Détermination de oxydation des acides gras et de la lipogenèse dans les hépatocytes primaires de souris

L'objectif général de cette procédure est d'évaluer le métabolisme des acides gras dans des hépatocytes primaires de souris. Cela est réalisé en perfusant d'abord le foie d'une souris avec un milieu de digestion, en l'excisant, puis en isolant les hépatocytes. La deuxième étape consiste à cultiver les hépatocytes sur des plaques revêtues de collagène.

Ensuite, les hépatocytes sont traités avec les interventions expérimentales à tester. La dernière étape consiste à incuber les cellules en présence d'un substrat marqué radioactivement. Enfin, une analyse par scintillation liquide est utilisée pour montrer les effets de diverses interventions pharmacologiques ou génétiques sur l'oxydation des acides gras ou la lipogenèse dans les hépatocytes primaires.

Cette méthode peut aider à répondre à plusieurs questions clés dans le domaine du métabolisme et du diabète, notamment comment des interventions pharmacologiques et génétiques spécifiques affectent la biologie des hépatocytes. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle pour deux raisons. Premièrement, il est difficile d'obtenir des conditions de perfusion spécifiques qui influencent la santé des hépatocytes, et deuxièmement, la quantification du dioxyde de carbone libéré.

Le gaz n'est pas intuitif. Cette procédure sera démontrée par Tom Akey, étudiant diplômé de mon laboratoire. Installez la pompe péristaltique en plaçant une extrémité d'un tube stérile dans le milieu de perfusion préchauffé du foie, et l'autre extrémité dans un récipient de déchets.

Faites fonctionner la pompe jusqu'à ce que toute la longueur du tube soit remplie de milieu. Après l'euthanasie d'une souris d'intérêt, vaporisez abondamment l'abdomen de la souris avec de l'éthanol à 70 %. Utilisez ensuite des ciseaux à extrémité émoussée pour pratiquer une incision médiane à travers le derme, sur toute la longueur de l'abdomen, puis écartez les bords latéralement.

Effectuez une incision similaire dans le péritoine afin d'exposer les viscères. À l’aide d’un instrument contondant, déplacez doucement les intestins. Pour exposer le système vasculaire abdominal, repérez la veine cave inférieure abdominale et placez un point de suture sous le vaisseau sanguin en aval de la veine rénale, en aval du point de suture.

Insérez une aiguille et un cathéter dans la veine cave inférieure et faites-les progresser au-delà du point de suture. Avec l'aiguille toujours en place, serrez le point de suture autour du cathéter pour le maintenir fixe, puis retirez soigneusement l'aiguille. Si l'opération est correctement réalisée, le sang s'écoulera à travers le cathéter à l'aide d'une pipette.

Remplissez la partie restante du cathéter avec le milieu de perfusion et assurez-vous qu'aucun air n'est présent. Ensuite, fixez avec beaucoup de précaution le tube au cathéter. Puis, percez soigneusement le diaphragme avec des ciseaux à pointe fine et pratiquez une incision latérale afin d'exposer la cavité pleurale.

En prenant soin d'éviter la vésicule biliaire et le réseau vasculaire pleural, placer une pince bulldog autour de la veine cave inférieure thoracique juste au-dessus de la veine hépatique. Ensuite, sectionner la veine porte et activer la pompe à un débit de trois à quatre millilitres par minute. Perfusionner le foie avec le milieu de perfusion hépatique pendant cinq minutes en utilisant environ 20 millilitres de milieu de perfusion.

Pendant ce temps, observez le changement de couleur immédiat du foie, passant du rouge à une teinte grisâtre. Si certaines parties du foie restent rouges, cela indique probablement une perfusion insuffisante et la probabilité de réussir l'isolement est fortement réduite. Après une perfusion de cinq minutes, arrêtez la pompe et transférez le tube vers le milieu de digestion du foie.

Redémarrez la pompe et perfusez le foie pendant encore 10 à 15 minutes, à raison de trois à quatre millilitres par minute, jusqu'à épuisement du milieu. À la fin de la perfusion, arrêtez la pompe.

