Name: Cellules T Capturez bactéries par Transinfection de cellules dendritiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Découvrez comment quantifier la transinfection bactérienne des cellules T CD4+ à partir de cellules dendritiques infectées chez la souris. Cette méthode révèle que les lymphocytes T capturent et éliminent les bactéries plus efficacement que les phagocytes professionnels.

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Ce travail a été soutenu par les subventions BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC du ministère espagnol de la Science et de l’Innovation et PIES201020I046 du Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).

Remarque: Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité d&#39;éthique de la recherche de l&#39;Universidad Autónoma de Madrid et menés sous la supervision de l&#39;Universidad Autónoma de Madrid chef de la protection des animaux et de la santé, conformément aux directives européennes et espagnoles. Les souris ont été élevés en exempts d&#39;agents pathogènes (SPF) logements spécifiques et ils ont été euthanasiés par du personnel formé et qualifié à l&#39;aide de dioxyde de carbone (CO 2) méthode de l&#39;inhalation. 1. souris dérivées de moelle osseuse PED Différenciation et Infection Remarque: La figure 1 résume cette première étape. Toutes les procédures doivent être effectuées dans la hotte partir de ce point, en utilisant uniquement des médias, des instruments, des embouts de pipette stériles et des boîtes de culture. <ol><li> Souris dérivées de moelle osseuse PED Différenciation <ol><li> Disséquer les tibias et les fémurs d&#39;un C57 / BL6 souris 22 et transférer dans un plat en plastique avec 10 ml de milieu RPMI. </li&gt; <li> Couper chaque épiphyse off, avec des ciseaux stériles et d&#39;exposer la moelle osseuse, qui a une couleur rouge vif caractéristique. </li><li> Infuser à l&#39;intérieur de l&#39;os avec 10 ml d&#39;une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,5% d&#39;albumine de sérum bovin (BSA) et 5 mM d&#39;acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) (tampon / BSA / EDTA PBS) en utilisant une seringue stérile sur une Petri stérile plat. </li><li> Recueillir la suspension de cellules et centrifugation dans un tube à 600 x g dans une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C). </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de chlorure d&#39;ammonium-potassium-réception (ACK) du tampon de lyse (0,15 M de NH 4 Cl, 10 mM de KHCO3 et EDTA 0,1 mM) et on incube pendant 30 secondes à la température ambiante afin d&#39;éliminer les globules rouges. </li><li> Ajouter 10 ml de milieu RPMI 1640 avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et filtrer à travers un tamis cellulaire (70 um) pour éliminer les fragments d&#39;os et des amas de cellules avant la centrifugation à la même vitesse (600 x g), parce que des amas ont été éliminés par filtration. </li><li> Compter les cellules d&#39;und ajuster à 5 x 10 5 cellules / ml avec du milieu RPMI 10% SVF (contenant 50 uM B-mercaptoéthanol, du pyruvate de sodium 1 mM) et ajouter 20 ng / ml murin de colonies facteur recombinant granulocyte-macrophage stimulante (rm-GM-CSF) en tant que concentration finale. </li><li> Ajouter cette suspension à un stérile, la qualité microbiologique, 15 cm boîte de Petri, et de la culture dans un incubateur à CO 2 (37 ° C, 5% de CO 2). </li><li> Tous les trois jours, ralentissent les deux cellules non adhérentes et les cellules individuelles avec EDTA 5 mM dans du PBS et remettre en suspension à 5 x 10 5 cellules / ml de la densité cellulaire, du milieu frais contenant 20 ng / ml rm-GM-CSF. </li></ol></li><li> Maturation des CD et Antigen Chargement <ol><li> Au jour 9, remettre les cellules à 5 x 10 5 cellules / ml de la densité dans un milieu contenant 20 ng / ml rm-GM-CSF. Ensuite, ajouter 20 ng / ml de lipopolysaccharide (LPS) pour permettre l&#39;expression du CMH-II élevée sur les cellules et incuber dans une culture traitée stérile plat 15 cm Petri non-tissulaire pendant 24 heures. </li><li> Après unejour de LPS-stimulation, tacher certaines cellules DC avec des anticorps contre CD11c de la souris, MHCII et Gr-1 pour vérifier la différenciation des PED par cytométrie de flux. Un exemple d&#39;analyse par cytométrie en flux des DC est représenté sur la Figure 3A et 3B. <ol><li> Incuber les DC (5 x 10 5 cellules / échantillon) avec un anticorps monoclonal anti-souris-CD16 / CD32 à 2,5 ug / ml de concentration finale dans 50 ul de PBS / BSA / EDTA par échantillon. Ensuite, ajouter 50 ul d&#39;anticorps contre MHCII (IA / IE), CD11c et Gr-1 conjugué avec différents fluorochromes à 1: 100, 1: 200 et 1: 500 en / BSA tampon PBS / EDTA respectivement. </li><li> Enfin, laver avec DC / BSA tampon PBS / EDTA et analyser par cytométrie de flux selon le protocole du fabricant. Remarque: Si les cellules sont bien différenciées, les cellules sont prêtes