Name: Modèle de polarisée Neural Tissue base-Silk-collagène ingénierie 3D (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-10-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: Découvrez l'ingénierie de tissus cérébraux 3D à base de soie et de collagène pour étudier les réseaux neuronaux. Cette méthode utilise des neurones corticaux de rat et la microscopie à immunofluorescence pour visualiser la croissance axonale et les interactions cellulaires.

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Nous remercions le laboratoire du Dr Stephen Moss d’avoir fourni des tissus cérébraux embryonnaires de rat. M.D.T. a conçu le protocole original. Ce travail a été financé par la subvention P41 du Centre de ressources en ingénierie tissulaire P41 des National Institutes of Health EB002520. K.C. a été soutenu par une bourse postdoctorale de la Fondation allemande pour la recherche (DFG) (CH 1400/2-1).

Le protocole d&#39;isolement de tissu cérébral a été approuvé par le Comité des soins et l&#39;utilisation des animaux institutionnelle de l&#39;Université Tufts et est conforme avec les National Institutes of Health Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire (Institutional Animal Care et l&#39;utilisation Comité B2011-45). 1. Préparation de la soie Échafaudages <ol><li> Préparation de la solution de soie de Bombyx mori cocons comme décrit précédemment 19,20. <ol><li> Couper chaque cocon en 8 morceaux égaux aide de ciseaux. Utilisez environ 11 cocons pour 5 g de cocons fragmentés. (15 min) </li><li> Préparer 2 L de 0,02 M Na 2 CO 3 et porter à ébullition en utilisant une plaque chauffante. (15 min) </li><li> Peser 5 g de cocons fragmentées et les faire bouillir dans Na 2 CO 3 pendant 30 min. Incorporer la soie bouillante toutes les deux minutes avec une spatule. Cette étape, également appelé de-gommage, purifie fibroïne de soie de protéines hydrophiles, sericins. (30 min) </li><li&gt; Essorez la fibroïne à la main et le rincer à l&#39;eau distillée au moins trois fois pour laver toute séricine restant et les produits chimiques. (5 min) </li><li> Placez la fibroïne humide sur une boîte de Pétri et sécher l&#39;extrait de fibroïne dans la hotte à flux O / N. </li><li> Le lendemain peser la masse de fibroïne sec et placer la fibroïne dans un récipient en verre. (15 min) </li><li> Pour dissoudre la fibroïne de 9,3 M de solution de LiBr, calculer le volume nécessaire (en ml) de LiBr en multipliant la masse de fibroïne sec par 4. Verser lentement solution LiBr sur la fibroïne de soie et plongez toutes les fibres de fibroïne aide d&#39;une spatule. Couvrir le bécher pour éviter l&#39;évaporation et le placer à 60 ° C pendant 4 heures pour permettre aux fibres de se dissoudre. (15 min) </li><li> Utilisation de la seringue, de recueillir la solution de fibroïne du bécher et le charger dans les MWCO 3.500 cassettes de dialyse. Effectuer une dialyse contre de l&#39;eau distillée pendant 48 heures. Changez l&#39;eau toutes les deux heures. </li><li> Utilisation de la seringue, de recueillir la solution de fibroïne deles cassettes dans 50 ml tubes coniques et centrifuger à 9000 rpm deux fois (~ 12 700 x g) à 4 ° C pendant 20 min. Verser le surnageant dans un nouveau tube après chaque étape de centrifugation et jeter le culot. (40 min) </li><li> Mesurer la concentration de la fibroïne en estimant le poids sec. Verser 1 ml de solution de soie dans une barque peser. Sécher l&#39;échantillon à l&#39;étuve à 60 ° C pendant 2 heures. Peser la fibroïne de soie sèche et calculer la concentration de la solution de fibroïne de soie en multipliant le poids obtenu par 100. La concentration de la solution attendue de soie est 6-9% (p / v). </li><li> Ajuster la concentration de soie à 6% (p / v) en le diluant dans l&#39;eau distillée. Point d&#39;arrêt: La fibroïne de soie liquide peut être conservé à 4 ° C pendant jusqu&#39;à un mois dans un récipient fermé. </li></ol></li><li> Préparation des supports poreux de solution de soie. <ol><li> Tamiser les granulés de NaCl pour séparer les granules calibrés de 500 à 600 um, qui sera utilisé dans les étapes ultérieures. Jeter le granulés taille inférieure à 500 um et 600 um ci-dessus. (15 min) </li><li> Verser 30 ml de solution de soie de 6% dans le moule de