Name: TRAP-rc, Translating ribosome Purification par affinité à partir de populations de cellules rares de Drosophila Embryons (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Découvrez la purification d'ARN traduit par affinité (TRAP) pour isoler l'ARNm de populations cellulaires rares dans les embryons de Drosophila. Cette méthode permet l'analyse spécifique de la traduction sans dissociation cellulaire.

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Les auteurs remercient Nicolas Allègre, Maud Peyny et Jean-Philippe Da Ponte pour leur excellente assistance technique. Ces travaux ont été soutenus par l’Agence Nationale de la Recherche (ANR-JC-CARDIAC-SPE), la bourse d’entrée de l’INSERM, la bourse ANR ID-CELL-SPE, l’Equipe FRM et la bourse AFM 15845.

1. Fly Generation Ligne <ol><li> Générer deux constructions différentes. Dans la première construction, RpL10A ADNc (ribosomal sous-unité protéique L10a) est clone en aval de la GFP dans UPAEP-PL-GFP-Nter plasmide (version modifiée de 32). L&#39;utilisation d&#39;un promoteur de la lignée germinale permet un usage plus polyvalent de la lignée transgénique. Remarque: obtenir le deuxième construction en clonant la séquence de régulation dirigeant l&#39;expression tissu-spécifique du gène GAL4 en amont de mollesse (TF) à l&#39;aide pPTGAL4 plasmide. </li><li> Injecter séparément dans des plasmides w 1118 vol constructions et insérer dans le génome de la mouche par insertion d&#39;élément P (selon la procédure standard) 33. </li><li> Sélectionnez transformants afin de récupérer lignes de vol avec des constructions sur deux chromosomes différents. La ligne de TRAP finale est créée en combinant ces deux lignes (croix génétiques) afin d&#39;obtenir une ligne double transgénique stable. F0: W; Cyo, SAMU EGFP :: RpL10A; MKRS / TM6Bx W; Cyo / Scu; Slouch Gal4 / TM6B. F1: W; Cyo, SAMU EGFP :: RpL10A; Slouch Gal4 / TM6B. Massivement amplifier cette ligne et de recueillir les embryons souhaité mis en scène. </li></ol> 2. Embryon Collection <ol><li> Préparez 8 grandes cages de population cylindrique contenant environ 40 g de jeunes mouches par cage (environ 180 000 mouches / cage). </li><li> Procéder à la soi-disant pré-Lays qui permettent mouches pour effacer embryons en développement de leurs trompes. Pour cela, jeter les mouches pendant 1 heure sur deux plats 11 cm de diamètre de Pétri contenant un mélange de solidifiée agar et le jus de raisin et couvrir ⅓ de la surface avec de la pâte de levure fraîchement faite. Après 3 échanges de raisin plaques de jus recueillent les véritables embryons sur des plaques fraîchement préparés similaires. NOTE: Le temps d&#39;incubation varie en fonction de développement fenêtre de temps étudiée. </li><li> Retirer les plaques de cages et de les laisser à la même température pendant le temps nécessaire pour obtenir le stade de développement correcte (par exemple, 3 h de ponte + 10 h de suppional incubation donne embryons de stade 10-13 h après la ponte (AEL)). Reprendre le contenu de la plaque (embryons, la pâte de levure, mouches mortes) avec 50 ml d&#39;eau en utilisant une brosse. </li><li> Aller à travers une série de tamis (700 um, 355 um, 112 um) pour séparer les embryons de mouches mortes et autres parties du corps et de recueillir des embryons conservés sur le tamis plus petit diamètre, puis laver rapidement à l&#39;eau déminéralisée. Ne pas utiliser plus de 18 plaques par la collecte comme il peut obstruer les tamis. </li><li> Embryons Dechorionate à 4,5% l&#39;eau de Javel dans l&#39;eau déminéralisée pour 2 min et rincer abondamment avec de l&#39;eau déminéralisée pendant 30-60 secondes. Incuber les embryons dans du PBS 0,01% de Tween 20, 100 pg / ml de cycloheximide, de 5 à 10 min à température ambiante sous agitation. </li><li> Embryons secs sur feuilles absorbantes de cellulose et de les transférer à des microtubes. Peser les tubes et flash-congeler les embryons par immersion dans l&#39;azote liquide. A ce stade, les embryons secs peuvent être conservés pendant plusieurs mois à -80 ° C. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Préparation de billes magnétiques couplées à la GFP Anticorps <ol><li> Bien remettre en suspension la protéine G billes magnétiques dans le flacon d&#39;origine par une agitation douce. </li><li> Transfert de 90 ul de billes à un tube RNase-free et les rassembler sur un aimant (30-60 sec). 