pour l&#39;antigène chargement. </li></ol></li><li> Wash DC avec du RPMI 10% de FBS (sans antibiotiques) et les incuber avec 10 ng / ml OTII OVAp (OVA 323-339; ISQAVHAAHAEINEAGR) sur un tube en plastique dans 1 ml de IPMB 10% FBS par 5 x 10 6 PED pour un minimum de 1 heure à 37 ºC. Comme témoin négatif, laissez PED sans incubation avec OVAp. </li></ol></li><li> Infection des PED <ol><li> Infect DC à une multiplicité d&#39;infection (MOI) de 10 bactéries par des bactéries (10) à courant continu pendant 1 heure dans un incubateur à CO2 (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Laver les cellules DC 3x dans PBS et 1x en IPMB 10% de FBS et centrifuger à 450 xg afin de laver la plupart des bactéries extracellulaires. Enfin, remettre les cellules en milieu RPMI 10% SVF (sans antibiotiques) à 20 x 10 6 cellules / ml. </li></ol></li></ol> 2. Isolement des lymphocytes T CD4 + à partir de souris transgéniques OTII Remarque: La figure 1 résume cette seconde étape. Les ganglions lymphatiques doivent être utilisés à la place de la rate pour isoler des cellules T CD4 +, car la proportion de lymphocytes T CD4 + dans les ganglions lymphatiquess (~ 50%) est plus grande que dans la rate (~ 25%) et donc la purification serait plus efficace. <ol><li> Assurez suspension unicellulaire de ganglions lymphatiques <ol><li> Retirer le inguinale, axillaire, brachiale, col de l&#39;utérus et les nœuds lymphatiques mésentériques de souris transgéniques 23 OTII et transférer dans un récipient plat en plastique avec 10 ml de RPMI 10% FBS milieu. </li><li> Ganglions lymphatiques Grind sous une hotte stérile en utilisant deux lames de microscope dépoli. Placez les ganglions lymphatiques sur un côté givré d&#39;une lame de microscope, et frotter avec le côté givré de la deuxième diapositive jusqu&#39;à organes ont été broyées. </li><li> Laver suspension cellulaire unique dans un tampon PBS / BSA / EDTA. </li><li> Filtrer les cellules si un tamis cellulaire (70 um) pour éliminer le tissu conjonctif et laver avec tampon PBS / BSA / EDTA. </li><li> Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de tampon de lyse ACK et incuber pendant 1 min à température ambiante afin d&#39;éliminer les globules rouges. </li></ol></li><li> Isolement de cellules T CD4 + <ol><li> Laver à nouveau comme à l&#39;étape 2.1.3 et comptageremettre en suspension les cellules à 100 x 10 à 6 cellules / ml dans / BSA tampon PBS / EDTA. Ajouter anticorps biotinylés contre CD8, IgM, B220, CD19, CMH de classe II (I-Ab), CD11b, CD11c et DX5 au 1: 250 pendant 30 min sur de la glace pour la sélection tard négatif de cellules T CD4 +. </li><li> Laver les cellules dans / BSA tampon PBS / EDTA et on incube les cellules (100 x 10 6 cellules / ml) avec des microbilles de streptavidine à la concentration recommandée dans le protocole du fabricant pendant 15 minutes sur de la glace. </li><li> Laver les cellules dans / BSA tampon PBS / EDTA et filtrer si un tamis cellulaire (30 um) avant l&#39;isolement de cellules T CD4 +. </li><li> Isoler les cellules T CD4 + par une sélection négative en utilisant un appareil de séparation magnétique de cellules selon le protocole du fabricant. </li><li> Compter les cellules et ajuster 4 x 10 6 cellules / ml avec du RPMI 10% FBS (sans antibiotiques). </li><li> Fixer et de garder sur les cellules T CD4 + de glace isolé (3 x 10 5 cellules) pour vérifier la pureté par le fluxcytomètre de la manière décrite 24. Un exemple de cellules T CD4 + purification est représenté sur la figure 3C. </li></ol></li></ol> 3. cellules T Transinfection mesure par dosage protection gentamicine Remarque: La figure 2 résume cette troisième étape du protocole. <ol><li> T Transinfection cellulaire <ol><li> Incuber les cellules T CD4 + isolées avec des cellules infectées DC (1: 1) (les pays en développement ont été infectées pendant 1 h et lavé pour éliminer les bactéries libres) pendant 30 minutes pour permettre la formation de la synapse dans un incubateur à CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Ajouter 0,5 ml de cellules T CD4 + isolées (2 x 10 6 cellules) et 0,1 ml des CD infectées (2 x 10 6 cellules) sur une plaque de culture à 24 puits. Comme contrôle négatif, infecter directement 0,5 ml de cellules T CD4 + à une MOI de 10 bactéries pendant 30 min. </li><li> Inclure des contrôles supplémentaires qui séparent DC infectées à partir de cellules T à l&#39;aideune barrière polycarbonate Transwell (avec 3 um de taille de pore), ce qui empêche DC-T contact physique. Ajouter 0,1 ml de DC à l&#39;intérieur du transwell et 0,5 ml de cellules T CD4 + dans le compartiment inférieur du puits (plaque 24 puits). </li><li> Enfin, complet avec support IPMB jusqu&#39;à ce qu&#39;il y est de 0,6 ml dans chaque puits pour faire des volumes égaux dans tous les échantillons. </li><li> Après 30 min de la formation des synapses immunitaire, ajouter 100 pg / ml de gentamicine et incuber pendant 1 heure avant de recueillir