TRAP-rc, Translating ribosome Purification par affinité à partir de populations de cellules rares de Drosophila Embryons

L’objectif global de cette procédure est d’isoler l’ARN engagé dans la traduction d’une manière spécifique à un type cellulaire dans des embryons de drosophile. Ceci est accompli en collectant d’abord des embryons d’une lignée de mouche transgénique, permettant l’expression spécifique de la sous-unité ribosomique marquée A GFP dans le type de cellule ciblé, dans ce cas, les cellules musculaires lâches. La deuxième étape consiste à générer un lysat pour obtenir une préparation de polysomes contenant un mélange de ribosomes marqués et non marqués.

Ensuite, la concentration en protéines dans le lysat est estimée et la purification d’affinité est effectuée avec des billes couplées à des anticorps GFP pour capturer les complexes d’ARN des ribosomes du type de cellule d’intérêt. L’étape finale est dédiée au triol, à l’ARN, à l’extraction et à la purification. En fin de compte, les évaluations de la qualité et de la spécificité sont effectuées à l’aide d’un bioanalyseur et d’un R-T-Q-P-C-R respectivement.

L’ARN peut ensuite être utilisé pour une analyse quantitative globale par séquençage d’ARN ou par puces à ADN. Le principal avantage de cette technique par rapport à notre méthode existante, comme le tri VX, est qu’elle ne nécessite pas d’étape labo de dissociation cellulaire. Il peut être effectué sur le banc.

Il est rapide et permet l’identification directe de l’ARN traduit dans une très petite population de cellules, ce qui est un avantage mesurable pour la compréhension de l’acquisition des propriétés cellulaires. Même si cette méthode peut donner un aperçu de la myogenèse chez l’embryon de Joséphine, elle peut également être appliquée à d’autres tissus ou organismes modernes, tels que la plante, le zèbre, le poisson ou la souris, et pourrait également aider suite à l’impact du traitement sur la synthèse des protéines en cas de pathologie. La démonstration de la procédure sera faite par Benjamin Berta, un doctorant de mon laboratoire. Après l’ingénierie, les deux lignées transgéniques selon les instructions de la partie écrite du protocole et le croisement pour créer le piège double croisement de la ligne transgénique, amplifient la ligne en préparant d’abord huit grandes cages de population cylindriques contenant environ 40 grammes de jeunes mouches par cage, ce qui correspond à environ 180 000 mouches par cage.

Préparez des boîtes de Pétri de 11 centimètres de diamètre contenant un mélange d’agar solidifié et de jus de raisin avec un tiers de la surface recouvert de pâte de levure fraîchement préparée, et laissez les mouches pondre des œufs sur ces plaques pendant une heure. Répétez ce processus sur deux autres séries d’assiettes de jus de raisin frais pour permettre aux mouches de vider complètement leurs ucts. Les embryons doubles transgéniques souhaités issus du croisement seront déposés sur la quatrième plaque.

Retirez les plaques contenant les embryons souhaités des cages et laissez-les incuber jusqu’au stade de développement souhaité à température ambiante. Une incubation de 13 heures est utilisée ici. Ensuite, mettez le contenu de la plaque en suspension avec environ 50 millilitres d’eau à l’aide d’un pinceau.

Séparez les embryons des mouches mortes en passant le liquide à travers trois tamis de 700, 355 et 112 microns de diamètre. Rincez les embryons collectés dans le tamis de plus petit diamètre avec de l’eau ionisée. Enrobez les embryons dans 4,5 % d’eau de Javel dans l’eau ionisée pendant deux minutes, puis rincez abondamment avec de l’eau ionisée pendant 30 à 60 secondes.

Incuber les embryons dans du PBS 0,01 % T entre 20 et 100 microgrammes par millilitre. Cyclo heide pendant cinq à 10 minutes à température ambiante avec agitation. Après avoir séché les embryons sur des feuilles absorbantes de cellulose, transférez-les dans des micro-tubes à centrifuger, puis pesez les tubes et flashez, congelez les embryons par immersion dans de l’azote liquide.

À ce stade, les embryons séchés peuvent être conservés pendant plusieurs mois à moins 80 degrés Celsius. Tendance : transférez 1,5 gramme des embryons séchés dans des tubes pré-refroidis de 15 millilitres, contenant quatre millilitres d’extraction de polysomes, tampons et homogénéisés. À l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 millilitres.

