Modèle de polarisée Neural Tissue base-Silk-collagène ingénierie 3D

L’objectif global de cette procédure est de démontrer le processus d’ingénierie de tissus cérébraux en 3D. Ceci est réalisé en préparant d’abord les échafaudages poreux à partir d’une solution de soie à l’aide d’une technique de lixiviation au sel. La deuxième étape consiste à prédécouper les échafaudages en forme de beignet et à les préparer pour la culture cellulaire par stérilisation et enrobage de poly de lycine ou PDL.

Ensuite, les échafaudages préparés sont ensemencés avec des neurones corticaux primaires de rat fraîchement isolés. La dernière étape est l’enrobage de collagène des échafaudages et le transfert sur les plaques de culture. En fin de compte, la microscopie à immunofluorescence est utilisée pour montrer la croissance neuronale et le développement des réseaux neuronaux.

Les implications de cette technique s’étendent à la thérapie ou au diagnostic des maladies affectant le cerveau, car cette technique peut être utilisée comme base pour développer de nouveaux modèles de recherche sur la maladie de Parkinson ou d’Alzheimer. Avant de commencer, préparez la solution de soie à 6 % comme décrit dans le protocole textuel et conservez-la à quatre degrés Celsius. Pour préparer des échafaudages poreux, tamisez d’abord le chlorure de sodium granulaire et collectez des granules de 500 à 600 micromètres de diamètre.

Versez 30 millilitres de la solution de soie dans le moule en polytétrafluoroéthylène ou en PTFE, puis répartissez uniformément 60 grammes de chlorure de sodium tamisé. La solution. Incuber pendant 48 heures à température ambiante pour polymériser la soie.

Placez l’échafaudage contenant le moule dans un four réglé à 60 degrés Celsius pendant une heure pour finaliser la réticulation de la soie et pour évaporer tout liquide restant. Ensuite, plongez la combinaison moule et échafaudage dans un bécher de deux litres d’eau distillée pendant 48 heures. Pour lessiver le sel, changez l’eau deux à trois fois par jour.

Retirez l’échafaudage du moule et coupez-le en petits morceaux. D’abord avec un poinçon de biopsie de cinq millimètres de diamètre. Ensuite, coupez l’échafaudage à deux millimètres de hauteur et retirez le centre de chaque pièce avec un poinçon de biopsie de deux millimètres.

Autoclavez les échafaudages en cycle humide pendant 20 minutes. À l’intérieur d’une hotte de culture cellulaire, placez une paire de pinces stérilisées, des milieux de culture cellulaire et les échafaudages de l’autoclave. Retirez une plaque de 96 puits de son emballage et placez-la à l’intérieur pour ensemencer les échafaudages.

Placez d’abord un échafaudage stérile par puits. Dans la plaque à 96 puits, ajoutez un milieu de culture cellulaire pour immerger les échafaudages et incubez à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire pour les équilibrer pendant au moins 30 minutes. Après l’incubation, aspirez l’excédent de milieu des échafaudages.

Ensuite, ajoutez deux fois 10 aux six cellules neuronales corticales du rat dans 100 microlitres de milieu neurobasal par échafaudage. Remettez la plaque dans l’incubateur et laissez-la reposer toute la nuit pour permettre aux cellules de se fixer à l’échafaudage. Le lendemain matin.

Aspirez soigneusement les cellules non attachées et remplacez-les par 200 microlitres de culture cellulaire fraîche. Douleur moyenne. Incuber à 37 degrés Celsius pendant une brève période. Ensuite, aspirez le fluide des puits à l’aide d’une pince stérile.

Transférez les échafaudages contenant les cellules dans les puits vides du 96. Bien plaquer ensuite à chaque échafaudage à 100 microlitres de glace fraîche fraîchement diluée, trois milligrammes par millilitre de solution de collagène de queue de rat. Remettez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius pour permettre la polymérisation du collagène pendant 30 minutes.

Retirez la plaque de l’incubateur et ajoutez 100 microlitres de culture cellulaire préchauffée. Rendement moyen par puits. Tournez la plaque dans l’incubateur pendant la période souhaitée de croissance cellulaire, en remplaçant la moitié du milieu de chaque puits par du milieu frais tous les jours pendant une semaine maximum.

Dans ces échafaudages très poreux, les cellules neuronales peuvent être cultivées à une densité élevée. Voici les résultats de la viabilité cellulaire. Un jour après l’ensemencement, des cellules vivantes marquées au diétate fluorescent apparaissent dans un échafaudage vert et d’iodure de propidium et de soie.

En rouge, notez le pourcentage élevé de cellules vivantes observées sous un faible grossissement. Cette figure montre la compartimentation des corps cellulaires neuronaux et des processus axonaux au sein de l’échafaudage en forme de beignet. Les corps cellulaires neuronaux restent attachés à l’échafaudage de soie, comme on le voit ici un jour après que les cellules d’ensemencement ont été immuno-colorées pour la tubuline bêta-trois et apparaissent vertes.

Comme prévu, les cellules ont densément peuplé l’échafaudage au septième jour de la culture. En revanche, la matrice de collagène dans le creux central de l’échafaudage fournit un soutien pour une croissance axonale étendue. On voit ici le maillage axonal.

Sept jours après l’ensemencement. Cette vidéo montre un balayage confocal en Z de la fenêtre centrale du collagène de l’échafaudage contenant les cellules du réseau neuronal marquées par coloration pour la tubuline bêta-trois. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de configurer les constructions tissulaires 3D ressemblant à des cerveaux.