnageant (milieu conditionné à partir de facteur de stimulation des colonies (M-CSF des macrophages) produisant des cellules L929). puits de semences conformément au tableau 1 pour tenir compte des conditions individuelles. Ajouter des lamelles dans les puits utilisés comme témoins (Tableau 1). </li><li> Incuber les cellules pendant une nuit dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li></ol><table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td colspan="2"> Perméabilisation </td><td colspan="3"> Tachant </td></tr><tr><td></td><td> Lamelle de verre </td><td> Salmonella </td><td> Digitonine </td><td> Saponine </td><td> anti-Salmonella </td><td> anti-Calnexin </td><td> anti-PDI </td></tr><tr><td> A1 (échantillon) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A2 (échantillon) </td><td> - / + * </td><td> + </td&gt; <td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A3 (échantillon) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A4 (pas de contrôle de perméabilisation) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> A5 (contrôle complet de perméabilisation) </td><td> - / + * </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td> + </td><td></td><td></td></tr><tr><td> B1 (colorées pour la calnexine) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B2 (colorées pour la calnexine) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> B3 (colorées pour la calnexine) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td></tr><tr><td> C1 (coloréespour PDI) </td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C2 (colorées pour PDI) </td><td> + </td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td></td><td> + </td></tr><tr><td> C3 (colorées pour PDI) </td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td><td></td><td></td><td> + </td></tr></tbody></table> Tableau 1: Schéma de placage pour les macrophages dérivés de moelle osseuse (BMDMs) dans un format de 24 puits pour une infection ultérieure par la bactérie Salmonella, perméabilisation, et la coloration * Selon que le protocole 1 ou 2 du protocole est fait.. <ol start="3"><li> Préparer les bactéries de l&#39;infection. <ol><li> Le jour suivant, déterminer la concentration de Salmonella dans la culture d&#39;une nuit en diluant la culture 1:10 dans du PBS et mesure de la DO 600 contre seulement un témoin PBS. Cela garantit que la DO 600 est mesuré dans le lgamme inear du spectrophotomètre. </li><li> Calculer la concentration de Salmonella par ml. Une DO600 de 1 correspond à 1 x 10 9 bactéries. </li><li> Diluer les bactéries dans un milieu macrophage pour atteindre une concentration de Salmonella de 1,25 x 10 6 cellules / ml. </li></ol></li><li> L&#39;infection des cellules avec Salmonella. <ol><li> Éliminer le milieu de BMDMs. Ajouter 1 ml de milieu de macrophages dans les puits témoins non infectées (B1-B3, C1-C3). Ajouter 1 ml de suspension de Salmonella godets A1 - A5 pour accéder à une multiplicité d&#39;infection (moi) de 10 bactéries par cellule. </li><li> Centrifuger la plaque pendant 15 minutes à 300 xg à 37 ° C pour synchroniser l&#39;infection. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Tuer Salmonella extracellulaire avec la gentamicine. <ol><li> À 1 h post-infection, enlever la plaque de l&#39;incubateur et ajouter 0,1 ml de milieu macrophage contenant 0,1 mg / ml de gentamicinepour tuer les bactéries extracellulaires. Ajouter gentamicine à tous les puits, même à des témoins non infectés, afin de garantir que toutes les cellules sont traitées de la même manière. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Lavage des cellules. <ol><li> A 2 heures après l&#39;infection, retirez la plaque de l&#39;incubateur et laver tous les puits 2x avec 1 ml de DMEM brut (préchauffé à 37 ° C) et le remplacer par milieu macrophage (préchauffé à 37 ° C) contenant 10 pg / ml &#160; Gentamycine pour empêcher la croissance de toutes les bactéries extracellulaires restantes. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Préparation des tampons fraîches avec des détergents et des anticorps. <ol><li> Juste avant le point de temps désiré de l&#39;analyse, préparer une solution de pâte fraîche de digitonine à 1 mg / ml dans le tampon KHM (110 mM acétate de potassium, HEPES 20 mM, MgCl2 2 mM, pH 7,3). Filtrer le bouillon et diluer dans KHM tampon à une concentration de travailde 50 pg / ml de digitonine. En outre, préparer une solution à 0,1% de saponine dans du tampon KHM, un anticorps anti-Salmonella couplé au FITC (CSA-1-FITC) à 1/500, anti-calnexine à 1/100 ou anti-PDI à 1/100 dans KHM Tampon complété par 3% de BSA. </li></ol></li><li> Perméabilisation cellulaire. <ol><li> Retirer la plaque de l&#39;incubateur et laver les puits 3x avec 0,5 ml de tampon KHM (préchauffé à 37 ° C). Retirer KHM tampon et ajouter 0,25 ml de tampon plaine KHM aux puits A4 et B1 / C1, KHM tampon avec de la digitonine aux puits A1 - A3 et B2 / C2 ou KHM tampon avec de la saponine à godets A5 et B3 / C3 (selon le tableau 1). Incuber pendant exactement 1 min à température ambiante et laver immédiatement tous les puits 3x avec 0,5 ml de tampon KHM (pré-chauffé à 37 ° C). </li></ol></li><li> Coloration d&#39;anticorps primaire. <ol><li> Retirez le tampon KHM et ajouter les solutions d&#39;anticorps primaires (de chèvre anti Salmonella -FITC, 250 pl / puits, 0,1 pg / ml) dans les puits appropriés (Figure 1 </stRong&gt;, tableau 1). Incuber la plaque pendant 15 min dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li><li> Laver les cellules 1x avec 1 ml de PBS. </li></ol></li><li> Les cellules infectées (puits de A1 - A5): analyse de FACS <ol><li> Laver les cellules 3x avec PBS et ajouter 0,5 ml de PBS glacé contenant 0,1% de Triton. Transfert à un tube de 5 ml FACS avec bouchon de crépine de cellules pour briser des agrégats de cellules. Garder les échantillons sur la glace. </li><li> Analyser les échantillons d&#39;un FACS. Utilisation des commandes entièrement perméabilisées, réglez la porte pour le total des bactéries basée sur l&#39;avant et la dispersion latérale (FSC / SSC) en premier, et le signal mCherry (610 nm ± 20 nm de filtre). </li><li> Ensuite, analyser le signal FITC dans la population bactérienne totale en utilisant les contrôles perméabilisées entièrement perméabilisées et non pour régler les portes pour les bactéries cytosoliques (FITC +, mCherry +) et les bactéries vacuolaires (FITC, mCherry +) (Figure 3). </li><li> Avec les portes définies, analyser les échantillons et déterminer le pourcentage de vs cytosoliquevacuolaires bactéries en utilisant le logiciel FlowJo selon le protocole du fabricant. </li></ol></li><li> Contrôles de perméabilisation non infectées (puits B1 - B3, C1 - C3): microscopie <ol><li> Fixation <ol><li> Retirer du PBS et ajouter 250 microlitres de PFA 4% dans du PBS. Incuber pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Laver les puits avec 2x 1 ml de PBS et on ajoute 250 ul de 0,1 M de glycine dans du PBS pendant 10 min à étancher le fixateur. Laver les puits avec 2x 1 ml de PBS. </li></ol></li><li> Coloration d&#39;anticorps secondaire. <ol><li> Contrôle de perméabilisation tache pendant une heure à température ambiante avec des anticorps secondaires couplés à des fluorophores appropriés dans du PBS supplémenté avec 0,1% de saponine et 3% de BSA à perméabiliser les cellules pleinement. </li><li> Laver lamelles de 3x avec 1 ml de PBS et le montage des lamelles couvre-objet pour l&#39;analyse dans un milieu de montage avec du DAPI (1,5 ug / ml). </li></ol></li><li> analyse par microscopie. <ol><li> Analyser les lamelles avec les contrôles à un grossissement de 63X 40X ou en utilisant un confocal fluomicroscope rescence. Si la perméabilisation a travaillé, il devrait y avoir aucune coloration pour des cellules non perméabilisées, Calnexin coloration pour les deux cellules et digitonin- saponine perméabilisées et PDI coloration uniquement pour les cellules de saponine perméabilisées (figure 4). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Digitonine Assay avec Unlabeled Salmonella (analyse basée Microscopie-) <ol><li> Préparation des bactéries pour O / N cultures. <ol><li> Inoculer non marqué Salmonella de type sauvage SL1344 (Résistance à la streptomycine) 1 jour avant l&#39;infection dans 3 ml de milieu LB additionné de streptomycine (90 pg / ml) dans un shaker à 37 ° CO / N. </li><li> Étalement des cellules de l&#39;infection. <ol><li> BMDMs de semences dans une plaque à 24 puits contenant des lamelles de verre stériles à une densité de 1,25 x 10 5 cellules / puits dans 1 ml de milieu macrophage (DMEM complété avec 10% de sérum de veau foetal (FCS, de-complétés, 56 ° C,30 min), 1% HEPES, 1% des acides aminés L-non-essentiels (NEAA), 1% de L-glutamine et 10% L929 surnageant). puits de semences conformément au tableau 1 pour tenir compte des conditions individuelles. </li><li> Incuber les cellules S / N, dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Préparer les bactéries de l&#39;infection. <ol><li> Le jour suivant, déterminer la concentration de Salmonella dans la culture O / N par dilution de la culture 1:10 dans du PBS et mesure de la DO 600 contre seulement un témoin PBS. Cela garantit que la DO 600 est mesurée dans la plage linéaire du spectrophotomètre. </li><li> Déterminer la concentration de Salmonella par millilitre. Une DO 600 de 1 correspond à 1 x 10 9 bactéries. </li><li> Diluer les bactéries dans un milieu macrophage pour atteindre une concentration de Salmonella de 1,25 x 10 6 cellules / ml. </li></ol></li><li> L&#39;infection des cellules avec Salmonella. <ol&gt; <li> Éliminer le milieu de tous les puits. Ajouter 1 ml de milieu de macrophages brut aux puits témoins non infectés (B1 - B3, C1 - C3). Ajouter 1 ml de suspension de Salmonella godets A1 - A5 pour accéder à une multiplicité d&#39;infection (moi) de 10 bactéries par cellule. </li><li> Centrifuger la plaque pendant 15 minutes à 300 xg à 37 ° C pour synchroniser l&#39;infection. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Tuer Salmonella extracellulaire avec Gentamycin. <ol><li> À 1 h post-infection, enlever la plaque de l&#39;incubateur et ajouter 0,1 ml de milieu macrophage contenant 1 mg / ml Gentamycin pour tuer les bactéries extracellulaires à tous les puits. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Lavage des cellules. <ol><li> À 2 heures post-infection, enlever la plaque de l&#39;incubateur et laver chaque puits 3x avec 1 ml de milieu macrophage frais contenant 10 pg / ml Pour empêcher la gentamycinela croissance de toutes les bactéries extracellulaires restantes. Transférer la plaque dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. </li></ol></li><li> Préparation des tampons fraîches avec des détergents et des anticorps. <ol><li> Juste avant le point de temps désiré de l&#39;analyse, préparer une solution de pâte fraîche de digitonine à 1 mg / ml dans le tampon KHM (110 mM acétate de potassium, HEPES 20 mM, MgCl2 2 mM, pH 7,3). Filtrer le bouillon et diluer dans KHM tampon à une concentration de travail de 50 pg / ml de digitonine. </li><li> En outre, à préparer une solution de 0,1% de saponine dans du tampon KHM, FITC anti- Salmonella (CSA-1, 0,1 ug / ml), anti-calnexine à 1/100 ou anti-PDI au 1/100 dans du tampon additionné de KHM 3% de BSA (voir le tableau des matériaux pour la concentration d&#39;anticorps). </li></ol></li><li> Perméabilisation cellulaire. <ol><li> Retirer la plaque de l&#39;incubateur et laver les puits 3x avec 0,5 ml de tampon KHM (préchauffé à 37 ° C). Retirer KHM tampon et ajouter 0,25 ml de tampon plaine KHMles puits A4 et B1 / C1, KHM tampon avec de la digitonine à godets A1 - A3 et B2 / C2 ou KHM tampon avec de la saponine à puits A5 et B3 / C3 (selon le tableau 1). Incuber pendant exactement 1 min à température ambiante et laver immédiatement tous les puits 3x avec 0,5 ml de tampon KHM (pré-chauffé à 37 ° C). </li></ol></li><li> Coloration d&#39;anticorps primaire. <ol><li> Retirer le tampon