polytétrafluoroéthylène (PTFE) (Figure 1). Disperser doucement 60 g de NaCl tamisé sur la soie. Appuyez sur le récipient pour obtenir une couche uniforme de sel. Incuber 48 h à température ambiante pour polymériser la soie. </li><li> Placez le moule contenant PTFE d&#39;échafaudage dans le four à 60 ° C pendant 1 heure pour finaliser la polymérisation et évaporer tout liquide restant. </li><li> Placer le contenu du moule en PTFE dans un bêcher contenant 2 litres d&#39;eau distillée pendant 48 heures à lessiver le sel. Changez l&#39;eau 2-3 fois par jour. Retirez les échafaudages d&#39;éponges des moules lorsque le sel est complètement lessivé point d&#39;arrêt:. Les éponges peuvent être stockés immergé dans l&#39;eau à 4 ° C dans un récipient fermé pour éviter les échafaudages de la déshydratation. </li><li> Lorsque vous êtes prêt, découpez les échafaudages avec 5 mm de diamètre biopsie punch. Pré-couper les échafaudages pour atteindre environ 2 mm de hauteur. PuNCH ​​le centre de l&#39;échafaud avec le poinçon 2 mm de diamètre de biopsie (figure 2A). (1 h) </li><li> Autoclaver les échafaudages immergés dans l&#39;eau pour les stériliser (le cycle humide, 121 ° C, 20 min) Point d&#39;arrêt:. Les éponges peuvent être stockés immergé dans l&#39;eau à 4 ° C dans un récipient fermé pour éviter les échafaudages de la déshydratation. </li><li> Avant l&#39;ensemencement des cellules prévu, plonger dans les échafaudages / ml de poly-D-lysine (PDL) de solution stérile de 0,1 mg. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C. </li><li> Laver les échafaudages 3x avec du tampon phosphate salin (PBS) pour éliminer PDL non-lié. (30 min) </li></ol></li></ol> 2. Isolement du Rat neurones corticaux <ol><li> On dissèque le cortex de rats de 18 jours embryonnaires (E18) Sprague-Dawley, comme décrit précédemment par Peruzzi Pacifici et 27 après protocole approuvé animal est obtenue. (2 h) </li><li> Incuber 10 cortex dans 5 ml de trypsine à 0,25% à 0,3% de DNase I (provenant de pancréas de bovin) pendant 20 min à 37 ° C. </li><li> Inactiver la trypsine en ajoutant un volume égal de 1 mg / ml de protéine de soja. </li><li> Triturer les cortex à l&#39;aide de 10 ml de pipette Pasteur par aspiration et refoulement 20 fois jusqu&#39;à une suspension cellulaire unique est généré. Soyez doux et éviter la formation de bulles d&#39;air. (10 min) </li><li> Centrifuger la suspension de cellules à 127 xg pendant 5 min. </li><li> Remettre en suspension le culot cellulaire dans 10 ml de milieu de culture (milieu Neurobasal, 1x supplément B27, 1x Glutamax, 1% de pénicilline / streptomycine). Compter les cellules. La concentration cellulaire est d&#39;environ 2x10 prévu 7 / ml. (20 min) </li></ol> 3. Construire Assemblée et de la culture <ol><li> Échafaudage ensemencement avec des cellules. <ol><li> Déplacer les échafaudages stériles et les ustensiles nécessaires tous à l&#39;intérieur d&#39;une hotte de culture cellulaire. Aide de pinces stériles placent les échafaudages dans une plaque de culture cellulaire de 96 puits attribution d&#39;un échafaudage par puits. (10 min) </li><li> Plonger les échafaudages dans un milieu de culture cellulaire pour équilibrer les graines avant de la celluleing. Incuber pendant 1 heure à 37 ° C. (10 min) </li><li> Aspirer l&#39;excédent du milieu des échafaudages. </li><li> Appliquer 100 pi de suspension de cellules / échafaudage. (10 min) </li><li> Incuber les cellules à 37 ° CO / N pour permettre la fixation des cellules à l&#39;échafaud. </li><li> Le lendemain matin, aspirer les cellules non-inscrits et applique 200 pl / puits de milieu de culture frais. (10 min) </li></ol></li><li> Échafaudage intégration avec matrice de collagène. (2 h) <ol><li> Placez 10x PBS, de l&#39;eau, 1 N NaOH et queue de rat de collagène sur la glace. Préparer une solution de travail de collagène selon les instructions du fabricant. Maintenir sur la glace jusqu&#39;à les constructions ensemencées cellules sont prêts (jusqu&#39;à 1 heure). </li><li> Retirer les constructions de soie cellulaires graines de l&#39;incubateur et aspirer l&#39;excès de milieu. </li><li> Aide de pinces stériles transférer les échafaudages dans les puits vides sur la plaque de puits et immergent chaque échafaudage dans 100 pi de 