les cellules dans un incubateur à CO2 (37 ° C, 5% CO 2). </li></ol></li><li> Re-isolement de cellules T CD4 + <ol><li> Recueillir les cellules non adhérentes et les remettre en suspension dans du tampon PBS / BSA / EDTA. La plupart des pays en développement restent attachés à la plaque de culture en plastique. Tubes Vortex doucement pour assurer la désagrégation de la cellule. Gardez 500 pi de surnageant cellulaire que le contrôle de montrer que la gentamicine a bien fonctionné. </li><li> Ré-isoler les cellules T CD4 + à partir d&#39;échantillons contenant les DC et les cellules T en même temps que dans l&#39;étape 2.2, Bien que la plupart des pays en développement auraient fixé sur la plaque. Gardez les échantillons de contrôle sur la glace. Prenez en compte que les expériences de contamination inférieur à 2%. Un exemple de cellules T CD4 + après purification transinfection est représenté sur la figure 3D. </li></ol></li><li> Lyse cellules T et les épépiner sur Bactéries Plaques Moyen-agar. <ol><li> Laver les cellules T CD4 + deux fois avec du PBS. </li><li> Compter les cellules et remettre en suspension les 2 à 6 x 10 cellules / ml dans du PBS. </li><li> Ajouter 500 ul de 0,1% de Triton X-100 dans 500 ul de cellules T pour les lyser à 1 x 10 6 cellules / ml, en libérant les bactéries intracellulaires sur les cellules T. </li><li> Faire des dilutions en série 3 décimales de cellules lysées et ensemencer 50 ul de chaque dilution sur des plaques de gélose bactéries moyennes. Diviser plaques en 4 portions et épépiner les différentes dilutions de cellules lysées dans chaque partie. Les résultats représentatifs sont présentés sur la figure 4. <ol><li> Comme témoin, la plaque aussi lestocké surnageant cellulaire des conjugués sur de la gélose, de sorte que la gentamicine a bien fonctionné. Aussi plaque DC infectées comme un contrôle supplémentaire. En cas de contamination se produit à faible PED (&lt;2%), soustraire les unités formant colonie (UFC) correspondant à la contamination DC faible. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Quantification des cellules T Transinfection par cytométrie en flux Remarque: La figure 2 résume cette étape. <ol><li> T Mobile Transinfection <ol><li> Infecter BMDCs comme dans l&#39;étape 1.3, mais utiliser GFP exprimant bactéries dans ce cas. </li><li> Stain cellules CD4 + T (isolés à partir de ganglions lymphatiques dans l&#39;étape 2.2) avec un aminocoumarine tracker cellule de chlorométhyle (CCMC) pendant 30 min à 37 ºC selon le protocole du fabricant. </li><li> Laver les cellules T CD4 + marqués deux fois avec IPMB 10% de FBS (sans antibiotiques). </li><li> Incuber DC infectées (après 1 h d&#39;incubation avec des bactéries) avec marqué CD4 +Les cellules T pour 30 min pour permettre la formation de synapse immunologique à 37 ºC, y compris tous les contrôles expliquant à l&#39;étape 3.1.1. </li></ol></li><li> Coloration des cellules infectées par T CD4 + <ol><li> Après 30 min de DC-T création de la synapse, recueillir des cellules et lavez-les dans du PBS / BSA / EDTA. </li><li> Après deux lavages avec du tampon PBS / BSA / EDTA, les cellules agrégés distincts par vortex doucement les tubes. </li><li> Fixer les échantillons dans 0,2 ml / tube de PBS contenant 3% de PFA pendant 15 min à température ambiante. Ensuite, lavez-les dans du PBS. </li><li> Incuber avec l&#39;anticorps monoclonal anti-souris-CD16 / CD32 (2,5 pg / ml) dans 50 ul / échantillon de PBS / BSA / EDTA pendant 15 minutes sur de la glace pour bloquer les récepteurs Fc des cellules dendritiques. </li><li> Ajouter un lapin anti-bactéries anticorps (10 pg / ml comme concentration finale) à 50 ul / échantillon de PBS / BSA / EDTA pendant 30 minutes sur de la glace pour colorer les bactéries extracellulaires. </li><li> Laver les cellules avec du PBS / BSA / EDTA et on incube avec un anticorps contre CD11c de souris conjugué à de la phycoérythrine (PE) et un soicondaire anticorps contre lapin conjugué avec d&#39;autres comme fluorochrome Alexa-Fluor 647 au 1: 200 dans 100 pi / échantillon de PBS / BSA / EDTA pendant 30 minutes sur la glace. </li><li> Laver les cellules et analyser les échantillons par cytométrie en flux. Ne pas oublier d&#39;inclure un échantillon de cellules T transinfected utilisant des bactéries non-fluorescentes comme contrôle négatif et les échantillons étiquetés avec un seul de chaque fluorochrome utilisé dans l&#39;expérience pour compenser les échantillons et d&#39;ajuster la cytométrie de flux paramètres 25. Analyse représentative est représentée sur la Figure 5. Remarque: si les bactéries ne pas exprimer la GFP, de distinguer les bactéries extracellulaires et intracellulaires, extracellulaires étiquette bactéries, en fixer et perméabiliser les échantillons avec du Triton X-100 à 0,5% dans du PBS pendant 5 min. Ensuite tacher bactéries intracellulaires totaux (+ extracellulaire) avec un fluorochrome différent. </li></ol></li></ol>

