Name: Microfluidique génipine dépôt Technique de la culture avancée de microélectrodes vasculaires musculaires Thin Films (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-06-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Découvrez la déposition microfluidique de génipine et de fibronectine sur substrats PDMS pour améliorer la viabilité des tissus vasculaires musculaires. Cette méthode permet d'étudier la contractilité vasculaire sur des durées prolongées.

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Nous remercions le soutien financier de l’American Heart Association Scientist Development Grant, 13SDG14670062 (PWA) et de la bourse de thèse de doctorat de l’Université du Minnesota (ESH). Nous reconnaissons également les ressources de microfabrication du Minnesota Nano Center (MNC) et les ressources de traitement d’images des University Imaging Centers (UIC), tous deux de l’Université du Minnesota. Une partie de ce travail a été réalisée à l’installation de caractérisation de l’Université du Minnesota, qui reçoit un soutien partiel de la NSF par le biais du programme MRS.

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<li>Agarwal, A., Goss, J. A., Cho, A., McCain, M. L., Parker, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+heart+on+a+chip+for+higher+throughput+pharmacological+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfluidic heart on a chip for higher throughput pharmacological studies.</a> Lab. Chip. 13, 3599-3608 (2013).</li>
<li>Huh, D., Torisawa, Y. S., Hamilton, G. A., Kim, H. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microengineered+physiological+biomimicry%3A+organs-on-chips%5BTitle%5D)+AND+%22Lab.+Chip%22%5BJournal%5D)">Microengineered physiological biomimicry: organs-on-chips.</a> Lab. Chip. 12, 2156-2164 (2012).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ici, nous présentons un protocole qui repose sur la technologie vMTF précédemment développé, permettant des temps d&#39;expérimentation prolongées plus typique des voies de maladies vasculaires chroniques 1,23,24. Pour ce faire, nous motif fin génipine, qui a été montré précédemment pour fournir fonctionnalisation à long terme des substrats PDMS 11, en ​​utilisant une technique de dépôt microfluidique pour produire des lamelles artérielle d&#39;ingénierie avec amélioration de la viabilité du tissu ...

Les maladies vasculaires, tels que le vasospasme cérébral 1,2, 3 hypertension, l&#39;athérosclérose et 4, se développent lentement, sont généralement de nature chronique, et impliquent dysfonctionnel génération de force par les cellules musculaires lisses vasculaires (CMLV). Nous visons à étudier ces dysfonctionnements vasculaires progresse lentement à l&#39;aide de méthodes in vitro avec un contrôle plus fin des conditions expérimentales que les modèles in vivo. Films musculaires vasculaires Nous avons déjà développés minces (vMTFs) pour mesurer la contractilité fonctionnelle in vitro conçus tissus cardiovasculaires 5, mais cette méthode a été limitée à des études à relativement court terme. Ici, nous présentons une technique de modification du substrat qui élargit notre technique vMTF précédente pour les mesures à long terme. Bien que l&#39;endothélium est également critique en fonction globale vasculaire, lamelles artérielle conçue fournir un système de modèle utile pour évaluer les changements dans vasculairecontractilité pendant la progression de la maladie. Pour concevoir un modèle de tissu de maladie vasculaire fonctionnel, à la fois la structure et la fonction de la lamelle artériel, l&#39;appareil contractile de base de la cuve, doit être récapitulé avec une grande fidélité. Arterial lamelles sont concentriques feuilles de CMLV contractiles séparées par des feuilles de 6 élastine, la circonférence-alignés. L&#39;impression par microcontact de la matrice extracellulaire (MEC) protéines sur polydiméthylsiloxane (PDMS) substrats a déjà été utilisé pour fournir des signaux de guidage pour l&#39;organisation des tissus pour imiter aligné tissu cardiovasculaire 5,7-10. Cependant, tissus à motifs en utilisant l&#39;impression microcontact peuvent perdre leur intégrité après 3-4 jours de culture, limitant leur applicabilité dans les études chroniques. Ce protocole fournit une solution à ce problème en remplaçant les techniques d&#39;impression par microcontact précédentes avec une nouvelle technique de dépôt microfluidique. Genchi et al. PDMS substrats modifiés avec génipine et found viabilité des myocytes prolongée jusqu&#39;à un mois dans la culture 11. Ici, nous utilisons une approche similaire pour étendre la culture de cellules motifs musculaires lisses vasculaires sur PDMS. Génipine, un dérivé hydrolytique naturelle du fruit de gardénia, est un candidat souhaitable pour la modification du substrat en raison de sa toxicité relativement faible par rapport aux agents de reticulation similaires et son utilisation croissante comme biomatériau dans les domaines de la réparation des tissus 12,13 et modification de l&#39;ECM 14, 15. Dans ce protocole, la fibronectine est utilisée comme repère de guidage de la cellule, comme dans les méthodes d&#39;impression par microcontact précédentes; Toutefois, génipine est déposé sur PDMS substrats antérieurs à la fibronectine structuration. Ainsi, comme les cellules dégradent la matrice à motifs, ECM nouvellement synthétisé à partir de CMLV attachés peut se lier au substrat de PDMS génipine revêtu. Ce protocole utilise un dispositif de délivrance pour la génipine microfluidique en deux étapes et le dépôt ECM. La conception du dispositif microfluidique imite microcomotifs d&#39;impression NTACT utilisés pour lamelles artérielle conçu dans les études précédentes 16. Ainsi, nous nous attendons à ce protocole pour obtenir imite artérielle de lamelles qui récapitulent avec succès le très-alignés dans la structure in vivo et de la fonction contractile du artérielle lamelles. On évalue également la contractilité du tissu afin de confirmer que la génipine est un composé de modification de substrat approprié pour le long terme dans des modèles de maladies vasculaires in vitro.