3 mg / ml solution de collagène. Placer la plaque de culture de tissus de retourdans l&#39;incubateur pendant 30 min pour permettre la polymérisation du collagène. </li><li> Appliquer 100 ul de milieu préchauffé de culture de cellules / puits. Culture constructions depuis une semaine changeant le milieu tous les jours en remplaçant seulement la moitié du volume du milieu. </li></ol></li></ol> 4. Microscopie Analyse <ol><li> Direct coloration / morts (1 h) <ol><li> Préparer une solution stock d&#39;iodure de propidium (PI) 1 mg / ml (1,5 mm) dans de l&#39;eau distillée. </li><li> Préparer une solution stock de diacétate de fluorescéine (FDA) 2 mg / ml dans de l&#39;acétone. </li><li> Préparer la solution de travail contenant 10 uM PI et 0,15 uM FDA dilué dans du PBS. Préchauffer la solution à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Laver les cellules avec préchauffé PBS pour éliminer les estérases sériques. Aspirer le PBS. </li><li> Appliquer la solution de travail pré-chauffé sur les cellules pendant 2 min et le laver avec du PBS. </li><li> Utilisez microscope à épifluorescence à l&#39;image les cellules (PI ex λ = 490 nm, em λ = 570 nm; FDA ex λ = 490 nm, em λ = 514 nm). La tache reste stable plus de 40 min. Coloration prolongée peut provoquer une coloration non spécifique résultant de PI absorption par les cellules et co-localisation de PI / FDA dans les cellules. </li></ol></li><li> Immunocoloration <ol><li> Au point de temps désiré de la culture fixer les cellules avec 4% de paraformaldehyde (PFA) pendant 30 min à température ambiante. En raison de la toxicité de la PFA vapeurs d&#39;l&#39;étape de fixation doit être réalisée dans la hotte d&#39;aspiration chimique. </li><li> Laver échafaudages avec 3x PBS point d&#39;arrêt:. Les constructions PFA-fixes peuvent être stockés dans PBS à 4 ° C pendant plusieurs jours avant de procéder à de nouvelles mesures. </li><li> Incuber les échafaudages dans 0,2% de Triton, 0,25% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) dans du PBS contenant l&#39;anticorps primaire O / N à 4 ° C. </li><li> Le lendemain, jeter la solution de coloration et laver les échafaudages 3 x 30 min avec du PBS pour éliminer l&#39;anticorps primaire non lié. </li><li> Incuber les échantillons avec l&#39;anticorps secondaire dilué dans 0,2% de Triton, 0,25% de BSA dans du PBS pendant 2heure à température ambiante. </li><li> Retirer la solution de coloration et laver les échafaudages 3 x 30 min avec du PBS pour éliminer l&#39;anticorps secondaire non lié. </li><li> Image les échafaudages en utilisant un microscope confocal à l&#39;objectif 20X en prenant 100 um z-sections de l&#39;échantillon avec 1 um étape. Pour visualiser les neurites minces la résolution de l&#39;image doit être d&#39;un minimum de 1024 x 1024 pixels. </li></ol></li><li> ARN, l&#39;ADN et l&#39;isolement de la protéine Remarque: l&#39;ARN, l&#39;ADN et l&#39;isolement de la protéine est effectuée en utilisant un kit commercial Mini AllPrep ADN / ARN / protéine selon les instructions du fabricant. <ol><li> Utilisation des pinces stériles transférer les échafaudages sur plaque de culture dans un tube stérile de 2 ml. Placez un échafaudage par tube. </li><li> Ajouter 200 ul de tampon RLT à chaque tube. </li><li> Perturber la construction en fragmentant avec microciseaux stériles. </li><li> Pour homogénéiser le tissu perturbé, transférer le contenu du tube à la colonne de centrifugation. Spin pendant 2 min à pleine vitesse dans une microcentrifugeuse.Le lysat est homogénéisé lors de son passage à travers la colonne de centrifugation. </li><li> Recueillir l&#39;écoulement à travers et l&#39;utiliser immédiatement pour isoler l&#39;ARN, ADN et de protéines en suivant le protocole du fabricant. </li><li> Quantifier le rendement en acides nucléiques de toute autre méthode compatible (par exemple, NanoDrop). </li><li> Quantifier le rendement en protéines en utilisant BCA Protein Assay selon les instructions du fabricant. Mesurer les résultats de test utilisant un lecteur de microplaques à longueur d&#39;onde 562 nm. Remarque: Le rendement attendu d&#39;acides nucléiques et des protéines par construction par rapport à la densité de cellules est représenté sur la Figure 4. </li></ol></li></ol>