KHM et ajouter les solutions d&#39;anticorps primaire (anticorps de chèvre anti-FITC Salmonella CSA1, 250 ul / puits, 0,1 ug / ml) dans les puits appropriés (figure 2, tableau 1). Incuber la plaque pendant 15 min dans un incubateur à 37 ° C et 5% de CO 2. Laver 3x avec 1 ml de PBS. </li></ol></li><li> Fixation. <ol><li> Retirer du PBS et ajouter 250 microlitres de PFA 4% dans du PBS. Incuber pendant 10 min à 37 ° C. </li><li> Laver les puits avec 2x 1 ml de PBS et on ajoute 250 ul de 0,1 M de glycine dans du PBS pendant 10 min à étancher le fixateur. Laver les puits avec 2x 1 ml de PBS. </li></ol></li><li> TotalSalmonella coloration des échantillons infectés. <ol><li> Laver lamelles de 3x avec PBS avec 0,1% de saponine / 3% de SAB et les échantillons incuber avec un anticorps anti-CSA1 (chèvre anti-CSA1, 0,1 ug / ml, souris anti-LPS fonctionne aussi bien, 0,1 ug / ml) pendant 1 heure à température ambiante dans du PBS avec 0,1% de saponine / 3% de SAB. </li><li> Laver 3x dans PBS avec 0,1% de saponine / 3% de BSA. Incuber vos échantillons avec un anticorps secondaire anti-chèvre couplé à un fluorophore de choix dans de la PBS avec 0,1% de saponine / 3% de SAB pendant 30 minutes à température ambiante dans l&#39;obscurité. </li><li> Laver lamelles de 3x avec 1 ml de PBS et le montage des lamelles couvre-objet pour l&#39;analyse dans un milieu de montage avec du DAPI (1,5 ug / ml). </li></ol></li><li> analyse par microscopie. <ol><li> Acquérir des données avec un microscope confocal en comptant Salmonella cytosolique (anti-Salmonella -FITC positif) et le total Salmonella (positive double) (Figure 5). contrôles de perméabilisation devraient montrer: pas de coloration pour les cellules non perméabilisées, Calnexin scontenant des cellules perméabilisées digitonine-PDI et la coloration pour des cellules de saponine perméabilisées (figure 4). Wells A4 et A5 se servir de témoins internes pour la coloration Salmonella. </li></ol></li></ol></li></ol>

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</ol>

Nous n’avons rien à divulguer.

Perméabilisation différentiel est une méthode simple et robuste pour analyser et de quantifier la distribution subcellulaire des bactéries pathogènes entre les compartiments vacuolaires et le cytosol. Le même essai a été utilisé avec succès par des bactéries telles que Francisella novicida 2,4 et 12 Shigella flexneri. Cependant, étant donné que beaucoup pathogène intracellulaire altérer ou modifier les structures endomembranaires d&#39;accueil, la robustesse de la perméabilisation...

Les bactéries pathogènes intracellulaires se répliquent soit directement dans le cytosol de la cellule hôte, ou dans des compartiments spécialisés vacuolaires 1. Durant la phase initiale de l&#39;infection la plupart des pathogènes se internalisés soit par phagocytose par des cellules spécialisées (telles que les macrophages) ou par la promotion active de leur propre absorption dans des cellules non-phagocytaires. Dans les cellules phagocytaires, le phagosome fusionne généralement avec les lysosomes pour former un compartiment de dégradation, où les particules phagocytées sont digérés. Cytosoliques bactéries spécialisées, telles que Francisella novicida ou Shigella flexneri, échapper à la dégradation du phagosome en induisant la rupture du phagosome et d&#39;échapper par la suite dans le cytosol 2,3. Cela nécessite mécanisme de virulence associés tels que l&#39;île Francisella pathogénicité (FPI) ou Shigella flexneri SST3, qui injecte des protéines effectrices qui favorisent vacuolaire rupture 2-4. Les caractéristiques de cytosol de la cellule hôteun certain nombre de récepteurs conservés de reconnaissance des formes qui reconnaissent normalement la présence de pathogènes et induisent immunitaire inné signalisation 5. En outre, xenophagy, une forme anti-microbienne de l&#39;autophagie peut dégrader les bactéries qui pénètrent dans le cytosol. Cytosoliques bactéries sont normalement bien adaptés à émousser ou de contourner