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cellules T ou lymphocytes T sont un type de leucocytes qui jouent un rôle central dans l&#39;immunité à médiation cellulaire et appartiennent à la 26 réponse immunitaire adaptative. Les cellules T sont réfractaires à être infectés in vitro mais certains rapports indiquent qu&#39;ils peuvent être infectés in vivo 14,15. Les contacts intimes de cellules APC et T au cours de synapse immunologique servent de plates-formes d&#39;échange de matériel biologique 13, y compris c...

Quand un agent pathogène infecte son hôte, il ya généralement une activation des réponses immunitaires innées et adaptatives, nécessaires à la clairance bactérienne. L&#39;immunité innée est la première ligne de défense qui empêche la plupart des infections. L&#39;immunité innée distinguer dans un des éléments précis de façon qui sont conservés parmi les grands groupes de micro-organismes (motifs moléculaires associés à des pathogènes, PAMP) 1. Les mécanismes de l&#39;immunité innée sont les barrières physiques telles que la peau, les barrières chimiques (des peptides antimicrobiens, lysozyme) et les leucocytes innées, qui incluent les phagocytes (macrophages, les neutrophiles et les cellules dendritiques), les mastocytes, les éosinophiles, les basophiles et les cellules tueuses naturelles 2. Ces cellules identifier et éliminer les agents pathogènes, soit en les attaquant par contact ou par phagocytose, qui comprend pathogène engloutissant et le meurtre. Ce système ne permet pas de défense à vie, contrairement à l&#39;immunité adaptative, qui confèrent une mémoire immunologique contre pathogens. Le système immunitaire adaptatif est la deuxième ligne de défense et est capable de reconnaître et de réagir à des antigènes spécifiques de multiples microbienne et des substances non-microbiennes 3. Les principaux composants du système immunitaire adaptatif sont les lymphocytes, qui incluent les cellules B et T. Les cellules B sont impliqués dans la réponse humorale, sécrétant des anticorps contre des agents pathogènes ou de protéines exogènes. Cependant, les cellules T représentent l&#39;immunité à médiation cellulaire, la modulation de la réponse immunitaire ou la sécrétion des cytokines tuer les cellules infectées par des agents pathogènes 4. Les cellules présentant l&#39;antigène (CPA), notamment les cellules dendritiques ou les macrophages, les constituants du système immunitaire inné, capables de reconnaître les agents pathogènes de phagocytent et des composants bactériens de processus en antigènes, qui sont présentés à la surface des cellules par le complexe majeur d&#39;histocompatibilité (CMH) 7.5. Après APC ont phagocyté pathogènes, ils migrent habituellement dans les ganglions lymphatiques, la vidange où ils interagissent avec Tcellules. Les lymphocytes T peuvent reconnaître des complexes peptide-CMH spécifiques par leurs récepteurs de lymphocytes T. La synapse immunologique (SI) a lieu dans l&#39;interface entre un antigène APC-chargé et une présentation de l&#39;antigène des lymphocytes pendant 8,9. Certaines bactéries peuvent survivre phagocytose et de diffuser systématiquement au sein des APC. Dans cette perspective, les APC infectés servent de réservoirs bactériens ou «chevaux de Troie» qui facilitent la propagation bactérienne 10. Le contact intime entre les APC et les lymphocytes qui ont lieu au cours de la formation IS fonctionnent également comme une plate-forme pour l&#39;échange d&#39;une partie des membranes, le matériel génétique et les exosomes et peut être détourné pour certains virus pour infecter les cellules T; ce processus est appelé transinfection 11-13. Certaines bactéries pathogènes (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica et Shigella flexneri) peuvent envahir les lymphocytes T in vivo et modifier leur comportement 14-16. Nous avonsrécemment décrits que les lymphocytes T sont également capables de capturer les bactéries par transinfection de cellules dendritiques préalablement infectées (PED) au cours de la présentation de l&#39;antigène 16. T capter cellule bactérienne par transinfection extrêmement plus efficace (1,000-4,000x) que les infections directes. T pathogène des cellules de capture et des bactéries non pathogènes, indiquant que transinfection est un processus piloté par les cellules T. Il est frappant, transinfected T (TIT) cellules tuées rapidement les bactéries capturées et ont fait plus efficacement que les phagocytes professionnels 16. Ces résultats, qui cassent un dogme de l&#39;immunologie, montrent que les cellules de l&#39;immunité adaptative peuvent exécuter des fonctions qui étaient prétendument exclusif de l&#39;immunité innée. En outre, nous avons montré que les cellules de Tit sécrètent de grandes quantités de cytokines pro-inflammatoires et protéger contre les infections bactériennes in vivo. Ici, nous présentons les différents protocoles utilisés pour étudier le processus de transinfection bactérienne dansun modèle de souris. Ce modèle est basé sur l&#39;utilisation de cellules T CD4 + à partir de souris transgéniques OTII, qui portent un TCR spécifique de peptide OVA 323-339 de (OVAp) dans le cadre de I-Ab 17 qui interagissent spécifiquement avec os bactérienne infectée marrow- PED dérivés (BMDCs) 18,19 chargés de OVAp, formant des synapses immunitaires stables. T transinfection cellulaire peut être visualisée et suivie par microscopie de fluorescence. En outre, la cytométrie en flux peut être utilisé pour détecter les cellules infectées en tirant parti de la fluorescence émise par des bactéries exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) 16,20. En outre, T transinfection cellulaire peut être quantifiée par une approche plus sensible, le test de survie gentamicine qui permet la mesure d&#39;un grand nombre d&#39;événements. La gentamicine est un antibiotique qui ne peuvent pas pénétrer dans les cellules eucaryotes. Par conséquent, en utilisant cet antibiotique permet la différenciation des bactéries intracellulaires qui a survécu à l&#39;ajout fr antibiotiqueceux extracellulaires om qui ont été tués 21.