90 ul de billes est nécessaire d&#39;effectuer une immunoprécipitation (IP) avec 1 ml de lysat contenant 60 à 80 mg / ml de protéines. Respecter les rapports pour éviter la saturation de perles. Utilisez plusieurs tubes selon quantité de protéine. </li><li> Laver les perles avec 1 × PBS 0,01% de Tween 20 (500 pi) et de recueillir des perles sur l&#39;aimant à éliminer le surnageant. Ajouter 30 pg d&#39;anticorps de la GFP dans 350 pi de PBS 0,01% de Tween 20 à incuber les billes et avec plus de lenteur extrémité extrémité mélange pendant 30 min à température ambiante. </li><li> Récupérer des billes sur l&#39;aimant (30 à 60 sec), éliminer le surnageant et rinçage dans 500 ul de tampon d&#39;extraction de polysomes (HEPES 10 mM, KCl 150 mM, MgCl2 5 mM, DTT 0,5 mM, Triton 1%, le cycloheximide 100 pg / ml , Pr1 × otease inhibiteur, inhibiteur de la RNase 100 U). </li><li> Récupérer des perles sur l&#39;aimant et ajouter 500 ul de tampon de blocage (BSA à 0,1 ug / ul d&#39;ARNt de levure, 0,1 pg / pl, glycogène 0,1 ug / ul dans du tampon d&#39;extraction de polysomes). </li><li> Incuber pendant 30 min à température ambiante et répéter cette étape une fois avec un tampon de blocage frais. </li><li> Recueillir des perles sur l&#39;aimant et rincer dans 500 pi de tampon d&#39;extraction de polysome, puis rappeler perles et de procéder immédiatement à l&#39;étape de immunopurification (article 6). </li></ol> 4. Préparation Lysate <ol><li> Avant de commencer, mettre en place le programme sur le multi-directionnel perles de vitesse rapide meuleuse: 2 × 10 sec à 5000 rpm, 15 secondes pause. Embryons de transferts secs (1,5 g) à tubes de 15 ml préalablement refroidi sur de la glace contenant un tampon d&#39;extraction polysome, et homogénéiser immédiatement. Homogénéiser 1,5 g d&#39;embryons dans 4 ml de tampon d&#39;extraction de polysomes. </li><li> Étaler homogénéisé embryons dans deux prérefroidi tubes 2 ml et broyer les EmbryOS en exécutant le programme d&#39;homogénéisation. Transférer le lysat dans des microtubes prérefroidi frais sur la glace et préparer un surnageant post-nucléaire par centrifugation à 4 ° C pendant 10 min à 2000 g. </li><li> Transférer le surnageant dans un tube à centrifuger prérefroidi frais sur la glace, ajouter 1/100 volume de 10% de Nonidet P-40 échantillon au surnageant (concentration finale = 0,1%), et mélanger doucement en inversant le tube. </li><li> Pulse-centrifuge l&#39;échantillon dans une Minifuge pour collecter le liquide au fond du tube, ajouter 1/9 volume d&#39;échantillon de 300 mM de 1,2-Diheptanoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (DHPC) (concentration finale = 30 mM ), mélanger doucement en inversant le tube, et incuber le mélange sur de la glace pendant 5 min (mélange en retournant plusieurs fois au cours de l&#39;incubation). </li><li> Préparer le surnageant post-mitochondriale par centrifugation à 4 ° C pendant 10 min à 20 000 g. Mesurer la concentration de protéines par la méthode de Bradford: concentration en lysat doit être comprise entre 60 à 80 mg / ml. Take le surnageant dans un nouveau tube prérefroidi fraîche et procéder immédiatement à l&#39;étape de pré-absorption (article 5). </li></ol> 5. Pré-absorption <ol><li> Bien remettre en suspension les billes magnétiques par agitation douce et transférer 30 ul de billes dans un tube à centrifuger à température ambiante (30 pi de perles / 1 ml de lysat embryonnaire). </li><li> Recueillir des perles sur l&#39;aimant, une pipette le surnageant, et remettre en suspension les perles dans un tampon d&#39;extraction polysome (500 pi). Récupérer des billes sur l&#39;aimant, ajouter lysat embryonnaire, et incuber pendant 1 heure à 4 ° C sur un agitateur. <ol><li> Retirer perles et de garder surnageant sur de la glace pour l&#39;étape de immunopurification. Avant immunopurification, garder 100 pi de surnageant (entrée) pour comparer échantillon global d&#39;ARN avec l&#39;échantillon d&#39;ARN recueilli après immunopurification, RT-qPCR par exemple. </li></ol></li></ol> 6. Immunopurification <ol><li> Ajouter 1 ml (correspondant à 60 à 80 mg / ml de protéine) delysat pré-absorbée à un tube sans RNase contenant 90 ul de billes bloqués couplés à l&#39;anticorps GFP. Incuber les échantillons à 4 ° C pendant 2 heures avec douceur extrémité par rapport à l&#39;extrémité de mélange dans un dispositif de rotation du tube. Sinon, effectuer l&#39;incubation O / N à 4 ° C. </li><li> Après incubation, de recueillir des perles sur l&#39;aimant. Utilisez un Minifuge à tourner vers le bas les perles, puis les remettre en suspension dans 500 pi de tampon de lavage (HEPES 10 mM, KCl 350mm, MgCl2 5mm, Nonidet P-40 1%, DTT 0,5 mM, cycloheximide 100 pg / ml, RNase inhibiteur 100 U ) et les recueillir sur l&#39;aimant. Répétez cette étape deux fois plus. </li><li> Modifiez les perles dans un nouveau tube RNase-free prérefroidi et laver deux fois. Recueillir des perles sur un aimant et de procéder à l&#39;extraction de l&#39;ARN en ajoutant 1 ml TRIzol directement aux perles et de suivre les instructions du fabricant. </li></ol> 7. ARN Clean-up et de l&#39;évaluation de la qualité <ol><li> Utilisez un kit RNeasy Micro selon les instructions du fabricant. A l&#39;achèvement, élutARN e avec (x) pi d&#39;eau sans RNase. Chaud pendant 2 min à 60 ° C, et un magasin enfichable congelés échantillons à -80 ° C. Vérifier la qualité de l&#39;ARN en utilisant bioanalyseur (suivre les instructions du fabricant). </li><li> Pour tester la spécificité de l&#39;ARN et TRAP, effectuer une transcription inverse sur 3 ng d&#39;ARN purifié (entrée et IP) selon les instructions du fabricant (III) de l&#39;exposant. Utilisez l&#39;ADNc obtenu pour qPCR utilisant des jeux d&#39;amorces spécifiques du gène. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Ce document décrit une Translating ribosome Affinity protocole modifié d&#39;épuration (surnommé «TRAP-rc &#39;) dédié à l&#39;étude des populations de cellules rares dans embryons de drosophile. L&#39;information est fournie sur les étapes clés pour l&#39;isolement de l&#39;ARN spécifique succès avec un rendement adéquat pour les puces à ADN ou d&#39;ARN-analyse suivants, à savoir 1) la quantité de matériel biologique nécessaire et la procédure optimisée pour embryon lyse et l&#39;extraction de polysome; 2) perles / anticorps à-lysat ratios pour immunoprécipitation optimale; 3) les étapes permettant de réduire de fond, y compris la composition du tampon de lavage de manière à réaliser des expériences TRAP-rc avec une haute spécificité et la sensibilité. Ce protocole donne des données reproductibles qui rend facilement appliquée à d&#39;autres types de cellules. Cette technique permet d&#39;analyser l&#39;expression différentielle des gènes au niveau de l&#39;ARNm activement la traduction et ouvrir ainsi la voie à la compréhension de l&#39;expression des protéines dans un spec<html> IFIC type de cellule à une fenêtre de temps spécifique. On notera cependant que l&#39;abondance des protéines dépendra de la vitesse des processus de dégradation et de la traduction. Une limitation majeure de la méthode TRAP est son incapacité à mesurer la teneur en protéines d&#39;une manière quantitative précise ou pour détecter modification post-traductionnelle. Amélioration de la quantification en mesurant la densité des ribosomes le long du corps ARNm et, ce faisant, d&#39;une manière type de cellule spécifique peut faire TRAP combiné avec ribosome empreinte un outil très puissant. Dans un récent article 34, cette combinaison a été réalisée dans des cellules embryonnaires de rein humaines 293. Les auteurs ont couru empreinte nucléase suivie par purification par affinité d&#39;une forme biotinylé inductible de RpL10A utilisant des billes de streptavidine. Ceci est une preuve de principe qu&#39;il est possible de réaliser l&#39;empreinte ribosome dans un organisme entier tout en ciblant un type de cellule spécifique, la limitation étant la quantité de matériel biologique nécessaire à cet effet. &quot;&gt; Spectacle expériences TRAP en parallèle avec les analyses transcriptomiques mondiaux, il sera possible de suivre les proportions entre nouvellement transcrit et actively- traduire ARN. Ce sera très instructif des mécanismes post-transcriptionnel potentiels qui se déroulent dans des contextes de développement spécifiques ou des populations cellulaires spécifiques microARN -par par exemple. En conclusion, TRAP est une méthode très efficace, spécifique et sensible pour l&#39;identification des ARN liés à des ribosomes activement traduire d&#39;une manière spécifique à la cellule. Cette méthode peut être utilisée dans une grande variété d&#39;organismes et de types de tissus. Le nouveau protocole TRAP-rc décrit ici a été optimisé pour les populations de cellules rares (moins de 1% du nombre total de cellules) et pour une quantité de matériau final suffisante pour des analyses ultérieures au niveau du génome entier. Une éventuelle limitation de cette méthode est l&#39;exigence d&#39;un puissant moteur pour produire ribosomes marquées en quantité suffisante pour compete avec celles non marquées endogènes dans le type de cellule ciblée. Dans une étude récente 25, les auteurs estimés à 10-30% le ratio d&#39;marqué contre ribosomes non balisés. Pour surmonter ce problème croissant-EGFP UAS-RpL10A nombre de copies devraient considérablement améliorer cet équilibre. Alternativement, en ajoutant à l&#39;arrière-plan génétique décrit un transgène UAS-GAL4 va amplifier la production de la protéine GAL4 et augmenter indirectement expression de RpL10A-EGFP. Cela devrait favoriser une meilleure occupation des ribosomes marqués sur l&#39;ARNm. Notez que cette approche déjà efficace peut être rendue encore plus puissante en adaptant les méthodes complémentaires pour apporter un aspect plus quantitative ou à découvrir et élucider les mécanismes moléculaires qui sont essentiels pour le contrôle de l&#39;expression des gènes.