<table><tbody><tr><td>Coverslip de coloration</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td><a href="http://www.emsdiasum.com/">www.emsdiasum.com/</a></td><td>72239-04</td></tr><tr><td>Verre de protection de microscope - 25 mm</td><td>Fisher Scientific, Inc.</td><td><a href="http://www.fishersci.com/">www.fishersci.com</a></td><td>12-545-102</td></tr><tr><td>Poly(N-iso-propylacrylamide) (PIPAAm)</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>#21458</td></tr><tr><td>1-butanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>360465</td></tr><tr><td>Spincoater</td><td>Specialty Coating Systems, Inc.</td><td><a href="http://www.scscoatings.com/">www.scscoatings.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Polydiméthylsiloxane (PDMS)</td><td>Ellsworth Adhesives (Dow Corning)</td><td><a href="http://www.ellsworth.com/">www.ellsworth.com</a></td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td></tr><tr><td>Microbilles fluorescentes</td><td>Polysciences, Inc.</td><td><a href="http://www.polysciences.com/">www.polysciences.com/</a></td><td>17151</td></tr><tr><td>Plaquettes de silicium</td><td>Wafer World, Inc.</td><td><a href="http://www.waferworld.com/">www.waferworld.com</a></td><td>2398</td></tr><tr><td>Photoresist&nbsp ;</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Aligneur de masque de contact</td><td>Suss MicroTec</td><td><a href="http://www.suss.com/">www.suss.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Developer</td><td>MicroChem Corp.</td><td><a href="http://www.microchem.com/">www.microchem.com</a></td><td></td></tr><tr><td>Tridecafluro-trichlorosilane</td><td>UCT Specialties, Inc.</td><td><a href="http://www.unitedchem.com/">www.unitedchem.com</a></td><td>T2492</td></tr><tr><td>Poinçon de biopsie chirurgicale</td><td>Integra LifeSciences Corp.</td><td><a href="http://www.miltex.com/">www.miltex.com</a></td><td>33-31AA-P/25</td></tr><tr><td>Genipin</td><td>Cayman Chemical</td><td><a href="http://www.caymanchem.com/">www.caymanchem.com</a></td><td>10010622</td></tr><tr><td>1X solution saline tamponnée au phosphate</td><td>Mediatech, Inc.</td><td><a href="http://www.cellgro.com/">www.cellgro.com</a></td><td>21-031-CV</td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Corning, Inc.</td><td><a href="http://www.corning.com/">www.corning.com</a></td><td>356008</td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Life Technologies, Inc.</td><td><a href="http://www.lifetechnologies.com/">www.lifetechnologies.com</a></td><td>15140-122</td></tr><tr><td>Cellules musculaires lisses de l’artère ombilicale</td><td>Lonza</td><td><a href="http://www.lonza.com/">www.lonza.com</a></td><td>CC-2579</td></tr><tr><td>Composants de la solution Tyrode</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>divers</td></tr><tr><td>Stéréomicroscope</td><td>Zeiss</td><td><a href="http://www.zeiss.com/">www.zeiss.com</a></td><td>4350020000000000</td></tr><tr><td>Plateforme à température contrôlée</td><td>Warner Instruments</td><td><a href="http://www.warneronline.com/">www.warneronline.com</a></td><td>641659 ; 640352 ; 641922</td></tr><tr><td>Endothelin-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>E7764-50UG</td></tr><tr><td>HA-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/">www.sigmaaldrich.com</a></td><td>H139-10MG</td></tr></tbody></table>

microfluidique génipine dépôt technique de la culture avancée de microélectrodes vasculaires musculaires thin films

Microfluidic Genipin Deposition Technique for Extended Culture of Micropatterned Vascular Muscular Thin Films