ces réponses en utilisant différentes stratégies. Par exemple, Francisella modifie ses LPS pour éviter la reconnaissance de l&#39;hôte et Shigella empêche le recrutement de l&#39;autophagie en utilisant des protéines effectrices sécrétées 6,7. Une autre stratégie pour échapper à la dégradation lysosomale est employé par le modèle vacuolaire pathogène Salmonella enterica sérotype Typhimurium, par la suite dénommée Salmonella typhimurium. Salmonella utilise un SST3 d&#39;injecter effecteurs qui remodèlent le phagosome initiale dans sa niche intracellulaire, la Salmonella contenant vacuole (SCV) 8,9. La manipulation continue des voies d&#39;accueil estnécessaire pour maintenir cette vacuole en recrutant des lipides et autres nutriments vers la vacuole. En effet, un mutant de Salmonella SIFA ne parvient pas à maintenir la stabilité vacuolaire, et pénètre dans le cytosol des cellules hôtes en quelques heures après l&#39;infection, ce qui conduit à l&#39;activation des voies immunitaires innées et le recrutement de autophagie 8. Évasion Vacuolar de Salmonella varie en fonction du type de cellule qui est des études, et plusieurs rapports ont montré que dans les cellules épithéliales même WT Salmonella peut échapper à la SCV et hyperreplicate dans le cytosol 10. Des rapports récents montrent que la détection immunitaire innée des pathogènes vacuolaires dépend aussi de la capacité de l&#39;hôte à reconnaître et à déstabiliser vacuoles contenant pathogènes (PCV) 11-14. Étant donné que l&#39;hôte ou des bactéries génotype peuvent affecter la distribution des bactéries intracellulaires entre le vacuolaire et le compartiment cytosolique, il est nécessaire de quantifier le nombre de vacuolaire vs.bactéries cytosoliques. Etant donné que, dans la plupart des configurations expérimentales cellules hôtes sont infectées avec plus d&#39;une bactérie, et par la suite peuvent abriter plusieurs bactéries dans différents compartiments sous-cellulaires, une technique est nécessaire qui permet la quantification de la teneur en bactéries simples. Perméabilisation sélective (également connu sous le nom d&#39;essai de protection phagosome) fournit cette résolution 2,4,10,12. Le dosage est basé sur la perméabilisation sélective de la membrane plasmique de la cellule hôte avec le détergent digitonine, ce qui laisse les membranes vacuolaires intact et permet ainsi la coloration sélective de bactéries avec des anticorps cytosoliques. Ici, nous fournissons deux protocoles de quantification des cytosolique et vacuolaire Salmonella typhimurium en utilisant perméabilisation différentiel. Le principe de cette méthode est décrite dans la figure 1: les macrophages de moelle osseuse dérivés (BMDMs) sont infectées avec phase stationnaire mCherry exprimant Salmonella. Phase stationnaire Salmonella besoin to être utilisés car ils régulent à la baisse l&#39;expression de la SPI-1 SST3, dont l&#39;activité serait autrement reconnu par l&#39;inflammasome NLRC4 et induire la mort cellulaire rapide (pyroptosis) de la BMDMs 15. Suite à l&#39;infection des cellules sont lavées et traitées avec 50 pg / ml de digitonine pendant 1 minute. Les cellules sont lavées de nouveau et immédiatement incubées avec des anticorps anti-Salmonella couplés au FITC pour marquer des bactéries avec accès au cytosol. Après un lavage supplémentaire cellules sont lysées de pas et le pourcentage de mCherry + (vacuolaire) et FITC + / + mCherry (cytosolique) de bactéries est déterminée par FACS. Nous présentons également une adaptation de ce procédé qui peut être utilisé en l&#39;absence de souches exprimant des protéines fluorescentes sont disponibles (Figure 2). Des étapes supplémentaires sont introduites après l&#39;étiquetage FITC dans lequel les cellules sont fixées et complètement perméabilisées. Par la suite, toutes les bactéries sont colorées avec des anticorps anti-Salmonella et des anticorps secondaires correspondantes. Detection se fait alors par microscopie à la place de l&#39;analyse FACS.