Comprendre comment les cellules acquièrent des propriétés spécifiques au cours du développement est cruciale afin d&#39;apprécier la complexité des organes et de leur potentiel d&#39;évolution vers des conditions pathologiques. Il ya un gros effort de recherche à déchiffrer les réseaux de régulation des gènes qui sous-tendent la spécification et la différenciation cellulaire par des profils d&#39;expression génique mondiaux unrevealing, caractère contraignant Pol II, transcription du facteur d&#39;occupation sur des séquences régulatrices ou des modifications post-traductionnelles des histones. Pour évaluer l&#39;expression de gène à puces mondiales de niveau et des approches d&#39;ARN-Seq sont utilisés. Les puces à ADN permettent de détecter l&#39;ARNm abondance, tandis que l&#39;ARN-Seq est mieux adapté à l&#39;information sur les différents types d&#39;ARN, y compris le codage et non codantes ARN comme microARN, lncRNAs ou ARNsn. Cependant, ces techniques ne peuvent pas différencier activement transcrites, l&#39;état d&#39;équilibre de l&#39;ARNm, activement traduction de l&#39;ARNm, et l&#39;ARNm entrant dans le processus de dégradation. Mesure constante st-mangé niveaux d&#39;ARNm est connu pour être une mauvaise estimation de la composition du protéome 1-3. En revanche, d&#39;identifier activement la traduction de l&#39;ARNm donne une image plus précise de la production de protéines. Cependant, des études transcriptomiques ont été principalement mené au niveau organisme entier en comparant gain ou la perte de la fonction d&#39;un facteur spécifique au type sauvage état ​​4-7 ou sur le tissu disséqué, rendant les profils d&#39;expression génique difficiles à interpréter. Les progrès récents dans les outils de ciblage cellulaire, de purification par affinité et des améliorations de sensibilité permettent désormais d&#39;effectuer des analyses du génome entier sur les populations de petites cellules ou des cellules, même simples dans un organisme vivant. Chez la drosophile, de grandes collections de lignées transgéniques permettent un ciblage spécifique temporelle et spatiale des différents tissus et des sous-populations de cellules par le système GAL4 / UAS 8-10 donnant une quantification plus précise des mécanismes moléculaires nécessaires à la fonction cellulaire. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Parmi les approches nouvellement développés polysome profilage par fractionnement a été décrit comme un moyen de capturer activement la traduction de l&#39;ARN 11. Cette méthode basée sur la centrifugation sur gradient de saccharose permet la sélection de la fraction de polysomes et la détermination de l&#39;ARNm traduit l&#39;échelle du génome lorsqu&#39;on l&#39;analyse avec puces à ADN ou un séquençage de profondeur. Polysomes isolement peut être couplé avec la nuclease digestion pour identifier des empreintes ribosomiques correspondant à des fragments d&#39;ARN par les ribosomes protégées pendant le processus de traduction 12. Empreinte ribosomique augmente la précision de la quantification de la traduction de l&#39;ARN et la résolution de niveau séquence ARN et le positionnement ribosome, permet de mesurer le taux de la traduction. Cependant, à ce jour, il n&#39;a pas été appliquée à l&#39;isolement spécifique de la cellule de translatomes, principalement en raison de la forte diminution du rendement d&#39;ARN obtenu à la fin du processus de l&#39;empreinte ribosome. Étant donné que la sélection de la taille de l&#39;ARN peut générer potentiel faux-positives de différentes RNP qui pourrait également être protégeaient l&#39;ARN d&#39;une manière similaire, d&#39;autres développements sont nécessaires pour améliorer l&#39;empreinte ribosomal et l&#39;adapter à des approches spécifiques des cellules. Une de ces méthodes, appelé le Translating ribosome Affinity Purification (TRAP) a été décrite en 2008 par Heiman et al. et appliqué à isoler le translatome de sous-ensemble de neurones chez la souris. Par marquage d&#39;epitope d&#39;une protéine ribosomique dans une cellule de type manière spécifique, polysomes peuvent être purifiés de manière sélective sans l&#39;étape laborieuse de dissociation des cellules et le tri. Dans ce cas, les 60S ribosomique L10a à protéines de la surface du ribosome a été taggés avec eGFP 13. Depuis 2008, plusieurs études ont utilisé cette méthode dans différentes espèces, à partir de souris 14-19 à X. laevis 20,21, 22,23 et le poisson zèbre Arabidopsis thaliana 24. La méthode TRAP a également été adapté au modèle de Drosophila et utilisé pour puritype de cellule spécifiques fy ARNm de cellules neuronales 25 et 26 astrocytes. Le système binaire polyvalent GAL4 / UAS a été utilisé pour exprimer la GFP-tagged RpL10A d&#39;une manière tissu-spécifique. Chefs de mouches adultes ont été disséqués pour effectuer une sélection d&#39;polysome de cellules neuronales (ciblés par pan-neuronal pilote Elav-Gal4) et des ARN isolés ont été séquencés. Le grand nombre de gènes régulés à la hausse correspondait à ceux connus pour être exprimés dans le système nerveux, ce qui indique que l&#39;approche a une bonne spécificité et nous incitant à l&#39;adapter aux populations de cellules rares (moins de 1% des cellules) présente dans le développement des embryons de drosophile . Dans le modèle de drosophile, le stade embryonnaire est un modèle de choix pour l&#39;étude des processus de développement, comme les acteurs moléculaires et mouvements morphogénétiques sont évolutives conservées. Les approches transcriptomiques seulement tissulaires spécifiques menées jusqu&#39;à présent dans ce modèle ont été effectuées en utilisant cellulaire ou nucléaire afinrter et ont seulement été capables d&#39;étudier l&#39;état d&#39;équilibre transcriptome 27-31, créant un besoin de méthodes dédiées au tissu / cellule-spécifique translatome profilage dans l&#39;embryon de mouche. Nous rapportons ici le premier protocole TRAP dédiée aux embryons de drosophile. Avec cette méthode, engagée en translation de l&#39;ARNm dans une population de cellules très limité de l&#39;ordre de 100 cellules musculaires par embryon a été isolé avec succès avec la qualité et la spécificité. Le / système de SAMU GAL4 binaire est utilisé pour entraîner l&#39;expression de RpL10A GFP marqués dans la sous-population des muscles sans aucune toxicité, aucun phénotypes apparentes ou un retard de développement, comme indiqué précédemment 25. Embryons de drosophile possèdent 30 muscles par hemisegment qui donneront lieu à la musculature de la larve. En utilisant une région régulatrice découvert à proximité du gène d&#39;une identité en reste, 6 des 30 muscles multi-nucléées sont ciblés. Dans cet essai, les ribosomes sont immobilisés sur de l&#39;ARNm en utilisant l&#39;allongement de traductioninhibiteur cycloheximide. Extraits cytosoliques sont ensuite utilisés pour la purification par affinité avec des billes magnétiques recouvertes d&#39;anticorps GFP. Qualité de l&#39;ARN purifié a été validée à l&#39;aide bioanalyseur. Transcription inverse quantitative PCR (RT-qPCR) a été utilisé pour déterminer la spécificité et la sensibilité de l&#39;ARNm et de l&#39;isolement a démontré que notre protocole optimisé est très efficace.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>H4034-1006</td><td></td></tr><tr><td>1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&nbsp ;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850306P</td><td></td></tr><tr><td>Glycogène</td><td>thermo scientifique&nbsp ;</td><td>R0561</td><td></td></tr><tr><td>BSA 100X purifié</td><td>Biolabs</td><td>B9001</td><td></td></tr><tr><td>ARNt de levure&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>R5636</td><td></td></tr><tr><td>Super RNase In&nbsp ;</td><td>Ambion</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps GFP clone N86/38</td><td>UC DAVIS/NIH Neuromab Faculty Anticorps Incorporated</td><td>75-132&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>11754595001</td><td></td></tr><tr><td>Precellys 24 Homogénéisation de la lyse&nbsp ;</td><td>Bertin Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléases&nbsp ;</td><td>Nalgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads ProteinG</td><td>Invitrogen</td><td>10004D</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Biosystème appliqué&nbsp ;</td><td></td><td></td>AM96406</tr><tr><td>Chlorure de magnésium (MgCl2)&nbsp ;</td><td>Biosystème appliqué&nbsp ;</td><td></td><td></td>AM95306</tr><tr><td>Waddin de cellulose non blanchi</td><td>VWR</td><td>115-2597&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Tamis 112, 355, 710 um&nbsp ;</td><td>Retsch</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TRiZol&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>MagRack 6</td><td>GE HealthCare&nbsp ;</td><td></td><td></td>28948964</tr><tr><td>Embouts filtrants à faible liaison&nbsp ;</td><td>ClearLine</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rnase free tube 1,5 ml&nbsp ;</td><td>ClearLine</td><td>390689DD</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp ;</td><td>Bioréactif Fischer&nbsp ;</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Cycloheximide&nbsp ;</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>C1985</td><td></td></tr><tr><td>Comprimés inhibiteurs de protéase, Mini-Complete, sans EDTA&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr></tbody></table>