<table><tbody><tr><td>RPMI</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>r-GMCSF</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>LPS</td><td>SIGMA</td><td>L2630-10mg</td><td></td></tr><tr><td>Na Pyruvate</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH3023901</td><td></td></tr><tr><td>2-ME</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>OVAp OTII (323&ndash ; 339)</td><td>Crépine de cellule GenScript</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70uM</td><td>BD</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; 30 uM Seringue Filcons Stérile</td><td>BD</td><td>340598</td><td></td></tr><tr><td>AutoMacs Classic</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-088-887</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicine</td><td>Normon</td><td>624601.6</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Costar</td><td>3415</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>Pronadisa</td><td>1231</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Pronadisa</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde 16 %</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD8 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553029</td><td></td></tr><tr><td>IgM Biot</td><td>ImmunoStep</td><td>Clone RMM-1</td><td></td></tr><tr><td>B220 Biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553086</td><td></td></tr><tr><td>CD19 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553784</td><td></td></tr><tr><td>MHC-II Biot (I-A/I-E)</td><td>BD Biosciences</td><td>553622</td><td></td></tr><tr><td>CD11b biot</td><td>Immunostep</td><td>11BB-01mg</td><td></td></tr><tr><td>CD11c biot</td><td>Immunostep</td><td>11CB3-01mg</td><td></td></tr><tr><td>DX5 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553856</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 biot</td><td>BD Biosciences</td><td>553125</td><td></td></tr><tr><td>CD16/CD32</td><td>ImmunoStep</td><td>M16PU-05MG</td><td></td></tr><tr><td>anti Salmonella</td><td>ABD Serotec</td><td>8209-4006</td><td></td></tr><tr><td>CD11cPE</td><td>BD Biosciences</td><td>553802</td><td></td></tr><tr><td>CD4-APC</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>20-0041-U100</td><td></td></tr><tr><td>Gr-1 APC</td><td>BD Biosciences</td><td>553129</td><td></td></tr><tr><td>MHC-II (I-A/I-E) FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>553623</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor 647 Anticorps anti-IgG (H+L) de chèvre, hautement adsorbé croisé</td><td>Invitrogen</td><td>A-21245</td><td></td></tr><tr><td>CMAC (7-amino-4-chlorométhylcoumarine)</td><td>Life technologies</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A7030-100G</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles de streptavidine</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-048-101</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cellules t capturez bactéries par transinfection de cellules dendritiques