La nature chronique de la progression des maladies vasculaires nécessite le développement de techniques expérimentales qui simulent les comportements vasculaires physiologiques et pathologiques sur des échelles de temps pertinentes pour la maladie. Auparavant, l’impression par microcontact a été utilisée pour fabriquer des imitations artérielles fonctionnelles bidimensionnelles par le biais de la structuration de protéines de matrice extracellulaire comme signaux de guidage pour l’organisation des tissus. Des couches minces de muscles vasculaires ont utilisé ces mimiques pour évaluer la contractilité fonctionnelle. Cependant, la technique de fabrication d’impression par microcontact utilisée intègre généralement des substrats PDMS hydrophobes. Au fur et à mesure que le tissu retourne la matrice extracellulaire sous-jacente, les nouvelles protéines doivent subir un changement de conformation ou une dénaturation afin d’exposer les résidus d’acides aminés hydrophobes aux surfaces hydrophobes du PDMS pour la fixation, entraînant une bioactivité altérée des protéines de la matrice, une délamination et la mort des tissus.
Ici, nous présentons une technique de dépôt microfluidique pour la structuration du composé de réticulation génipine. La génipine sert d’intermédiaire entre les tissus à motifs et les substrats PDMS, permettant aux cellules de déposer des protéines de matrice extracellulaire nouvellement synthétisées sur une surface plus hydrophile et de rester attachées aux substrats PDMS. Nous montrons également que les protéines de la matrice extracellulaire peuvent être modelées directement sur la génipine déposée, ce qui permet de dicter la structure tissulaire modifiée. Les tissus fabriqués avec cette technique montrent une grande fidélité dans l’alignement structurel et la fonction contractile du tissu musculaire lisse vasculaire dans un modèle de film mince musculaire vasculaire. Cette technique peut être étendue à l’aide d’autres types de cellules et fournit le cadre d’une étude future de la fonctionnalité chronique des tissus et des organes.

L&#39;objectif principal de ce travail était d&#39;étendre la viabilité de CMLV microélectrodes sur PDMS substrats hydrophobes. Ceci a été accompli en incorporant un système de délivrance pour déposer microfluidique génipine à motifs et de la fibronectine sur PDMS (figure 1). Dépôt de protéines ECM en utilisant la livraison microfluidique a abouti à un transfert de haute fidélité du modèle de canal avec PDMS nus entre les lignes de génipine et de la fibronectine (figure 1D). Les cellule...

Nous présentons une méthode pour le dépôt microfluidique de génipine et de fibronectine sur des substrats PDMS, permettant une viabilité prolongée des tissus denses en cellules musculaires lisses vasculaires. Cette méthode de fabrication tissulaire est combinée à la technologie précédente de couche mince musculaire vasculaire pour mesurer la contractilité vasculaire au cours de l’évolution temporelle de la maladie.

Microfluidique génipine dépôt Technique de la culture avancée de microélectrodes vasculaires musculaires Thin Films

The chronic nature of vascular disease progression requires the development of experimental techniques that simulate physiologic and pathologic vascular ...

L'objectif général de cette procédure est de développer un modèle in vitro de la fonction contractile du muscle lisse qui puisse être utilisé pour étudier les mécanismes des dysfonctionnements vasculaires, tels que les vasospasmes cérébraux, sur des échelles de temps pertinentes pour la maladie. Ceci est réalisé à l'aide de films minces musculaires vasculaires à long terme, en préparant d'abord des substrats élastomères par dépôt successif, par centrifugation, sur des lamelles, d'une bande de piam suivie de PDMS. La deuxième étape consiste à utiliser un dispositif de dépôt microfluidique pour déposer successivement de la géline et de la fibronectine à la surface.Afin de fournir des indices de guidage pour l'auto-organisation tissulaire sur des films minces vasculaires et musculaires, la dernière étape consiste à réaliser un test de contractilité en stimulant les films minces vasculaires et musculaires afin d'induire puis de relâcher la contraction, tout en imagerie l'échantillon. En définitive, cette approche permet d'obtenir des tissus qui conservent leur intégrité structurelle et leur contractilité fonctionnelle jusqu'à deux semaines en culture. Le principal avantage de cette tec

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Bioengineering

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Dans ce protocole, nous démontrons la fabrication d'un tableau de messages microactionneur déplacé verticalement sur lequel la technologie est basée, et comment cette technologie de base peut être modifié pour mener à haut débit de culture de cellules mécanique dynamique dans la culture à la fois à deux dimensions et en trois dimensions paradigmes.

Plates-formes pour la culture cellulaire microfabriqués mécanique dynamique

Des techniques simples sont décrites pour la production rapide de systèmes de culture microfabriqué neurones en utilisant un dispositif micromiroirs numériques pour la lithographie masque de projection dynamique sur réguliers des substrats de culture cellulaire. Ces systèmes de culture peut être plus représentatif de l'architecture biologique naturel, et les techniques décrites peuvent être adaptées pour de nombreuses applications.