<table><tbody><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D5628</td><td>50 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>PFA</td><td>mpbio</td><td>219998380</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Technologies</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de potassium</td><td>Sigma</td><td>791733</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>anti-Salmonella CSA-1-FITC</td><td>KPL</td><td>01-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>anti-Salmonella CSA-1</td><td>KPL</td><td>02-91-99-MG</td><td>1/500</td></tr><tr><td>anti-Calnexin</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-860D</td><td>1/100</td></tr><tr><td>anti-PDI</td><td>Enzo Lifesciences</td><td>SPA-890</td><td>1/100</td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Sigma</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield support de montage</td><td>Vectorlabs</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Anti Rabbit antibody-488</td><td>Moléculaire Sondes</td><td>A-11070</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Life Technologies</td><td>15710-49</td><td>100 &mu ; g/ml et 10 &mu ; g/ml</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5141</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-019</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma</td><td>D6429</td><td></td></tr><tr><td>NEAA</td><td>Amimed</td><td>5-13K00-H</td><td></td></tr><tr><td>LSM700 Microscope confocal Imagerie</td><td>Zeiss</td><td></td><td>réalisée à 63X</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BD technologies</td><td></td><td>détection mCherry 610 nm</td></tr><tr><td>FACS Fortessa</td><td>BD technologies</td><td></td><td>détection FITC 530 nm</td></tr></tbody></table>

quantification des cytosolique vs vacuolar<em&gt; salmonella</em&gt; dans les macrophages primaires par différentiel perméabilisation

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Bactéries pathogènes intracellulaires peuvent se répliquer dans le cytosol ou dans les vacuoles contenant des agents pathogènes spécialisés (PCV). Pour atteindre le cytosol, des bactéries telles que Shigella flexneri et Francisella novicida besoin pour induire la rupture du phagosome. En revanche, Salmonella typhimurium se réplique dans un compartiment vacuolaire, connu sous le nom de Salmonella vacuole contenant (SCV). Cependant certains mutants de Salmonella ne parviennent pas à maintenir l&#39;intégrité SCV et sont ainsi libérés dans le cytosol. Le pourcentage de bactéries par rapport cytosolique vacuolaires sur le niveau de bactéries individuelles peut être mesurée par perméabilisation différentiel, également connu comme dosage phagosome-protection. L&#39;approche fait usage de la propriété de détergent digitonine à se lier sélectivement cholestérol. Étant donné que la membrane plasmique contient plus de cholestérol que les autres membranes cellulaires, la digitonine peut être utilisé pour perméabiliser sélectivement la membrane plasmique tout en laissant les membranes intracellulairesintact. En bref, suivant l&#39;infection par l&#39;agent pathogène exprimant une protéine marqueur fluorescent (par exemple mCherry entre autres), la membrane plasmique des cellules hôtes est perméabilisées par une courte incubation dans un tampon contenant de la digitonine. Les cellules sont ensuite lavées et incubées avec un anticorps primaire (couplé à un fluorophore voulue) dirigé contre la bactérie de choix (par exemple FITC anti- Salmonella) et lavées de nouveau. Si les bactéries non marquées sont utilisées, une étape supplémentaire peut être effectuée, dans lequel toutes les membranes sont perméabilisées et toutes les bactéries colorées avec un anticorps correspondant. Suite à la coloration, le pourcentage de bactéries vacuolaires cytosoliques et peut être quantifiée par FACS ou par microscopie compter les événements simples ou doubles-positives. Ici, nous fournissons des détails expérimentaux pour l&#39;utilisation de cette technique par la bactérie Salmonella typhimurium. L&#39;avantage de ce test est que, contrairement à l&#39;autre dosage, il fournit une quantification du niveau de seul bacteria, et si analysée par microscopie fournit le nombre exact de bactéries cytosolique et vacuolaires dans une cellule donnée.

Figure 1 et la Figure 2 montrent les schémas de l&#39;essai de digitonine décrites dans le protocole 1 et 2 du protocole illustrant les étapes critiques dans le protocole et les résultats obtenus. La figure 3 montre des résultats typiques FACS. Les contrôles positifs et négatifs sont utilisés pour définir les portes pour mCherry + / bactéries (FITC vacuolaire Salmonella) et mCherry + / FITC + bactéries Salmonella (cytosolique). Sur la base de ces portes, le pourcentage de ...

Nous décrivons la quantification de Salmonella typhimurium cytosolique et vacuolaire dans les macrophages dérivés de la moelle osseuse en utilisant la perméabilisation différentielle des digitonines.