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Ici, nous avons décrit les lignes directrices pour assembler un modèle de tissu cérébral 3D compartimenté. Le modèle est caractérisé par une culture polarisée dense de neurones entraînant le développement de deux compartiments morphologiquement différents : l’un contenant des corps cellulaires densément emballés, l’autre contenant des réseaux axonaux purs. Dans l’ensemble, l’architecture de l’échafaudage et le modèle de croissance imitent le tissu cortical cérébral, y compris les six couches laminaires et les faisceaux de substance blanche21.
Le modèle de tissu à base de protéines de soie en forme de beignet permet de modifier et d’ajuster les propriétés mécaniques, les formes structurelles polyvalentes, les charges d’hydrogel et les composants cellulaires. Ainsi, ce modèle tissulaire constitue une plate-forme de base pour un large éventail d’études. La soie est un candidat favorable pour les plateformes de biomatériaux en raison de sa biocompatibilité, de son traitement aqueux et de ses propriétés mécaniques et de dégradation robustes22. La matrice de soie sert également d’ancrage stable pour réduire la contraction du gel de collagène au fil du temps en culture. Les propriétés telles que la concentration de soie et la porosité de l’échafaudage utilisé dans ce modèle ont été préalablement ajustées pour obtenir une croissance cellulaire optimale et des propriétés mécaniques, ce qui entraîne une élasticité tissulaire semblable à celle du cerveau18,23,24. Nous suggérons de maintenir ces paramètres constants pour garantir le succès et la reproductibilité des expériences.
La formation du réseau neuronal 3D a été réalisée en combinant deux types de biomatériaux aux propriétés mécaniques différentes : un échafaudage rigide pour fournir un ancrage neuronal et une matrice de gel plus molle pour permettre la pénétration axonale et la connectivité en 3D. Les préférences matérielles sélectives de l’échafaudage de soie et de l’hydrogel mou constituent le principe sous-jacent de compartimentation des neurones à partir des connexions axonales. En raison de la nature inerte de l’échafaudage en soie, la fonctionnalisation avec de la poly-D-lysine est nécessaire pour l’attachement neuronal. Cependant, d’autres facteurs favorisant l’adhésion cellulaire peuvent être appliqués, tels que le RGD25 ou la fibronectine26. Pour réaliser la formation d’un réseau 3D, l’échafaudage en soie doit être rempli d’hydrogel en temps opportun dès que les neurones sont attachés à l’échafaudage. De même, le remplisseur de matrice de collagène peut être remplacé par d’autres hydrogels, permettant ainsi à l’étude de l’influence des environnements extracellulaires 3D sur la formation du réseau axonal de servir de plate-forme pour évaluer de nouveaux hydrogels en termes de compatibilité neuronale. De plus, outre les neurones corticaux du rat, d’autres sources neuronales telles que les neurones de l’hippocampe ou les neurones dérivés de cellules pluripotentes induites (iPSc) peuvent être utilisées. De plus, le modèle tissulaire peut être utilisé pour étudier les interactions hétérocellulaires en incluant les cellules gliales avec les neurones et pour construire des tissus plus complexes ressemblant à des cerveaux.
Comme nous l’avons montré précédemment, notre modèle peut être utilisé pour évaluer la fonctionnalité neuronale dans un microenvironnement 3D avec une variété de tests tels que la viabilité cellulaire, l’expression génique, LC-MS/MS et l’électrophysiologie, démontrant ainsi la pertinence physiologique du modèle18. D’autres méthodes, qui sont fréquemment utilisées pour évaluer les constructions 3D issues de l’ingénierie tissulaire, telles que l’immunocoloration et la microscopie8,9,11 , peuvent également être utilisées pour évaluer la distribution cellulaire et l’étendue de la formation du réseau axonal. Cependant, il convient de noter qu’en raison de la forte densité de la matrice de collagène, la pénétration des anticorps et la profondeur de l’imagerie sont limitées à quelques centaines de micromètres. De plus, le rapport signal/bruit peut être affecté par la fluorescence de fond non spécifique. Ce problème peut être surmonté en utilisant des traceurs cellulaires lipophiles et des protéines fluorescentes génétiquement exprimées qui diminuent le besoin d’immunomarquage11. Alternativement, l’imagerie peut être réalisée avec la microscopie à 2 photons au lieu de la technique habituelle à un photon, ce qui peut réduire la perte de signal, le photoblanchiment et peut être étendu à plusieurs centaines de micromètres de profondeur.
En résumé, le tissu cérébral à base de soie et de collagène offre une plate-forme robuste pour étudier les réseaux neuronaux en 3D et constitue un point de départ pour le développement de modèles plus avancés de troubles neurologiques à l’avenir. Indépendamment du mode d’évaluation, la relative simplicité de ce modèle tissulaire soutient son utilité, son succès et sa reproductibilité.