Le foie doit présenter une teinte rosâtre et paraître quelque peu agrandi. À ce stade, exciser le foie par une dissection minutieuse. Transférer dans une boîte de culture tissulaire de 10 centimètres et retirer la vésicule biliaire.

Ensuite, ajoutez 10 millilitres de milieu de culture dans le foie, puis commencez à gratter délicatement le foie à l’aide d’un scalpel. Pour éliminer les hépatocytes, filtrez la suspension à l’aide d’un tamis cellulaire de 100 microns et transférez-la dans un tube conique de 50 millilitres. Rincez la plaque avec 10 millilitres supplémentaires de milieu de culture et aspirez le liquide dans le tube conique de 50 millilitres.

Ensuite, faire un culottage des cellules à quatre degrés Celsius par centrifugation pendant cinq minutes à 350 g, aspirer le milieu et resuspendre le culot cellulaire dans 10 millilitres de milieu de mise en culture. Ajouter ensuite 10 millilitres de silice colloïdale à 90 % revêtue de polyvinylpéroné en mélangeant doucement, puis faire un culottage des cellules comme précédemment. Après la centrifugation, aspirer la couche de cellules mortes flottant à la surface du mélange.

Ensuite, laver les cellules vivantes en culot deux fois avec 20 millilitres de milieu de mise en culture. Résuspendre le culot cellulaire final dans 10 millilitres de milieu de mise en culture et dénombrer les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Placer 90 000 cellules par puits dans des plaques de culture de 24 puits revêtues de collagène. Incuber les plaques à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux heures, de 16 à 20 heures avant de commencer le test.

Lavez les cellules deux fois avec du PBS tiède et placez les cellules dans un milieu sans sérum pour une privation de sérum, contenant 20 nanomoles de glucagon. Incubez les cellules toute la nuit à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone, le matin du dosage.

Préparer le milieu de pré-incubation, puis remplacer le milieu contenant le sérum par le milieu en absence de sérum. Utiliser le milieu de pré-incubation. Incuber les cellules dans ce mélange à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux heures durant l'incubation.

Sécher 0,5 microcurie par puits de palmitate C14 en évaporant le solvant éthanolique sous azote environ 15 minutes avant la fin de l'incubation ; resuspendre le palmitate C14 à raison de 12,5 microlitres par microcurie dans 0,1 N d'hydroxyde de sodium, puis incuber le mélange à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajouter ensuite trois volumes de milieu pré-incubé tiède et mélanger par aspiration et expulsion répétées à l'aide d'une pipette.

Ajouter 25 microlitres de mélange de palmitate C14 dilué dans chaque puits en agitant doucement la plaque, puis incuber à 37 degrés Celsius pendant 90 minutes. Il s'agit de la plaque de dosage. Pendant l'incubation, retirer le couvercle d'une plaque stérile de 24 puits et placer un morceau de papier filtre de deux centimètres sur deux centimètres au fond de chacun des puits. Ensuite, recouvrir la plaque d'une pièce de parafilm mesurant quatre pouces sur sept pouces à l'aide d'un objet rectangulaire de grande taille, tel qu'une boîte de pointes de micropipette.

Frottez le paraform sur les puits pour perforer le paraform au niveau des ouvertures des puits et créer un joint étanche sur le reste de la plaque. Ensuite, retirez les cercles perforés de parfum. Maintenant, 10 minutes avant la fin de l'incubation, ajoutez 200 microlitres de trois hydroxyde de sodium normal dans chaque puits de la plaque en papier filtre, en veillant à ce que le papier filtre absorbe tout le liquide.

À la fin de l'incubation, congeler rapidement la plaque d'essai dans l'azote liquide. Ensuite, ajouter 100 microlitres d'acide perchlorique à 70 % dans chaque puits de la plaque d'essai. Recouvrir immédiatement d'une plaque de papier filtre et placer les plaques sur un agitateur orbital.