Ensuite, étalez les embryons homogénéisés dans deux tubes de pré-refroidissement de deux millilitres et broyez les embryons dans un broyeur à billes multidirectionnel à vitesse rapide. Réglé pour fonctionner deux fois pendant 10 secondes à 5 000 tr/min avec une pause de 15 secondes entre chaque cycle. Après 10 minutes de centrifugation à 2000 G, transférez le lysat dans un micro-tube de centrifugation frais et pré-réfrigéré sur de la glace.

Ajouter 10 % de non P 40 au surnageant S jusqu’à une concentration finale de 0,1 % et mélanger doucement en inversant le tube. Ajoutez 300 micromolaires de DHPC à une concentration finale de 30 millimolaires et mélangez doucement en inversant le tube. Incuber le mélange sur de la glace pendant cinq minutes, en mélangeant par inversion plusieurs fois pendant l’incubation.

Après l’incubation dans la glace. Préparez le supinat post-mitochondrial par centrifugation à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 20 000 G.Après avoir mesuré la concentration en protéines par la méthode de Bradford et obtenu une concentration en protéines comprise entre 60 et 80 milligrammes par millilitre, transférez le SNAT dans un microtube à centrifuger frais et pré-réfrigéré et passez immédiatement à l’étape de pré-absorption. Remettez les billes magnétiques en suspension avec une légère agitation, puis transférez 30 microlitres de billes pour chaque millilitre de lysat dans un microtube à centrifuger.

Récupérez les billes sur l’aimant, pipetez le filet et remettez en suspension les billes et 500 microlitres de tampon d’extraction de polysomes. Ensuite, collectez les perles sur l’aimant. Encore une fois, ajoutez l’embryonnaire, le lysat et incubez pendant une heure à quatre degrés Celsius sur un rotateur.

Retirez les billes et placez l’agent sur le décubitus dorsal sur de la glace jusqu’à l’étape d’immuno-épuration. En réservant 100 microlitres de supinate comme échantillon global d’ARN pour comparaison avec l’échantillon collecté après immuno-épuration de l’échantillon, ajoutez un millilitre de lysat pré-absorbé à un tube libre d’ARN contenant 90 microlitres de billes bloquées couplées à l’anticorps GFP. Incuber l’échantillon à quatre degrés Celsius pendant deux heures ou toute la nuit en le mélangeant doucement de bout en bout dans un rotateur de tube après l’incubation.

Lavez les perles en faisant d’abord tourner les perles restantes dans une mini centrifugeuse. Ensuite, recueillir sur un aimant, remettre en suspension dans 500 microlitres de lavage, tamponner et incuber par et encore. Terminez le mélange 10 minutes dans la chambre froide et à nouveau, récupérez les billes sur l’aimant.

Transférez les billes dans un tube frais sans ARN R pré-bouclier et lavez deux fois de plus. Enfin, après avoir recueilli les billes sur l’aimant, procédez à l’extraction de l’ARN en ajoutant un millilitre de TRIOL aux billes et en effectuant l’extraction selon les instructions du fabricant. Poursuivez par un nettoyage de l’ARN, à l’aide d’un micro-kit RNEZ selon les instructions du fabricant.

Pour tester la spécificité de l’ARN piégé, effectuez une transcription inverse sur trois nanogrammes d’ARN immuno-purifié et d’entrée selon des procédures standard. Utilisez ensuite l’ARNC obtenu pour la QPCR avec des ensembles d’amorces spécifiques au gène. Cette image confocale d’un embryon de stade 16 montre l’expression de RPL 10 A-E-G-F-P, en particulier dans les six cellules musculaires molles de chaque segment HEMI, la colocalisation de RPL 10 A-E-G-F-P avec le marqueur musculaire général bêta trois tubuline est observée.

L’ARN piégé a été analysé sur un bioanalyseur à des fins de contrôle de la qualité. Notez la parfaite intégrité des ARN ribosomiques un huit s et deux huit s. Cette figure montre les résultats d’une analyse RT QPCR sur trois réplicats biologiques d’embryons de stade 16, et démontre la grande spécificité de l’ARNm isolé par piège.

variation du FO a été calculée par rapport à l’entrée et normalisée par rapport au gène RPL 32 méthamphétamine. Deux transcrits présents dans toutes les lignées musculaires sont 2,3 fois enrichis par rapport à l’entrée, tandis que les transcrits plus restreints sont des cellules neurales 5,6 fois enrichies exprimant prospero et socks et les gènes sont respectivement 2,2 fois et 5,5 fois après son développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs, en particulier dans le domaine de la biologie du développement, pour explorer l’engagement d’auto-assistance et l’acquisition de propriétés cellulaires lors de la différenciation d’embryons doof.