Le système nerveux central (SNC) peut être affectée par une variété de troubles impliquant vasculaire, structurelle et fonctionnelle, infectieux ou dégénératif. On estime que 6,8 millions de personnes meurent chaque année des suites de troubles neurologiques, qui représente un fardeau socio-économique mondiale croissante 1. Cependant, seulement quelques-uns des troubles ont traitements disponibles. Par conséquent, il existe un besoin critique de stratégies thérapeutiques innovantes pour les patients souffrant de troubles neurologiques. Malheureusement, de nombreuses thérapies ciblées SNC-échouent au cours des essais cliniques, en partie due à l&#39;utilisation de modèles de recherche pré-clinique inadéquate, qui ne permettent pas une évaluation des impacts aigus et chroniques avec affichage fonctionnels physiologiquement pertinents. En dépit des efforts de recherche importants au cours des dernières décennies, il ya une grande quantité inconnue sur la structure et la fonction du système nerveux central. Afin d&#39;acquérir plus de connaissances, modèles animaux sont souvent de noused pour modéliser les états pathologiques, comme une lésion cérébrale traumatique (TBI) ou de démence, en particulier dans les études pré-cliniques. Toutefois, les animaux diffèrent de manière significative à la fois chez l&#39;homme dans l&#39;anatomie du système nerveux central, ainsi que de la fonction, et l&#39;expression des gènes du métabolisme de 2-4. D&#39;autre part, 2D cultures in vitro sont la méthode commune pour étudier la biologie cellulaire et sont couramment utilisés pour la découverte de médicaments. Cependant, des cultures de cellules 2D manquent de la complexité et de la pertinence physiologique par rapport au cerveau humain 7.5. Bien qu&#39;il n&#39;y ait pas de substitut pour le faible coût et la simplicité du 2D études de culture cellulaire ou de la complexité fournies par les modèles animaux, l&#39;ingénierie tissulaire 3D pourrait générer des modèles de recherche améliorées pour combler l&#39;écart qui existe entre la 2D in vitro et dans des approches in vivo. Ingénierie tissulaire 3D fournit des conditions expérimentales plus physiologiquement pertinents obtenus par les interactions entre les cellules et les signaux extracellulaires 3D fournis par les échafaudages de biomatériaux. Despite la preuve significative derrière la valeur des cultures 3D, il n&#39;y a actuellement que quelques modèles de tissus 3D SNC tels que souches dérivées de cellules cultures organoïdes 8-10, neurospheroids 11 et dispersés cultures d&#39;hydrogel 12,13. Y compris les méthodes techniques avancées multicouche 14 lithographie, impression en 3D et 15 ont été utilisées pour l&#39;étude du poumon, du foie, du rein et le tissu. Cependant, il existe des modèles 3D absence du SNC qui permettent la croissance neuronale compartimenté, comme imitant l&#39;architecture corticale et de la biologie. Séparé croissance des neurites à partir de corps cellulaires neuronaux a déjà été démontré dans les cultures 2D en utilisant microfabrication 16,17 permettant l&#39;étude de traçage axone des voies, l&#39;afflux de calcium, l&#39;architecture du réseau et des activités. Cette idée nous a inspiré pour développer un tissu neural polarisée 3D où les corps cellulaires et les voies axonales sont situés dans des compartiments différents imitant l&#39;architecture en couches du cerveau 18 </sup&gt;. Notre approche est basée sur l&#39;utilisation de la conception de l&#39;échafaudage de soie unique qui accueille haute densité de cellules dans un volume confiné et permet excroissance de réseau dense axonale dans un gel de collagène. Ici, nous démontrons la procédure de montage complet de tissu cérébral comme y compris la fabrication de l&#39;échafaudage et de la culture neuronale.