Agiter les plaques à une vitesse orbitale de 80 tr/min pendant deux heures à température ambiante. Ensuite, mesurer la fraction de dioxyde de carbone en transférant les carrés de papier filtre dans quatre millilitres de liquide de scintillation placés dans des vials de scintillation, puis mesurer le signal en C14 à l’aide d’un compteur de scintillation afin de quantifier le matériau acide soluble. Transférer 400 microlitres de milieu dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre, centrifuger à vitesse maximale pendant 10 minutes, puis ajouter 100 microlitres du surnageant obtenu à 500 microlitres d’un mélange chloroforme-méthanol dans un rapport deux pour un.

Vortexez brièvement le mélange, puis ajoutez 250 microlitres d'eau au mélange et vortexez à nouveau. Centrifugez ensuite les échantillons pendant 10 minutes à mille g. Transférez ensuite 200 microlitres de la phase supérieure dans 4 millilitres de liquide de scintillation dans un flacon de scintillation, et mesurez le signal C14 après privation sérique des cellules. Changez le milieu des cellules pour un milieu de lipogenèse.

Ajouter les composés d'intérêt à tester, puis incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux heures après la période d'incubation. Laver les cellules deux fois avec du PBS avant de lyser les cellules en ajoutant 120 microlitres d'acide chlorhydrique 0,1 N. Pour chaque puits, racler les parois afin de libérer le lysat, puis prélever 100 microlitres du lysat à l’aide d’une pipette et les transférer dans un tube microfuge de 1,5 millilitre.

Ensuite, ajoutez 500 microlitres d'un mélange deux pour un de chloroforme et de méthanol dans chaque tube. Vortexez brièvement, puis incubez à température ambiante pendant cinq minutes. Après l'incubation, ajoutez 250 microlitres d'eau, vortexez, puis incubez l'échantillon pendant cinq minutes supplémentaires à température ambiante.

Ensuite, centrifuger les échantillons pendant 10 minutes à 3000 G. Transférer soigneusement la phase inférieure du liquide séparé dans quatre millilitres de fluide de scintillation liquide dans un flacon de scintillation, puis mesurer l'activité du tritium à l'aide d'un compteur de scintillation. Cette procédure permet généralement d'isoler de 10 à 30 millions d'hépatocytes par souris. Après une incubation nocturne, les cellules saines présentent une forme hexagonale, et beaucoup possèdent un noyau.

Les cultures non saines contiennent souvent des granulations ou des bourgeons, qui sont des signes de mort cellulaire. Les résultats d'un dosage de l'oxydation des acides gras sont présentés ici, où l'ajout du promoteur de la respiration cellulaire F-C-C-P-A et de l'oligomycine, un inhibiteur de la respiration, a été comparé à un témoin véhicule afin de mesurer l'oxydation complète. Le rapport entre le dioxyde de carbone et le matériau soluble dans l'acide est calculé.

Les substances qui favorisent la respiration cellulaire, comme le FCCP, déplacent ce rapport vers le dioxyde de carbone, indiquant une oxydation accrue via le cycle de l'acide tricarboxylique. Les inhibiteurs de la chaîne respiratoire réduisent globalement l'oxydation lorsqu'ils sont mesurés. Pour les composés ayant une activité lipolytique, qui augmentent l'oxydation des acides gras comme le FCCP, ou qui diminuent la synthèse d'ATP, comme l'oligomycine, l'activité lipolytique est réduite dans les hépatocytes en culture par rapport aux témoins traités au véhicule. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de s'assurer que la perfusion s'effectue complètement et dans les délais appropriés après la sacrification de l'animal.

En outre, lors du dosage de l'oxydation des acides gras, la congélation complète du milieu est essentielle pour des mesures reproductibles du dioxyde de carbone gazeux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment isoler des hépatocytes primaires ainsi que comment utiliser ces cellules pour analyser l'oxydation des acides gras et la lipogenèse in vitro.