trap-rc, translating ribosome purification par affinité à partir de populations de cellules rares de<em&gt; drosophila</em&gt; embryons

TRAP-rc, Translating Ribosome Affinity Purification from Rare Cell Populations of Drosophila Embryos

La mesure des niveaux d’ARNm dans le processus de traduction dans les cellules individuelles fournit des informations sur les protéines impliquées dans les fonctions cellulaires à un moment donné. Le protocole TRAP (Translating Ribosome Affinity Purpurity) est capable de capturer ce processus de traduction de l’ARNm d’une manière spécifique au type de cellule. Basé sur la purification par affinité de polysomes porteurs d’une sous-unité ribosomique marquée, TRAP peut être appliqué à des analyses de translatomes dans des cellules individuelles, permettant de comparer les types de cellules au cours des processus de développement ou de suivre les progrès du développement de la maladie et l’impact des thérapies potentielles au niveau moléculaire. Nous rapportons ici une version optimisée du protocole TRAP, appelée TRAP-rc (cellules rares), dédiée à l’identification des ARN engagés dans la traduction à partir de populations de cellules rares. TRAP-rc a été validé à l’aide du système de ciblage Gal4/UAS dans une population restreinte de cellules musculaires chez des embryons de drosophile. Ce nouveau protocole permet de récupérer de l’ARN spécifique au type de cellule en quantités suffisantes pour l’analyse globale de l’expression génique, comme les microréseaux ou le séquençage de l’ARN. La robustesse du protocole et les grandes collections de pilotes Gal4 font de TRAP-rc une approche très polyvalente avec des applications potentielles dans des études spécifiques au génome des cellules.