Quantification des cytosolique vs Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Dans les macrophages primaires par différentiel Perméabilisation

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

L'objectif général de l'expérience suivante est de déterminer le pourcentage de Salmonella Typhimurium cytosolique et vacuolaire dans des macrophages dérivés de moelle osseuse infectés. Ceci est réalisé en infectant les macrophages avec une souche de Salmonella Typhimurium exprimant le marqueur M-cherry. Dans une deuxième étape, les cellules sont traitées avec le détergent digitonine, qui rend la membrane plasmique perméable, mais pas les membranes vacuolaires.Ensuite, les cellules sont colorées avec un anticorps anti-salmonella couplé au fluorophore Zi. Afin de marquer la salmonella typhimurium cytosolique, les résultats montrent le pourcentage de bactéries cytosoliques parmi les bactéries totales, selon le tri cellulaire activé par fluorescence ou FACS. Ces méthodes peuvent aider à répondre à des questions clés dans le domaine des interactions avec les agents pathogènes, telles que : un agent pathogène intracellulaire se réplique-t-il dans une vacuole d'entrée (VA) ou dans le cytosol ? Inoculer la souche bactérienne un jour avant l'infection dans trois millilitres de milieu Luria-Bertani enrichi avec de la streptomycine et de l'ampicilline, en agitant à 37 degrés Celsius toute la nuit, en tenant compte des conditions spécifiques. Ajouter des lamelles dans les puits d'une plaque 24 puits qui serviront de témoins pour ensemencer les cellules destinées à l'infection : des macrophages dérivés de moelle osseuse de type sauvage, ou BMdm, à une densité de 0,125 million de cellules par puit dans un millilitre de milieu pour macrophages primaires, puis incuber les cellules toute la nuit dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Le lendemain, déterminez la concentration de salmonelle dans la culture de nuit en mesurant la densité optique à 600 nanomètres, ou DO 600, de la culture diluée par rapport au chlorure de sodium tamponné au phosphate. Cela garantit que la DO 600 est mesurée dans la plage linéaire du spectrophotomètre.Calculez la concentration de salmonelles par millilitre, sachant qu'une OD 600 correspond à 1 milliard. Diluez les bactéries dans du milieu pour macrophages afin d'obtenir une concentration de salmonelles de 1,25 million de cellules par millilitre pour infecter les cellules. Retirez le milieu des MDM B.Ajoutez un millilitre de milieu pour macrophages dans les puits témoins non infectés, B1 à B3 et C1 à C3. Ensuite, ajoutez un millilitre de suspension de Salmonella dans les puits A1 à A5 afin d'obtenir une multiplicité d'infection de 10 bactéries par cellule. Centrifugez la plaque pendant 15 minutes à 300 × g et à 37 °C pour synchroniser l'infection, puis transférez la plaque pour une incubation à 37 °C et 5 % CO₂ une heure après l'infection. Retirez la plaque de l'incubateur pour ajouter 0,1 millilitre de milieu pour macrophages contenant de la gentamicine afin d'éliminer les bactéries extracellulaires.Ajouter de la gentamicine dans tous les puits, y compris les témoins non infectés, afin de s'assurer que toutes les cellules sont traitées de la même manière. Ensuite, transférer la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone deux heures après l'infection. Retirer la plaque de l'incubateur et laver tous les puits deux fois avec un millilitre de milieu de Eagle modifié (DMEM) préchauffé.Remplacer le DMEM par le milieu macrophagique préchauffé contenant de la gentamicine afin d'empêcher la croissance de toute bactérie extracellulaire résiduelle avant de replacer la plaque dans l'incubateur juste avant le point temporel d'analyse souhaité. Préparer des solutions fraîches de tampon KHM, de tampon KHM avec de la digitonine et de tampon KHM avec du saponin. En plus des solutions d'anticorps décrites dans le protocole textuel pour effectuer la perméabilisation cellulaire, retirer la plaque de l'incubateur et laver les puits trois fois avec 0,5 millilitre de tampon KHM préchauffé.Ensuite, retirez le tampon KHM et ajoutez 0,25 millilitre de tampon KHM ordinaire dans les puits A4, B1 et C1, du tampon KHM avec digitoine dans les puits A1 à A3, B2 et C2, et du tampon KHM avec de la saponine dans les puits A5, B3 et C3. Incubez exactement une minute à température ambiante, puis lavez immédiatement tous les puits trois fois avec 0,5 millilitre de tampon KHM préchauffé. Enfin, retirez le tampon KHM et ajoutez