T Cells Capture Bacteria by Transinfection from Dendritic Cells

Récemment, nous avons montré, contrairement à ce qui est décrit, que les lymphocytes T CD4+, paradigme des cellules immunitaires adaptatives, capturent les bactéries des cellules dendritiques (DC) infectées par un processus appelé transinfection. Nous décrivons ici l’analyse du processus de transinfection, qui se produit au cours de la présentation de l’antigène. Ce processus a été dévoilé en utilisant des lymphocytes T CD4+ de souris transgéniques OTII, qui portent un récepteur de lymphocytes T (TCR) spécifique d’un peptide d’ovoalbumine (OVAp), qui peut donc former des complexes immuns stables avec des cellules dendritiques infectées chargées de cet OVAp spécifique. La dynamique des bactéries exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) pendant la transmission des cellules DC-T peut être surveillée par imagerie de cellules vivantes et la quantification de la transinfection bactérienne peut être effectuée par cytométrie en flux. De plus, la transinfection peut être quantifiée par une méthode plus sensible basée sur l’utilisation de gentamicine, un antibiotique aminoglycoside non perméable tuant les bactéries extracellulaires mais pas les bactéries intracellulaires. Cette méthode classique a déjà été utilisée en microbiologie pour étudier l’efficacité des infections bactériennes. Nous expliquons ici le protocole de l’ensemble du processus, de l’isolement des cellules primaires à la quantification de la transinfection.

Ici, nous avons décrit comment effectuer transinfection bactérienne des cellules T murin de la moelle osseuse infectée dérivée-PED et comment mesurer transinfection bactérienne via deux approches différentes: la cytométrie en flux et de la gentamicine survie dosage figure 1 résume la procédure pour obtenir les cellules.. DCs sont générés par incubation de cellules de moelle osseuse avec le GM-CSF pendant 9 jours. Ensuite, les PED sont maturée avec LPS pour augmenter MHCI...

Voici un protocole est présenté pour mesurer la capture bactérienne par les cellules T CD4 + qui se produit lors de la présentation de l&#39;antigène par les cellules dendritiques transinfection de pré-infectées (DC). Nous montrons comment effectuer les mesures nécessaires: l&#39;isolement de cellules primaires, infection de DC, DC / T la formation de conjugués de la cellule, et la mesure des bactérienne transfection de cellules T.

Cellules T Capturez bactéries par Transinfection de cellules dendritiques

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic ...