Le système musculaire somatique embryonnaire chez la drosophile est composé de 30 muscles par hemisegment, et chaque muscle a un ensemble spécifique de propriétés: code de gènes d&#39;identité, la position, le nombre d&#39;événements de fusion, des sites de fixation et innervation. Identifier traduit ARNm dans un sous-ensemble spécifique de muscle donnera des informations sur les protéines nécessaires pour former ces caractéristiques spécifiques musculaires. En utilisant la méthode basée TRAP, de l&#39;ARN à partir d&#39;un sous-population de muscles exprimant le gène de la mollesse de l&#39;identité a été purifié (figure 1A-B). Une préoccupation majeure de cette approche est la qualité et la spécificité de l&#39;ARN isolé. Le protocole optimisé rapportée ici a permis la récupération systématique des ARN de haute qualité évaluée par analyse de bioanalyseur. Le profil obtenu ne présente aucune dégradation de l&#39;ARN (figure 1C). Dans d&#39;autres études développées autour de la méthode TRAP, questions ont été soulevées au cours de la spécificité des données. Ici, nous improve le procédé pour supprimer fond lié à la liaison non spécifique de l&#39;ARN pour les billes ou les tubes et par l&#39;optimisation du tampon de lavage. Afin d&#39;évaluer le niveau et l&#39;efficacité d&#39;isoler des cellules exprimant slouch fond, nous avons mené des essais de RT-qPCR sur 3 répétitions du même stade embryonnaire. Pliez-enrichissements de 4 gènes différents (MEF2, empoté, Prospero, soxNeuro) ont été calculées par rapport à l&#39;entrée et normalisée contre le gène de rpl32 (figure 1D). Ces résultats ont montré un enrichissement de 2,3 fois de MEF2 de gènes pan-musculaires et d&#39;enrichissement de 5,6 fois du gène reste. En revanche, les deux gènes exprimés dans le système nerveux ont été appauvri par rapport à l&#39;entrée. Des valeurs très similaires de facteur de changement ont été observés sur 3 répétitions biologiques, ce qui démontre que le protocole est robuste. Avec chauffeur Slouch-Gal4 et à partir de 1,5 g, autour de 1,5x10 ^ 6 embryons ont été obtenus qui contiennent 100 cellules GFP / embryon (total de 150 × 10 ^ 6 positifcellules). Après l&#39;exécution de l&#39;expérience TRAP, le rendement est d&#39;environ 25-45 ng d&#39;ARN spécifique selon le stade d&#39;intérêt. Ce matériau est suffisante pour faire fonctionner analyse de puces à ADN ou ARN-seq en utilisant un protocole d&#39;amplification de construire une bibliothèque d&#39;ARN-seq. Efficacité dépendra fortement de la force du pilote utilisé pour exprimer RpL10A-EGFP. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52985/52985fig1.jpg" /> Figure 1. Qualité et évaluation de la spécificité de l&#39;ARN-TRAP isolé de Slouch-GAL4&gt; embryons UASRpL10A-EGFP. (AB) images confocale d&#39;un embryon stade-16 montrant l&#39;expression RpL10A-EGFP spécifiquement dans les six cellules musculaires Slouch par hemisegment (A). Co-localisation de RpL10A-EGFP avec le marqueur musculaire générale Beta3tubulin est observée sur l&#39;image de fusion (B). (C) de contrôle de la qualité des ARN et TRAP ran sur bioanalyseur montrant une parfaite intégrité des ARNr 18S et 28S. Analyse (D) RT-qPCR montrant une grande spécificité d&#39;expériences d&#39;ARNm TRAP isolé sur 3 répétitions biologiques de l&#39;étape-16 embryons. Pliez le changement est calculé par rapport à l&#39;entrée et normalisée contre le gène de rpl32. Transcriptions MEF2 présents dans toutes les lignées musculaires sont 2,3 fois enrichis par rapport à l&#39;entrée tandis que les transcriptions slouch plus restreints sont 5,6 fois enrichi. Cellules neurales exprimant Prospero et gènes soxN sont épuisées 2,2 fois et 5,5 fois respectivement. Les barres d&#39;erreur représentent l&#39;écart type (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52985/52985fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

La purification par affinité des ribosomes (TRAP) est capable de capturer la traduction spécifique du type cellulaire de l’ARNm. Nous rapportons ici le premier protocole TRAP dédié à l’isolement de l’ARNm dans des populations cellulaires rares d’embryons de drosophile.

TRAP-rc, Translating ribosome Purification par affinité à partir de populations de cellules rares de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons

Measuring levels of mRNAs in the process of translation in individual cells provides information on the proteins involved in cellular functions at a given ...

