Irritation des yeux Test (IET) pour l'identification des dangers des produits chimiques irritants oculaires utilisant épithélial (RHCE) Tissue modèle reconstruit humain Cornea-like

L’objectif général du test d’irritation oculaire est de classer et d’étiqueter les substances et les mélanges en fonction de leur potentiel d’irritation oculaire. Cette procédure utilise un modèle de tissu de type cornée reconstruit en trois dimensions. À l’arrivée, le kit de test est pré-incubé pendant la nuit dans le milieu de test le lendemain, les tissus sont hydratés, suivis de l’application topique des témoins positifs et négatifs et des produits chimiques d’essai d’intérêt sur les surfaces des tissus en double.

Après une période d’exposition déterminée, les produits chimiques d’essai sont éliminés par lavage. Les tissus sont post-incubés dans un milieu d’essai frais et la toxicité des produits chimiques est ensuite évaluée par un test MTT. En fin de compte, le potentiel irritant des articles d’essai peut être évalué en comparant la viabilité relative des tissus traités par l’article d’essai à celle des tissus traités par un témoin négatif.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les tests rapides d’irritation à l’état de traces, est qu’elle n’implique pas d’animaux de laboratoire. Il utilise in vitro un modèle de tissu cornal déconstruit comme le cornal, qui comprend des cellules humaines normales. Il s’applique à tous les types de substances et de mélanges et peut faire la distinction entre les produits chimiques qui induisent une irritation oculaire ou des lésions oculaires graves dues à des matériaux.

Non irritants qui ne nécessitent pas de classification et d’étiquetage. La cornée humaine reconstruite comme le tissu épithélial ou epi. L’oculaire est préparé dans des inserts avec une membrane poreuse à travers laquelle les nutriments sont passés aux cellules.

Le tissu reconstruit forme un épithélium non kératinisé qui modélise l’épithélium de la cornée avec des cellules progressivement stratifiées mais non cornifiées. À la réception du kit épithélial de type cornée humaine, équilibrez les tissus dans le conteneur d’expédition à 24 puits à température ambiante Après 15 minutes, ouvrez le sac contenant la plaque de tissu à 24 puits dans des conditions stériles et inspectez tous les tissus pour détecter la présence de bulles d’air entre le gel agros et les inserts. Couper. Ouvrez la bande.

Retirez le couvercle avec une gaze stérile et inspectez la surface du tissu. Ensuite, aliquote un millilitre de milieu de dosage du kit à 37 degrés Celsius dans les puits de six plaques de puits pré-étiquetées. Ensuite, à l’aide d’une pince stérile, épongez doucement le tissu contenant des inserts sur de la gaze stérile pour enlever tous les aros d’expédition restants et placez-les dans des puits individuels des six plaques de puits.

Au bout d’une heure, remplacez le milieu par un millilitre de milieu de test frais à 37 degrés Celsius et incubez les tissus dans des conditions de culture standard pendant la nuit. Le lendemain, j’ai tapoté 20 microlitres de DPBS sans calcium ni magnésium sur la surface apicale de chaque tissu. Si le DPBS ne se propage pas sur les tissus, tenez doucement l’insert avec une pince et tapotez sur la plaque pour vous assurer que la solution saline mouille toute la surface du tissu.

Incuber les assiettes pendant 30 minutes. Ensuite, pour traiter les tissus avec des articles de test liquides, appliquez 50 microlitres du contrôle négatif, du contrôle positif et des articles de test appropriés en double exemplaire selon le calendrier. Veillez à ce que les traitements couvrent toutes les surfaces des tissus, puis incubez les inserts pendant 30 minutes pour traiter les tissus avec des articles de test solides.

Tout d’abord, transférez les inserts sur une surface stérile. Gardez la plaque couverte pour éviter la contamination par des particules solides en suspension dans l’air. Ensuite, à l’aide d’une cuillère nivelée, appliquez localement 50 milligrammes de l’article de test sur les tissus dupliqués selon le calendrier, en veillant à ce que le traitement couvre toute la surface du tissu.

Vous pouvez également utiliser une seringue préremplie d’un millilitre avec la tête coupée. Pour placer les poudres directement sur la culture. Appuyez sur le piston pour appliquer la poudre immédiatement après l’application des articles d’essai solides, remettez les inserts dans leurs plaques à six puits et incubez les tissus pendant six heures pour rincer les tissus.

Après le traitement, remplir 3 béchers de 150 millilitres par article d’essai avec 100 millilitres de DPBS à la fin de l’incubation d’exposition. Saisissez le bord supérieur des inserts à l’aide d’une pince incurvée pour les retirer des puits. Ensuite, à l’aide d’une pince, prélevez deux inserts du même traitement par leurs bords supérieurs et décantez les traitements sur un matériau absorbant propre.

