TRAP-rc, Translating ribosome Purification par affinité à partir de populations de cellules rares de

L'objectif général de cette procédure est d'isoler de l'ARN engagé dans la traduction de manière spécifique à un type cellulaire chez l'embryon de drosophile. Cela est réalisé en premier lieu en collectant des embryons provenant d'une lignée de drosophiles transgéniques, permettant une expression spécifique d'une sous-unité ribosomale marquée par GFP dans le type cellulaire ciblé, ici les cellules musculaires slouch. La deuxième étape consiste à préparer un lysat afin d'obtenir une préparation de polysomes contenant un mélange de ribosomes marqués et non marqués.

Ensuite, la concentration en protéines dans le lysat est estimée et une purification par affinité est réalisée à l’aide de billes couplées à des anticorps anti-GFP afin d’isoler les complexes ribosomaux d’ARN à partir du type cellulaire d’intérêt. La dernière étape est consacrée à l’extraction et à la purification de l’ARN. Enfin, des évaluations de qualité et de spécificité sont effectuées respectivement à l’aide d’un bioanalyseur et de la RT-qPCR.

L'ARN peut ensuite être utilisé pour une analyse quantitative globale par séquençage de l'ARN ou par puces à ADN. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes, comme le tri VX, est qu'elle ne nécessite pas une étape laborieuseuse de dissociation cellulaire. Elle peut être réalisée sur la paillasse.

C'est rapide et permet l'identification directe des ARN traduits dans une population très restreinte de cellules, ce qui constitue un avantage considérable pour comprendre l'acquisition des propriétés cellulaires. Même si cette méthode peut fournir des informations sur la myogenèse dans l'embryon de Josephine, elle peut également être appliquée à d'autres tissus ou organismes modernes, tels que les plantes, les zèbres, les poissons ou les souris, et pourrait aussi aider à suivre l'impact d'un traitement sur la synthèse des protéines en cas de pathologie. La démonstration de la procédure sera assurée par Benjamin Berta, un étudiant en doctorat de mon laboratoire. Après la conception, selon les instructions de la partie écrite du protocole, de deux lignées transgéniques et leur croisement pour créer la lignée transgénique double porteuse du piège, amplifier la lignée en préparant d'abord huit grandes cages cylindriques contenant environ 40 grammes de mouches jeunes par cage, ce qui correspond à environ 180 000 mouches par cage.

Préparez des boîtes de Pétri de 11 centimètres de diamètre contenant un mélange d'agar solidifié et de jus de raisin, avec un tiers de la surface recouvert de pâte de levure fraîchement préparée, et laissez les mouches pondre leurs œufs sur ces boîtes pendant une heure. Répétez ce processus sur deux autres séries de boîtes fraîches au jus de raisin afin de permettre aux mouches d'épuiser complètement leurs ucts. Les embryons doubles transgéniques souhaités issus du croisement seront pondus sur la quatrième boîte.

Retirer les plaques contenant les embryons souhaités des cages et les laisser incuber jusqu’au stade de développement désiré à température ambiante. Une incubation de 13 heures est utilisée ici. Ensuite, resuspendre le contenu de la plaque avec environ 50 millilitres d’eau à l’aide d’un pinceau.

Séparer les embryons des mouches mortes en faisant passer le liquide à travers trois tamis de 700, 355 et 112 microns de diamètre. Rincer les embryons recueillis dans le tamis de plus petit diamètre avec de l'eau ionisée. Enrober les embryons d'une solution d'eau de Javel à 4,5 % dans l'eau ionisée pendant deux minutes, puis rincer soigneusement avec de l'eau ionisée pendant 30 à 60 secondes.

Incuber les embryons dans du PBS contenant 0,01 % de T à raison de 20 à 100 microgrammes par millilitre. Traiter avec du Cyclo heide pendant cinq à dix minutes à température ambiante sous agitation. Après avoir séché les embryons sur des feuilles absorbantes en cellulose, les transférer dans des tubes de microcentrifugation, puis peser les tubes et congeler rapidement les embryons par immersion dans de l'azote liquide.

Dans cette étape, les embryons séchés peuvent être stockés pendant plusieurs mois à moins 80 degrés Celsius. Transférez 1,5 gramme des embryons séchés dans des tubes de 15 millilitres prérefroidis, contenant quatre millilitres de tampon d'extraction des polysomes, et homogénéisez à l'aide d'une pipette sérologique stérile de 10 millilitres.