<table><tbody><tr><td>Na2CO3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223530</td><td></td></tr><tr><td>LiBr</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213225</td><td></td></tr><tr><td>MWCO 3500 cassettes de dialyse&nbsp ;</td><td>Thermo Fisher</td><td>66110</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>Fisher Scientific</td><td>Isotemp</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tamis</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>n° 270, n° 35, n° 30</td></tr><tr><td>Moule</td><td></td><td></td><td>PTFE fabriqué en interne (Figure 1) 10 cm de diamètre, 2 cm de hauteur</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71382</td><td></td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie 5&#160 ; mm</td><td>World Precision Instrument</td><td>501909</td><td></td></tr><tr><td>Biopsie Punch 2&#160 ; mm</td><td>World Precision Instrument</td><td>501908</td><td></td></tr><tr><td>poly-D-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407-5MG</td><td>concentration finale 10&#160 ; &#956 ; g/ml, dissous dans l’eau</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1283-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049-500ML</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td>concentration finale 0,3</td></tr> % <tr><td>Protéine de soja</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6522-100MG</td><td>concentration finale 1&#160 ; mg/ml</td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td>réchauffement jusqu’à 37&#160 ; &deg ; C avant utilisation</td></tr><tr><td>Supplément B27 50x</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline Streptomycine</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Collagène I, queue de rat, 100&#160 ; mg</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>concentration finale 3&#160 ; mg/ml</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2770</td><td>corrosif</td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4170-10MG</td><td>toxique</td></tr><tr><td>Diacétate de fluorescéine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7378-5G</td><td></td></tr><tr><td>Olympus MVX10</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>toxique, concentration finale 4</td></tr> %<tr><td>Bovin Albumine sérique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-10G</td><td></td></tr><tr><td>anti-&bêta ; IIITubuline anticorps&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T2200</td><td>lapin 1:500</td></tr><tr><td>anti-lapin Alexa-546</td><td>Sondes moléculaires</td><td>A11010</td><td>chèvre 1:250</td></tr><tr><td>sérum de chèvre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal Leica SP2 Objectif</td><td>Leica</td><td></td><td>20X</td></tr><tr><td>QIAshredder</td><td>Qiagen</td><td>79654</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA/Protein Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80004</td><td></td></tr><tr><td>Alcool éthylique,</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023 pur.</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>63689</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000c/2000 Spectrophotomètre UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dosage des protéines BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques Spectramax M2</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>absorbance 562 nm</td></tr><tr><td>Micro Ciseaux, Économie, type Vannas</td><td>TedPella</td><td>1346</td><td></td></tr></tbody></table>