les solutions d'anticorps primaire dans les puits appropriés, puis incubez la plaque 15 minutes à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Après l'incubation, lavez les cellules une fois avec un millilitre de PBS pour les cellules infectées dans les puits A1 à A5.Préparez l'analyse en cytométrie en flux en lavant les cellules trois fois avec du PBS. Ajoutez ensuite 0,5 millilitre de PBS glacé contenant 0,1 % de Triton. Transférez ensuite la suspension cellulaire dans un tube de cytométrie de 5 millilitres muni d’un bouchon filtrant afin de rompre les agrégats cellulaires tout en maintenant les échantillons sur glace.Analysez les échantillons sur un cytomètre en flux en utilisant les contrôles totalement perméables. Définissez la fenêtre pour les bactéries totales en fonction de la diffusion avant et latérale ainsi que du signal mCherry. Ensuite, analysez le signal fitz dans la population bactérienne totale en utilisant les contrôles perméables et non perméables pour définir les fenêtres permettant de distinguer les bactéries cytosoliques des bactéries vacuolaires.Analyser les échantillons et déterminer le pourcentage de bactéries cytosoliques par rapport aux bactéries vacuolaires à l'aide du logiciel FlowJo. Selon le protocole du fabricant pour les témoins de perméabilisation non infectés dans les puits B1 à B3 et C1 à C3, préparer la microscopie en éliminant le PBS et en ajoutant 250 microlitres de paraformaldéhyde à 4 % dans le PBS, puis incuber pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. Après l'incubation, laver les puits deux fois avec un millilitre de PBS, puis ajouter 250 microlitres de glycine à 0,1 molaire dans le PBS pendant 10 minutes afin de bloquer le fixateur. Ensuite, laver les puits deux fois avec un millilitre de PBS pour réaliser la coloration par anticorps secondaire.Incubez les contrôles de perméabilisation pendant une heure à température ambiante avec les anticorps secondaires appropriés conjugués à des fluorochromes dans du PBS, complété avec 0,1 % de saponine et 3 % de BSA. Pour une perméabilisation complète des cellules, lavez les lamelles trois fois avec un millilitre de PBS, puis montez les lamelles pour analyse dans un milieu de montage contenant du DAPI.Analyser les lamelles avec les contrôles à un grossissement de 40 x ou 63 x à l’aide d’un microscope à fluorescence confocale. Ce qui est montré ici correspond à des faits typiques. Les résultats des contrôles positifs et négatifs sont utilisés pour définir les seuils des bactéries positives pour m-cherry, positives pour FITS, qui correspondent à Salmonella cytosolique, et positives pour m-cherry mais négatives pour FITS, qui correspondent à Salmonella vésiculaire.Sur la base de ces fenêtres, le pourcentage de bactéries cytosoliques et vacuolaires est déterminé dans les échantillons expérimentaux. Dans cet exemple, Salmonella typhimurium sauvage de type m-cherry positif est comparé à un mutant délété en CA dans des macrophages dérivés de moelle osseuse. Ce qui est illustré ici, c'est la coloration de la calnexine et de PD1 obtenue dans des contrôles de perméabilisation traités au digitonine ou à la saponine. Étant donné que la calnexine est une protéine membranaire du réticulum endoplasmique, sa coloration est visible dans tout le cytoplasme et autour du noyau, aussi bien dans les cellules perméabilisées à la digitonine que dans celles perméabilisées à la saponine. Dans les contrôles perméabilisés à la digitonine, aucune coloration de PD1 n'est visible.Bien que la coloration puisse être observée dans les cellules sasin et perméabilisées. Un résultat de coloration anti-salmonella dans des cellules qui ont été perméabilisées avec de la tonine est montré ici. Les bactéries totales apparaissent en rouge, tandis que les bactéries cytosoliques sont en vert.La population E positive est constituée de salmonelles ayant accès au cytosol. Tandis que la population Fite négative correspond aux bactéries résidant dans une vacuole contenant des salmonelles intacte, ou VCS, et qui sont par conséquent protégées du marquage par le système FSE de Salmonella. Ici, des salmonelles de type sauvage sont comparées à une souche mutante délétée pour CFE. Étant donné que CA est nécessaire à Salmonella pour maintenir l'intégrité de la VCS, un pourcentage accru de Salmonella est observé. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de déterminer le pourcentage de bactéries vésiculaires et cytosoliques.

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