L'objectif général de cette procédure est d'isoler de l'ARN engagé dans la traduction de manière spécifique à un type cellulaire chez l'embryon de drosophile. Cela est réalisé en premier lieu en collectant des embryons provenant d'une lignée de drosophiles transgéniques, permettant une expression spécifique d'une sous-unité ribosomale marquée par GFP dans le type cellulaire ciblé, ici les cellules musculaires slouch. La deuxième étape consiste à préparer un lysat afin d'obtenir une préparation de polysomes contenant un mélange de ribosomes marqués et non marqués.Ensuite, la concentration en protéines dans le lysat est estimée et une purification par affinité est réalisée à l’aide de billes couplées à des anticorps anti-GFP afin d’isoler les complexes ribosomaux d’ARN à partir du type cellulaire d’intérêt. La dernière étape est consacrée à l’extraction et à la purification de l’ARN. Enfin, des évaluations de qualité et de spécificité sont effectuées respectivement à l’aide d’un bioanalyseur et de la RT-qPCR.L'ARN peut ensuite être utilisé pour une analyse quantitative globale par séquençage de l'ARN ou par puces à ADN. Le principal avantage de cette technique par rapport à nos méthodes existantes, comme le tri VX, est qu'elle ne nécessite pas une étape laborieuseuse de dissociation cellulaire. Elle peut être réalisée sur la paillasse.C'est rapide et permet l'identification directe des ARN traduits dans une population très restreinte de cellules, ce qui constitue un avantage considérable pour comprendre l'acquisition des propriétés cellulaires. Même si cette méthode peut fournir des informations sur la myogenèse dans l'embryon de Josephine, elle peut également être appliquée à d'autres tissus ou organismes modernes, tels que les plantes, les zèbres, les poissons ou les souris, et pourrait aussi aider à suivre l'impact d'un traitement sur la synthèse des protéines en cas de pathologie. La démonstration de la procédure sera assurée par Benjamin Berta, un étudiant en doctorat de mon laboratoire. Après la conception, selon les instructions de la partie écrite du protocole, de deux lignées transgéniques et leur croisement pour créer la lignée transgénique double porteuse du piège, amplifier la lignée en préparant d'abord huit grandes cages cylindriques contenant environ 40 grammes de mouches jeunes par cage, ce qui correspond à environ 180 000 mouches par cage.Préparez des boîtes de Pétri de 11 centimètres de diamètre contenant un mélange d'agar solidifié et de jus de raisin, avec un tiers de la surface recouvert de pâte de levure fraîchement préparée, et laissez les mouches pondre leurs œufs sur ces boîtes pendant une heure. Répétez ce processus sur deux autres séries de boîtes fraîches au jus de raisin afin de permettre aux mouches d'épuiser complètement leurs ucts. Les embryons doubles transgéniques souhaités issus du croisement seront pondus sur la quatrième boîte.Retirer les plaques contenant les embryons souhaités des cages et les laisser incuber jusqu’au stade de développement désiré à température ambiante. Une incubation de 13 heures est utilisée ici. Ensuite, resuspendre le contenu de la plaque avec environ 50 millilitres d’eau à l’aide d’un pinceau.Séparer les embryons des mouches mortes en faisant passer le liquide à travers trois tamis de 700, 355 et 112 microns de diamètre. Rincer les embryons recueillis dans le tamis de plus petit diamètre avec de l'eau ionisée. Enrober les embryons d'une solution d'eau de Javel à 4,5 % dans l'eau ionisée pendant deux minutes, puis rincer soigneusement avec de l'eau ionisée pendant 30 à 60 secondes.Incuber les embryons dans du PBS contenant 0,01 % de T à raison de 20 à 100 microgrammes par millilitre. Traiter avec du Cyclo heide pendant cinq à dix minutes à température ambiante sous agitation. Après avoir séché les embryons sur des feuilles absorbantes en cellulose, les transférer dans des tubes de microcentrifugation, puis peser les tubes et congeler rapidement les embryons par immersion dans de l'azote liquide.Dans cette étape, les embryons séchés peuvent être stockés pendant plusieurs mois à moins 80 degrés Celsius. Transférez 1,5 gramme des embryons séchés dans des tubes de 15 millilitres prérefroidis, contenant quatre millilitres de tampon d'extraction des polysomes, et homogénéisez à l'aide d'une pipette sérologique stérile de 10 millilitres.Ensuite, répartir les embryons homogénéisés dans deux tubes prérefroidis de deux millilitres et broyer les embryons dans un broyeur à billes rapide multidirectionnel. Régler l'appareil pour deux cycles de 10 secondes à 5 000 tr/min, avec une pause de 15 secondes entre chaque cycle. Après 10 minutes de centrifugation à 2000 G, transférer le lysat dans un nouveau tube de microcentrifugation prérefroidi placé sur de la glace.Ajouter 10 % de Nonidet P40 au surnageant S pour obtenir une concentration finale de 0,1 %, puis mélanger délicatement en retournant le tube. Ajouter du DHPC à 300 micromolaire pour obtenir une concentration finale de 30 millimolaire, puis mélanger délicatement en retournant le tube. Incuber une minute sur glace, en mélangeant par retournement plusieurs fois pendant l'incubation.Après l'incubation sur glace, préparez le surnageant post-mitochondrial par centrifugation à quatre degrés Celsius pendant 10 minutes à 20 000 G. Après avoir mesuré la concentration en protéines par la méthode de Bradford et obtenu une concentration en protéines comprise entre 60 et 80 milligrammes par millilitre, transférez le SNAT dans un tube de microcentrifugeuse frais prérefroidi et passez immédiatement à l'étape de préabsorption. Resuspendez les billes magnétiques par agitation douce, puis transférez 30 microlitres de billes pour chaque millilitre de lysat dans un tube de microcentrifugeuse.Placer les billes sur l'aimant, pipeter le surnageant et resuspendre les billes dans 500 microlitres de tampon d'extraction des polysomes. Ensuite, placer à nouveau les billes sur l'aimant. Ajouter ensuite le lysat embryonnaire et incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius sur un agitateur rotatif.Retirez les billes et placez l'agent surnageant sur de la glace jusqu'à l'étape de purification immunoaffine. En conservant 100 microlitres du surnageant comme échantillon global d'ARN à comparer avec l'échantillon recueilli après la purification immunoaffine, ajoutez un millilitre de lysat pré-absorbé dans un tube exempt d'ARN contenant 90 microlitres de billes bloquées couplées à un anticorps anti-GFP. Incubez l'échantillon à quatre degrés Celsius pendant deux heures ou toute la nuit, avec un mélange doux par retournement dans un rotateur de tubes après l'incubation.Lavez les billes en centrifugeant d'abord les billes restantes dans une mini-centrifugeuse. Ensuite, récupérez-les sur un aimant, resuspendez-les dans 500 microlitres de tampon de lavage et incubez-les en agitant pendant 10 minutes dans la chambre froide, puis récupérez à nouveau les billes sur l'aimant.Transférez les billes dans un nouveau tube exempt d'ARN pré-shield et lavez-les deux fois supplémentaires. Enfin, après avoir récupéré les billes sur l'aimant, procédez à l'extraction d'ARN en ajoutant un millilitre de TRIOL aux billes et en effectuant l'extraction conformément aux instructions du fabricant. Suivez cette étape par une purification de l'ARN, en utilisant un kit RNEZ micro selon les instructions du fabricant.Pour tester la spécificité de l'ARN piégé, réalisez une transcription inverse à partir de trois nanogrammes d'ARN immunopurifié et d'ARN témoin selon les procédures standard. Ensuite, utilisez l'ADNc obtenu pour une PCR quantitative avec des jeux d'amorces spécifiques au gène. Cette image confocale d'un embryon au stade 16 montre l'expression de RPL 10 A-E-G-F-P, spécifiquement dans les six cellules musculaires slouch de chaque segment HEMI ; une colocalisation de RPL 10 A-E-G-F-P avec le marqueur général des muscles, la bêta-tubuline 3, est observée.L'ARN piégé a été analysé sur un bioanalyseur à des fins de contrôle de qualité. Remarquez l'intégrité parfaite des ARN ribosomiques 18S et 28S. Cette figure présente les résultats d'une analyse de RT-qPCR réalisée sur trois réplicats biologiques d'embryons au stade 16, et démontre la haute spécificité de l'ARNm isolé par piégeage.La variation de la méthylation a été calculée par rapport à l'entrée et normalisée par rapport au gène RPL32. Deux transcrits présents dans toutes les lignées musculaires sont enrichis de 2,3 fois par rapport à l'entrée, tandis que les transcrits plus restreints de slouch sont enrichis de 5,6 fois, et les cellules neuronales exprimant prospero et socks ainsi que les gènes sont appauvris respectivement de 2,2 fois et de 5,5 fois après leur développement. Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs, en particulier dans le domaine de la biologie du développement, pour explorer l'engagement autonome et l'acquisition de propriétés cellulaires au cours de la différenciation des embryons doof.