L'objectif général de cette procédure est de quantifier la transinfection des cellules T CD4+ par des bactéries, en utilisant un modèle de cellules murines. In vivo, certaines bactéries pathogènes telles que Listeria monocytogenes et Salmonella enteritidis sont capables d'infester les lymphocytes T et de modifier leur comportement. Toutefois, in vitro, les cellules T sont difficiles à infecter.À partir de cette observation, nous avons étudié si les cellules T pouvaient capturer des bactéries à partir de cellules dendritiques infectées pendant la présentation de l'antigène, comme cela se produit lors d'infections virales. Nous avons constaté que les cellules T capturent les bactéries puis les tuent. En réalité, nous avons découvert que les cellules T accomplissent cela plus efficacement que les phagocytes professionnels.Ces résultats contredisent un principe fondamental de l'immunologie, en montrant que des cellules de l'immunité adaptative peuvent exercer des fonctions censément réservées à l'immunité innée. Aujourd'hui, nous présentons le protocole utilisé pour étudier le processus de transinfection bactérienne dans un modèle murin. Esteban Veiga et moi-même allons démontrer cette procédure avec Guillermo Ramirez-Santiago, Raquelle Garcia-Ferreras, deux étudiants en master, et Monica Torres-Torresano, une technicienne.Remarquez que toutes les procédures décrites dans cette vidéo doivent être effectuées sous hotte, en utilisant uniquement des milieux, instruments, embouts de pipette et boîtes de culture stériles. Dans une boîte de Pétri stérile de 15 centimètres non traitée pour la culture de tissus, ajoutez un microlitre d'un microgramme par millilitre de lipopolysaccharide sur les cellules dendritiques dérivées de moelle osseuse provenant d'une souris unique. Incubez les cellules pendant 24 heures afin d'augmenter l'expression du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II, ou CMH II.Après l'incubation, effectuez une cytométrie en flux pour confirmer l'expression de l'HLA de classe II et la différenciation. Une fois l'expression de l'HLA de classe II confirmée, comme illustré ici, transférez les cellules dans un tube stérile en polypropylène de 50 millilitres. Ajoutez 10 millilitres de PBS contenant 5 millimolaires de EDTA, puis centrifugez les cellules à 600 x g.Une fois la centrifugation terminée, effectuez un lavage en resuspendant les cellules dans du RPMI contenant 10 % de FCS, puis centrifugez à nouveau. Ensuite, après le lavage, ajoutez un millilitre de RPMI 10 % FCS pour chaque cinq fois 10 à la puissance six cellules dendritiques, et pipetez plusieurs fois vers le haut et vers le bas afin de les resuspendre. Puis, répartissez les cellules dendritiques resuspendues en deux tubes de volume égal.À un tube, ajouter 10 microgrammes par millilitre d'OT-II OVAp. Laisser l'autre tube non traité. Il servira de témoin négatif pour le chargement de l'antigène.Incuber les tubes pendant au moins une heure afin de charger les molécules CMH II des cellules dendritiques avec le peptide OVA. Pendant ce temps, préparer la Salmonella enteritidis pour l'infection en la lavant trois fois avec une solution de PBS. Centrifuger entre chaque lavage à 1800 x g pour éliminer le milieu LB et toutes les toxines sécrétées.Ensuite, resuspendre les bactéries dans du RPMI. Après l'incubation, infecter chaque tube de cellules dendritiques à une multiplicité d'infection (MOI) de 10, puis incuber les cellules pendant une heure. Une fois les cellules infectées, les laver trois fois avec du PBS, puis une fois avec du RPMI contenant 10 % de FBS.Centrifuger entre les lavages à 450 x g pour éliminer la majeure partie des bactéries extracellulaires présentes dans l'OVAp soluble. Après la dernière centrifugation, resuspendre les cellules dans du RPMI 10 % FBS à une concentration de 20 fois 10 à la sixième cellules par millilitre. Dans une plaque de culture 24 puits, ajouter deux millions de cellules T CD4+ dans un volume de 0,5 millilitre dans chacun des cinq puits.Ensuite, afin de contrôler le contact physique, placez des barrières transwell en polycarbonate avec une taille de pore de trois micromètres dans les troisième et quatrième puits. Dans le premier puits, ajoutez 0,1 millilitre de cellules dendritiques infectées surchargées. Dans le deuxième puits, ajoutez 0,1 millilitre de cellules dendritiques infectées non chargées.Ajouter 0,1 millilitre de cellules dendritiques infectées surchargées dans un puits, et 0,1 millilitre de cellules dendritiques infectées non chargées dans l'autre puits. Enfin, comme contrôle négatif, infecter directement le cinquième puits de cellules T CD4+ à un MOI de 10. Ensuite, ajuster le volume total du puits à 0,6 millilitre avec du RPMI.Incuber la plaque pendant 30 minutes pour permettre la formation des synapses immunitaires. Après l'incubation, ajouter 100 microgrammes de gentamicine par millilitre de milieu dans chaque puits, puis incuber pendant une heure. La gentamicine est un antibiotique aminoglycoside qui ne peut pas pénétrer les cellules eucaryotes.Par conséquent, à cette étape, l'aminoside tuera les bactéries extracellulaires mais pas les bactéries intracellulaires. Après l'incubation, recueillir les cellules non adhérentes dans des tubes de 15 millilitres et les resuspendre dans 10 millilitres de tampon PBS BSA EDTA. Jeter la plaque de culture en plastique à laquelle la majorité des cellules dendritiques restent attachées.Ensuite, vortexer doucement les tubes pour assurer la désagrégation des cellules. Centrifuger les tubes à 600 x g. Puis, à partir de n'importe quel tube, prélever par aspiration 500 microlitres du surnageant cellulaire et le transférer à l’aide d’une pipette dans un nouveau tube.Ceci sera utilisé comme témoin pour démontrer que le traitement à la gentamicine a été efficace. Placer tous les échantillons sur de la glace. À cette étape, il y a six tubes : quatre tubes d'échantillons test et deux témoins.Bien que la plupart des cellules dendritiques aient été éliminées avec la plaque, les échantillons qui n'ont pas été séparés par les barrières de transwell pourraient encore en contenir. Afin de réduire la contamination, utilisez une isolation cellulaire magnétique ou un tri cellulaire pour ré-isoler les cellules T CD4+ à partir des échantillons qui n'ont pas été séparés par des barrières de transwell. L'isolat final devrait contenir moins de 2 % de cellules dendritiques.Gardez le reste des échantillons sur glace. Une fois les cellules T CD4+ purifiées, il est temps de procéder à la sauvegarde en vue d'une infection par des bactéries de classe. Cette étape peut être réalisée par dénombrement des colonies ou par cytométrie en flux.Ici, nous allons vous montrer comment effectuer le dénombrement des colonies. Lavez les cellules T CD4+ transinfectées deux fois avec du PBS. Effectuez une centrifugation à 600 x g entre chaque lavage.Ensuite, comptez les cellules et resuspendez-les dans du PBS à une concentration de deux fois 10 à la puissance six cellules par millilitre. À 500 microlitres de lymphocytes T, ajoutez 500 microlitres de Triton X-100 à 0,1 % pour les lyser. Ceci libère les bactéries intracellulaires des lymphocytes T.Pour chaque échantillon de cellules lysées, préparez trois dilutions sérielles. Ensuite, divisez une plaque d'agar LB en quatre quadrants et étalez 50 microlitres de chaque dilution, y compris la suspension non diluée, sur chaque section de la plaque. Sur une plaque d'agar LB distincte, étalez le surnageant cellulaire conservé comme témoin de l'efficacité de la gentamicine.Ensuite, sur une autre plaque, étaler les lymphocytes T directement infectés comme contrôle supplémentaire. Incuber toute la nuit. Le jour suivant, compter les colonies dans chaque secteur de la plaque et calculer le nombre d'unités formant colonies pour chaque échantillon.Si une contamination par des cellules dendritiques de faible niveau survient, définie comme inférieure à 2 %, soustrayez les unités formant des colonies correspondant à une faible contamination par les cellules dendritiques. La transinfection des lymphocytes T a été réalisée à l'aide de Salmonella enteritidis et quantifiée par le test de survie à la gentamicine, tel que décrit dans cette vidéo. Lorsque les lymphocytes T infectés directement ont été ensemencés, comme indiqué à gauche, aucune croissance de colonies n'a été observée, ce qui indique que les lymphocytes T sont réfractaires aux infections bactériennes directes.Lorsque le surnageant provenant des essais de transinfection a été ensemencé, comme indiqué à droite, aucune colonie n'a été observée, ce qui indique que la gentamicine a correctement fonctionné. Les résultats des essais de transinfection réalisés en présence de barrières transwell sont présentés ici. Seules trois colonies sont observées dans la suspension non diluée provenant à la fois des échantillons chargés en OVA et de ceux non chargés.En revanche, de nombreuses colonies sont observées lorsqu'il y a un contact direct entre les lymphocytes T et les cellules dendritiques infectées. De plus, lorsque des cellules dendritiques chargées avec OVAp ont été incubées avec des lymphocytes T, l'absorption des bactéries a augmenté d'environ cinq fois. Dans leur ensemble, ces données indiquent qu'un contact direct entre les cellules dendritiques infectées et les lymphocytes T facilite l'absorption bactérienne et que la transinfection cellulaire est renforcée lors de la reconnaissance de l'antigène.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de quantifier la transinfection à l’aide de cellules T marines. L’avantage de la quantification de la transinfection par le test de survie au gentamicine réside dans sa grande sensibilité. Nous sommes en mesure de détecter une seule bactérie infectante.Il est important de se rappeler que l'étape de purification de cette procédure est cruciale. La pureté doit être très élevée si l'on utilise le nombre de colonies pour déterminer le taux de transinfection. La quantification par cytométrie en flux ne présente pas cette limitation, car on peut facilement distinguer les cellules dendritiques et les lymphocytes T, mais elle implique que les bactéries exprimant la GFP soient suffisamment fluorescentes pour détecter les cellules infectées malgré le bruit de fond de fluorescence externe.N'oubliez pas que le travail avec des agents pathogènes peut être extrêmement dangereux et que les précautions de sécurité appropriées doivent toujours être prises lors de l'exécution de cette procédure.