modèle de polarisée neural tissue base-silk-collagène ingénierie 3d

Engineered 3D Silk-collagen-based Model of Polarized Neural Tissue

Malgré d’énormes efforts pour déchiffrer l’anatomie, la composition et la fonction du cerveau, il reste l’organe le moins compris du corps humain. Pour mieux comprendre le système neuronal, les scientifiques visent à reconstruire de manière simpliste le tissu en l’assemblant in vitro à partir de blocs de construction de base en utilisant une approche d’ingénierie tissulaire. Notre groupe a développé un modèle 3D cérébral basé sur la soie et le collagène ressemblant à la matière blanche et grise du cortex. Le modèle se compose d’une éponge poreuse de soie, qui est pré-ensemencée avec des neurones dérivés du cerveau de rat, immergés dans une matrice de collagène mou. Une croissance neuronale polarisée et la formation d’un réseau sont observées avec une localisation axonale et cellulaire distincte. Cette architecture compartimentale permet le développement unique de niches imitant le tissu neural natif, permettant ainsi la recherche sur l’assemblage des réseaux neuronaux, le guidage axonal, les interactions cellule-cellule et cellule-matrice et les fonctions électriques.

Solide éponges de soie prédécoupé à la forme de beigne représentent une idée unique et simple à réaliser une architecture compartimentée ressemblant le tissu nerveux (figure 2A). La structure très poreuse de l&#39;échafaudage avec la taille de pores d&#39;environ 500 um résultats dans la zone de surface exceptionnellement élevé permettant l&#39;ensemencement et de croissance de forte densité de cellules dans un petit volume (7 2x10 / ml) (figure 2B). En outre, la grande porosité de l&#39;échafaudage permet la diffusion sans restriction de nutriments et de déchets résultant de la viabilité supérieure de cultures cellulaires denses plus de prolongement des délais. Après ensemencement des neurones fixer rapidement et uniformément à la surface des pores de l&#39;échafaudage. Après la fixation des cellules est terminée et les cellules sont équilibrées sur le substrat de soie, l&#39;échafaudage de mousse est rempli avec la matrice de collagène souple afin de fournir un environnement 3D pour la formation du réseau axonale (Figure 3 </strong&gt;). En l&#39;absence de la matrice de collagène de la compartimentation des axones et des corps cellulaires est impossible que les neurones extensions poussent que sur la surface des pores conduisant à des réseaux mixtes que l&#39;on trouve avec des surfaces 2D (figure 3B). Par contre, le gel de collagène fournit un maillage large qui supporte la croissance axonale en 3D, alors que corps cellulaires neuronaux restent attachés au squelette de soie (figure 3C). Ce modèle de croissance conduit à cloisonnement des corps cellulaires et les réseaux axonales purs (Figure 3D), qui ressemble à la matière grise et blanche du cortex dans le cerveau. En dehors de microscopie, les constructions peuvent être évalués avec une variété d&#39;autres procédés de 18, en fonction de la question derrière l&#39;expérience. Par exemple, l&#39;isolement de l&#39;ADN, de l&#39;ARN et de protéines à partir des constructions peut être facilement réalisée en utilisant des kits commerciaux (Figure 4). Le rendement en acides nucléiques et de protéines per construction dépend du nombre de cellules initialement ensemencées sur l&#39;échafaudage de soie. Les cellules ensemencées plus plus le rendement de l&#39;ADN, de l&#39;ARN et des protéines. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig1.jpg" /> Figure 1. PTFE moule utilisé pour la préparation éponge de soie d&#39;échafaudage Les dimensions:.. 10 cm de diamètre, 2 cm de hauteur <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig2.jpg" /> Figure 2. 3D modèle de tissu du cerveau comme. (A) poreux éponge de soie échafaud. (B) en direct coloration / morts de neurones à jour 1 sur l&#39;ensemencement sur ​​échafaudage de soie avant de l&#39;intégrer collagène (cellules vertes-live, les cellules rouges morts). Panneaux sur le côté droit montrent la MAgnification de zone capturée dans des cadres rouges. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig3.jpg" /> Figure 3. neuronale de l&#39;excroissance cloisonnée dans le modèle de tissu cérébral comme 3D (A) compartiments d&#39;échafaudage:. Rouge-cellule compartiment du corps, compartiment Blue-axonale. (B) de modèle de croissance neuronale au jour 1 après l&#39;ensemencement avant collagène encastrement. (C). Excroissance neuronale au jour 7 après l&#39;ensemencement dans le compartiment de corps cellulaire. (D) de l&#39;excroissance neuronale au jour 7 après l&#39;ensemencement dans le compartiment axonal. Vert -. ΒIIITubulin <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette</a>figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52970/52970fig4.jpg" /> Figure 4. Rendement prévu de (A) ARN et l&#39;ADN, et (B) protéines par construction par rapport à la quantité de cellules ensemencées par échafaudage (± SD, n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52970/52970fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure .</a>

La compréhension des actions complexes du cerveau nécessite des outils de recherche avancés. Ici, nous démontrons un nouveau modèle 3D de tissu neuronal basé sur du collagène de soie ressemblant à une architecture semblable à celle du cerveau. Le modèle peut être utilisé pour étudier l’assemblage des réseaux neuronaux, le guidage axonal, les interactions cellule-cellule et l’activité électrique.

Modèle de polarisée Neural Tissue base-Silk-collagène ingénierie 3D

Despite huge efforts to decipher the anatomy, composition and function of the brain, it remains the least understood organ of the human body. To gain a ...