Ensuite, répartir les embryons homogénéisés dans deux tubes prérefroidis de deux millilitres et broyer les embryons dans un broyeur à billes rapide multidirectionnel. Régler l'appareil pour deux cycles de 10 secondes à 5 000 tr/min, avec une pause de 15 secondes entre chaque cycle. Après 10 minutes de centrifugation à 2000 G, transférer le lysat dans un nouveau tube de microcentrifugation prérefroidi placé sur de la glace.

Ajouter 10 % de Nonidet P40 au surnageant S pour obtenir une concentration finale de 0,1 %, puis mélanger délicatement en retournant le tube. Ajouter du DHPC à 300 micromolaire pour obtenir une concentration finale de 30 millimolaire, puis mélanger délicatement en retournant le tube. Incuber une minute sur glace, en mélangeant par retournement plusieurs fois pendant l'incubation.

Après l'incubation sur glace, préparez le surnageant post-mitochondrial par centrifugation à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 20 000 G. Après avoir mesuré la concentration en protéines par la méthode de Bradford et obtenu une concentration en protéines comprise entre 60 et 80 milligrammes par millilitre, transférez le SNAT dans un tube de microcentrifugeuse frais prérefroidi et passez immédiatement à l'étape de préabsorption. Resuspendez les billes magnétiques par agitation douce, puis transférez 30 microlitres de billes pour chaque millilitre de lysat dans un tube de microcentrifugeuse.

Placer les billes sur l'aimant, pipeter le surnageant et resuspendre les billes dans 500 microlitres de tampon d'extraction des polysomes. Ensuite, placer à nouveau les billes sur l'aimant. Ajouter ensuite le lysat embryonnaire et incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius sur un agitateur rotatif.

Retirez les billes et placez l'agent surnageant sur de la glace jusqu'à l'étape de purification immunoaffine. En conservant 100 microlitres du surnageant comme échantillon global d'ARN à comparer avec l'échantillon recueilli après la purification immunoaffine, ajoutez un millilitre de lysat pré-absorbé dans un tube exempt d'ARN contenant 90 microlitres de billes bloquées couplées à un anticorps anti-GFP. Incubez l'échantillon à quatre degrés Celsius pendant deux heures ou toute la nuit, avec un mélange doux par retournement dans un rotateur de tubes après l'incubation.

Lavez les billes en centrifugeant d'abord les billes restantes dans une mini-centrifugeuse. Ensuite, récupérez-les sur un aimant, resuspendez-les dans 500 microlitres de tampon de lavage et incubez-les en agitant pendant 10 minutes dans la chambre froide, puis récupérez à nouveau les billes sur l'aimant.

Transférez les billes dans un nouveau tube exempt d'ARN pré-shield et lavez-les deux fois supplémentaires. Enfin, après avoir récupéré les billes sur l'aimant, procédez à l'extraction d'ARN en ajoutant un millilitre de TRIOL aux billes et en effectuant l'extraction conformément aux instructions du fabricant. Suivez cette étape par une purification de l'ARN, en utilisant un kit RNEZ micro selon les instructions du fabricant.

Pour tester la spécificité de l'ARN piégé, réalisez une transcription inverse à partir de trois nanogrammes d'ARN immunopurifié et d'ARN témoin selon les procédures standard. Ensuite, utilisez l'ADNc obtenu pour une PCR quantitative avec des jeux d'amorces spécifiques au gène. Cette image confocale d'un embryon au stade 16 montre l'expression de RPL 10 A-E-G-F-P, spécifiquement dans les six cellules musculaires slouch de chaque segment HEMI ; une colocalisation de RPL 10 A-E-G-F-P avec le marqueur général des muscles, la bêta-tubuline 3, est observée.

L'ARN piégé a été analysé sur un bioanalyseur à des fins de contrôle de qualité. Remarquez l'intégrité parfaite des ARN ribosomiques 18S et 28S. Cette figure présente les résultats d'une analyse de RT-qPCR réalisée sur trois réplicats biologiques d'embryons au stade 16, et démontre la haute spécificité de l'ARNm isolé par piégeage.

La variation de la méthylation a été calculée par rapport à l'entrée et normalisée par rapport au gène RPL32. Deux transcrits présents dans toutes les lignées musculaires sont enrichis de 2,3 fois par rapport à l'entrée, tandis que les transcrits plus restreints de slouch sont enrichis de 5,6 fois, et les cellules neuronales exprimant prospero et socks ainsi que les gènes sont appauvris respectivement de 2,2 fois et de 5,5 fois après leur développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs, en particulier dans le domaine de la biologie du développement, pour explorer l'engagement autonome et l'acquisition de propriétés cellulaires au cours de la différenciation des embryons doof.