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Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Le cloisonnement des protéines soit au sein de la membrane plasmique ou dans des endroits intracellulaires est un mécanisme de régulation qui peuvent grandement influencer les résultats de signalisation, d'où, à comprendre la signalisation, il est important d'étudier le comportement spatial et temporel des protéines impliquées. Nous décrivons ici un système de microscopie TIRF base pour étudier la transduction du signal dans les cellules T, mais est largement applicable.

Une technique de microscopie TIRF en temps réel, imagerie simultanée du TCR et de ses associés protéines de signalisation

Source : Cruz-Adalia, A., et al. Les lymphocytes T capturent les bactéries par transinfection à partir de cellules dendritiques. J. Vis. Exp. (2016).Cette vidéo démontre la transinfection bactérienne par le biais d’interactions entre les lymphocytes T et les cellules dendritiques spécifiques de l’antigène. Les cellules dendritiques infectées par des bactéries présentant un peptide d’ovalbumine sont incubées avec des lymphocytes T, soit directement, soit séparés par une membrane. Le contact...

Transinfection bactérienne in vitro des lymphocytes T par formation de synapses immunologiques

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L&#39;évaluation de l&#39;Innate détection du VIH-1 CD4 infectés<sup&gt; +</sup&gt; Cellules T par les cellules dendritiques plasmacytoïdes Utilisation d&#39;un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Système de co-culture.

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Cellules T Capturez bactéries par Transinfection de cellules dendritiques

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