Fabrication d&#39;hydrogels pour les systèmes de culture Micropatterned neuronaux utilisant la photolithographie dynamique projection de masque

Procédé pour la culture d'une monocouche de cellules endothéliales sur toute la surface intérieure 3D d'un dispositif microfluidique avec microvasculaire taille canaux (&lt;30 um) est décrite.

Microfluidique endothélialisée pour étudier les interactions microvasculaires dans Hémopathies

Une plate-forme microcanaux-on-a-chip a été développé par la combinaison de la technique de photolithographie reflowable de résine photosensible, lithographie douce, et la microfluidique. La plate-forme de micro-canaux endothélialisée imite la géométrie en trois dimensions (3D) des microvaisseaux in vivo, fonctionne sous débit de perfusion continue contrôlée, permet l'imagerie de haute qualité et en temps réel et peut être appliqué pour la recherche microvasculaire.

Procédure à suivre pour le développement de la multi-profondeur circulaire transversale endothélialisées microcanaux-on-a-chip

Ce manuscrit présente un procédé de moulage par injection pour concevoir des microvaisseaux qui récapitulent les propriétés physiologiques de l'endothélium. Le procédé à base microfluidique crée des réseaux vasculaires 3D de brevet avec conditions, adaptable telles que le débit, la composition cellulaire, la géométrie, et les gradients biochimiques. Le procédé de fabrication et des exemples d'applications possibles sont décrites.

Micromodelage et l&#39;Assemblée des microvaisseaux 3D

Ce protocole décrit la mise en œuvre de la dégradation de l’hydrogel guidée par l’image, basée sur le laser, pour fabriquer des réseaux microfluidiques biomimétiques dérivés de vaisseaux intégrés dans des hydrogels de poly(éthylène glycol) diacrylate (PEGDA). Ces systèmes microfluidiques biomimétiques peuvent être utiles pour les applications d’ingénierie tissulaire, la génération de modèles de maladies in vitro et la fabrication de dispositifs avancés « sur puce ».

, Fabrication de réseaux microfluidiques vasculaire dérivés à base de laser guidée par l&#39;image

Nous fournissons un protocole généralisé basé sur une stratégie de bioprinting microfluidiques pour génie un lit vasculaire microfibreux, où un type de cellule secondaire pourrait être encore semé dans l’espace interstitiel de cette structure microfibreux pour générer des organoids et des tissus vascularisés.

Microfluidique Bioprinting génie vascularisé tissus et organoïdes

Le protocole décrit comment un réseau vasculaire irrigables dans un sphéroïde de l’ingénieur. Microenvironnement environnants de l’ellipsoïde est conçu pour induire l’angiogenèse et connecter l’ellipsoïde aux microcanaux dans un dispositif microfluidique. La méthode permet la perfusion de l’ellipsoïde, qui est une technique attendue dans les cultures en trois dimensions.

Irrigables réseau vasculaire avec un modèle de tissu dans un dispositif microfluidique

Ici, nous présentons un protocole pour générer un modèle de peau tridimensionnel simplifié et indifférencié à l’aide d’une plate-forme microfluidique micro-usinée. Une approche à flux parallèle permet le dépôt in situ d’un compartiment dermique pour l’ensemencement de cellules épithéliales sur le dessus, le tout contrôlé par des pompes à seringues.

Génération d’un modèle tridimensionnel simplifié de peau sur puce dans une plate-forme microfluidique micro-usinée

Le but de ce protocole est d’expliquer et de démontrer le développement d’un modèle microfluidique tridimensionnel (3D) de tissu cardiaque humain fortement aligné, composé de cardiomyocytes dérivés de cellules souches co-cultivés avec des fibroblastes cardiaques (CFs) dans un hydrogel biomimétique et à base de collagène, pour des applications dans l’ingénierie tissulaire cardiaque, le criblage de drogue, et la modélisation de maladie.

Développement de tissu cardiaque humain organisé en 3D au sein d’une plate-forme microfluidique

Nous présentons un protocole pour la production à haut débit de canaux vasculaires avec des tailles flexibles et des motifs souhaités sur une plaque standard à six puits en utilisant la technologie de bio-impression 3D, appelée vaisseaux sur plaque (VOP). Cette plateforme a le potentiel de faire progresser le développement de traitements pour les troubles associés à l’endothélium compromis.

Procédé de bio-impression à haut débit pour modéliser la perméabilité vasculaire dans des plaques standard à six puits avec flexibilité de taille et de motif

Découvrez la déposition microfluidique de génipine et de fibronectine sur substrats PDMS pour améliorer la viabilité des tissus vasculaires musculaires. Cette méthode permet d'étudier la contractilité vasculaire sur des durées prolongées.

Microfluidique génipine dépôt Technique de la culture avancée de microélectrodes vasculaires musculaires Thin Films

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