Ensuite, trempez les inserts dans le premier bécher de DPBS en lavant les tissus avec un mouvement circulaire tourbillonnant pendant deux secondes. Soulevez ensuite les inserts de manière à ce qu’ils soient principalement remplis de DPBS et transvasez le liquide dans le bécher. Répétez le lavage deux fois dans le premier bécher.

Rincez ensuite les inserts des deuxième et troisième béchers de DPB S3 plusieurs fois chacun de la même manière après le dernier lavage. Faites pivoter chaque insert à un angle d’environ 45 degrés avec l’extrémité ouverte vers le bas et touchez la lèvre supérieure au matériau absorbant pour décanter les DPBS restants. Ensuite, plongez immédiatement les tissus dans cinq millilitres de milieu de dosage à température ambiante.

Dans une plaque à 12 puits pré-étiquetée à la fin de la période d’immersion post-trempage, décantez le milieu de dosage et épongez les inserts sur un matériau absorbant. Transférez ensuite les inserts dans une nouvelle plaque à six puits contenant un millilitre de milieu d’essai chaud par puits, et placez les plaques dans l’incubateur pour commencer l’essai de viabilité MTT. Transférez les inserts dans une plaque à 24 puits contenant 0,3 millilitre de solution MTT fraîchement préparée.

Tamponnez les inserts sur le matériau absorbant avant le transfert. Relâchez toutes les bulles d’air emprisonnées sous les inserts et retournez les tissus dans l’incubateur après trois heures, placez le fond des inserts sur le matériau absorbant. Ensuite, pour l’extraction submergée d’articles d’essai liquides non colorants, immergez les inserts dans une plaque pré-étiquetée à 24 puits contenant deux millilitres de la solution d’extraction appropriée par puits pour une extraction non immergée de colorants solides ou liquides.

Transférez les inserts dans une plaque pré-étiquetée à six puits contenant un millilitre de solution d’extraction par puits. Scellez ensuite les plaques avec une thermosoudeuse ou une paraforme pour inhiber l’évaporation et extrayez sur un agitateur orbital pendant deux à trois heures à température ambiante avec une légère agitation à la fin de l’extraction immergée. Percez les tissus, puis transvasez le liquide à l’intérieur de chaque insert dans le, puis jetez les inserts avec les tissus.

Mélangez la solution d’extrait dans chaque puits et transférez deux aliquotes de 200 microlitres de chaque échantillon dans les puits appropriés d’une plaque pré-étiquetée à 96 puits, comme illustré dans le schéma à la fin de l’extraction non immergée. Jetez les inserts et les mouchoirs sans les percer et ajoutez un millilitre de solution d’extraction à chacun. Mélangez bien la solution d’extraction dans les puits et transférez deux aliquotes de 200 microlitres de chaque échantillon dans les puits appropriés d’une plaque pré-étiquetée de 96 puits, comme nous venons de le démontrer.

Enfin, lisez la densité optique des échantillons dans un spectrophotomètre à 96 puits à une longueur d’onde de 570 nanomètres sans utiliser de filtre de référence et entrez les résultats dans une feuille de calcul pour calculer les passifs tissulaires respectifs. Tenez compte des corrections dues à l’interférence chimique du test, comme indiqué dans le protocole textuel ici, les résultats représentatifs des tests d’irritation oculaire effectués avec 10 articles de test et les témoins négatifs et positifs sont présentés dans cette expérience. Une densité optique moyenne de 1,31 pour le témoin négatif correspondant à une viabilité tissulaire de 100 % a été observée, avec une viabilité tissulaire relative de 31,2 %Pour le témoin positif, les articles 1, 2, 4, 7 et huit ont présenté des variabilités tissulaires supérieures à 60 %, classant ces articles comme non irritants (articles d’essai 3, 5, 6, 9 et 10).

D’autre part, ils présentaient des variabilités tissulaires inférieures ou égales à 60 %, ce qui a entraîné leur classification comme irritants. La différence de viabilité tissulaire entre les tissus dupliqués dans cette expérience était inférieure à 20 % pour tous les articles testés, à l’exception de l’article d’essai deux. Par conséquent, les résultats de tous les articles d’essai, à l’exception de l’article d’essai deux, ont été considérés comme admissibles, car ils satisfaisaient à tous les critères d’acceptation de l’essai d’irritation oculaire.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon dont il devrait effectuer le test de DICATION, en utilisant in vitro reconstructeur de cornéenne humaine comme le modèle de tissu quatre, l’étiquetage d’identification des dangers du produit chimique. Cette procédure a été mise en œuvre dans les directives de test EOC D dans le cadre de la stratégie de test de niveau.