L'objectif général de cette procédure est de démontrer le processus d'ingénierie de tissus tridimensionnels de type cérébral. Cela est réalisé en préparant d'abord des échafaudages poreux à partir d'une solution de soie en utilisant une technique de lessivage par sel. La deuxième étape consiste à découper préalablement les échafaudages en forme de beignets et à les préparer pour la culture cellulaire par stérilisation et revêtement avec de la poly-d-lysine ou PDL.Ensuite, les supports préparés sont ensemencés avec des neurones corticaux primaires de rat fraîchement isolés. La dernière étape consiste à inclure les supports dans du collagène et à les transférer dans les plaques de culture. Enfin, une microscopie par immunofluorescence est utilisée pour visualiser la croissance neuronale et le développement des réseaux neuronaux.Les implications de cette technique s'étendent à la thérapie ou au diagnostic des maladies affectant le cerveau, car elle peut servir de base au développement de nouveaux modèles de recherche sur la maladie de Parkinson ou d'Alzheimer. Avant de commencer, préparez la solution de soie à 6 % comme décrit dans le protocole et conservez-la à quatre degrés Celsius. Pour préparer des échafaudages poreux, tamisez d'abord le chlorure de sodium granulaire et récupérez les granulés dont le diamètre est compris entre 500 et 600 micromètres.Verser 30 millilitres de la solution de soie dans le moule en polytétrafluoroéthylène ou PTFE, puis répartir uniformément 60 grammes de chlorure de sodium tamisé sur la solution. Incuber pendant 48 heures à température ambiante pour polymériser le soie.Placer le support contenant le moule dans un four réglé à 60 degrés Celsius pendant une heure afin de finaliser la réticulation de la soie et d'évaporer tout liquide résiduel. Ensuite, immerger l'ensemble moule-support dans un bécher de deux litres d'eau distillée pendant 48 heures. Pour éliminer le sel, changer l'eau deux à trois fois par jour.Retirer la matrice du moule et la découper en petits morceaux. Commencer avec un poinçon de biopsie de cinq millimètres de diamètre. Ensuite, découper la matrice de manière à ce qu'elle ait une hauteur de deux millimètres, puis retirer le centre de chaque morceau à l'aide d'un poinçon de biopsie de deux millimètres.Stériliser les échafaudages en autoclave selon un cycle humide pendant 20 minutes. À l'intérieur d'une hotte de culture cellulaire, placer une paire de pinces stérilisées, le milieu de culture cellulaire et les échafaudages stérilisés en autoclave. Retirer une plaque de 96 puits de son emballage et la placer à l'intérieur afin de semer les échafaudages.Placer d'abord un support stérile par puits. Dans la plaque de 96 puits, ajouter du milieu de culture cellulaire pour immerger les supports et incuber à 37 degrés Celsius dans une étuve de culture tissulaire afin de les équilibrer pendant au moins 30 minutes. Après l'incubation, aspirer le milieu excédentaire des supports.Ensuite, ajoutez deux fois 10 à la sixième puissance de cellules neuronales corticales de rat dans 100 microlitres de milieu neurobasal par échafaudage. Replacez la plaque dans l'incubateur et laissez toute la nuit pour permettre aux cellules de s'attacher à l'échafaudage. Le lendemain matin.Aspirez soigneusement les cellules non attachées et remplacez-les par 200 microlitres de milieu frais de culture cellulaire. Incubez à 37 degrés Celsius pendant une courte période. Ensuite, aspirez le milieu des puits à l’aide de pinces stériles.Transférez les échafaudages contenant les cellules vers des puits vides de la plaque 96. Puits, puis ajoutez à chaque échafaudage 100 microlitres de solution de collagène de queue de rat, diluée récemment, froide, à 3 milligrammes par millilitre. Replacez les cellules dans l’incubateur à 37 degrés Celsius afin de permettre la polymérisation du collagène pendant 30 minutes.Retirer la plaque de l’incubateur et ajouter 100 microlitres de milieu de culture cellulaire préchauffé par puits. Remettre la plaque dans l’incubateur pendant la durée souhaitée de croissance cellulaire, en remplaçant chaque jour la moitié du milieu de chaque puits par du milieu frais, et ce jusqu’à une semaine.Dans ces échafaudages hautement poreux, les cellules neuronales peuvent être cultivées à une densité élevée, comme indiqué. Voici les résultats de viabilité cellulaire. Un jour après l'ensemencement, les cellules vivantes marquées au diacétate fluorescent apparaissent en vert, ainsi que l'iodure de propidium et l'échafaudage de soie.En rouge, notez le pourcentage élevé de cellules vivantes observées en faible grossissement. Cette image montre la compartimentalisation des corps cellulaires neuronaux et des prolongements axonaux au sein de la structure en forme de beignet. Les corps cellulaires neuronaux restent attachés à la matrice de soie, comme on le voit ici un jour après la mise en culture ; les cellules sont immunomarquées contre la tubuline bêta trois et apparaissent en vert.Comme prévu, les cellules ont fortement colonisé l'échafaudage au septième jour de culture. En revanche, la matrice de collagène située dans la cavité centrale de l'échafaudage assure un support permettant une croissance axonale étendue. On observe ici le réseau axonal.Sept jours après l'ensemencement. Ce film montre un balayage confocal en Z de la fenêtre centrale en collagène du support contenant les cellules du réseau neural, marquées par une coloration dirigée contre la tubuline bêta trois. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de mettre en place des constructions tissulaires tridimensionnelles de type cérébral.

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Bioengineering

Bioingénierie

Cette vidéo présente la création d’un modèle de tissu neural polarisé en 3D à l’aide d’échafaudages de soie et de collagène. Il détaille le processus d’ensemencement des cellules neuronales sur des échafaudages de soie poreux, d’incubation pour la fixation cellulaire, d’intégration de l’échafaudage avec du collagène, et souligne l’importance de la matrice de collagène de soutien dans la formation d’un modèle de tissu neural polarisé en 3D.

Développement d’un modèle 3D de tissu neural polarisé à base de collagène de soie

Source : Struzyna, L. A. et. al., Anatomically Inspired Three-dimensional Micro-tissue Neural Networks for Nervous System Reconstruction, Modulation, and Modeling. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo démontre le développement de réseaux neuronaux issus de micro-tissus à l’aide d’une micro-colonne d’hydrogel avec un noyau de matrice extracellulaire. Les agrégats neuronaux ensemencés adhèrent, étendent les projections et forment des réseaux neuronaux structurés, contribuant ainsi aux progrès du...

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Modèle de polarisée Neural Tissue base-Silk-collagène ingénierie 3D

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