trap-rc-translating-ribosome-affinity-purification-from-rare-cell

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JoVE Journal

Biology

Biologie

Un obstacle majeur à des analyses biochimiques des ribosomes contenant naissante peptidyl-ARNt a été la présence de ribosomes d'autres dans les mêmes échantillons, les ribosomes pas impliqué dans la traduction de la séquence d'ARNm spécifiques en cours d'analyse. Nous avons développé une méthodologie simple pour purifier, en exclusivité, les ribosomes contenant la naissante peptidyl-ARNt d'intérêt.

Isolement des ribosomes Traduire Contenant Peptidyl-ARNt pour des analyses fonctionnelles et structurelles

Le but de ce protocole est de fournir une approche simple et peu coûteuse pour collecter des embryons de Drosophila à l'échelle moyenne (0,5-1 g) et préparer des extraits de protéines qui peuvent être utilisés dans des applications protéomiques en aval, telles que la purification par affinité, la spectrométrie de masse (AP-MS ).

Préparation à moyen terme de<em&gt; Drosophila</em&gt; Extraits d&#39;embryons pour les expériences protéomiques

Nous présentons une approche pour purifier l'ARNm ribosome-lié des cellules endothéliales vasculaires (ECs) directement dans le cerveau de souris, poumon et tissus cardiaques par l'intermédiaire de l'étiquette génétique EC-spécifique de la protéine verte améliorée de fluorescence (EGFP) dans des ribosomes en combination avec la purification d'ARN .

Traduire Ribosome Affinity Purification (TRAP) pour l'isolement de l'ARN des cellules endothéliales in vivo

La traduction de la purification de l’affinité ribosome (TRAP) offre la possibilité de disséquer les programmes de développement avec un traitement minimal des organes et des tissus. Le protocole donne de l’ARN de haute qualité à partir de cellules ciblées avec un sous-unité ribosomal étiquetée protéine fluorescente verte (GFP). Les outils d’analyse en aval, tels que qRT-PCR ou ARN-seq, révèlent des profils d’expression spécifiques aux tissus et aux cellules.

Traduire la purification de l’affinité ribosome (TRAP) pour étudier le développement de la racine d’Arabidopsis thaliana à une échelle spécifique au type cellulaire

Ici, nous décrivons l’immunoprécipitation des ribosomes et de l’ARN associé de populations choisies de cellules mâles adultes de germe de souris utilisant le système de RiboTag. La reproduction stratégique et l’immunoprécipitation soigneuse donnent des résultats propres et reproductibles qui informent sur le translatome des cellules germinales et donnent un aperçu des mécanismes des phénotypes mutants.

Immunoprécipitation de RiboTag dans les cellules germinales de la souris mâle

Les interactions co-traductionnelles jouent un rôle crucial dans les modifications de la chaîne naissante, le ciblage, le pliage et les voies d’assemblage. Nous décrivons ici le profilage sélectif des ribosomes, une méthode d’analyse directe in vivo de ces interactions dans le modèle eucaryote Saccharomyces cerevisiae.

Identification globale des réseaux d’interaction co-translationnelle par profilage sélectif des ribosomes

Ce protocole vise à isoler les ARNm ribosomales de traduction spécifiques au type cellulaire à l’aide du modèle murin NuTRAP.

Isoler des ARN spécifiques à un type cellulaire à partir d’échantillons de tissus hétérogènes congelés sans tri cellulaire

Sur la base du mécanisme d’assemblage du complexe protéique INAD, dans ce protocole, une stratégie modifiée de purification d’affinité et de compétition a été développée pour purifier le canal endogène TRP de la drosophile .

Purification des canaux potentiels des récepteurs transitoires endogènes de la drosophile

La Biotinylation par illumination restreinte par localisation spécifique à AviTag (ALIBi) est une méthode novatrice activée par l’optogénétique développée pour marquer et purifier par affinité les populations subcellulaires de ribosomes pour le séquençage en aval et l’analyse protéomique.

Isolement des sous-populations de ribosomes subcellulaires basé sur la biotinylation enrichie par éclairage restreinte par peptide peptidique spécifique à la marque de recombinaison

Le protocole décrit la méthode d’hybridation par fluorescence in situ sensible aux polymorphismes nucléotidiques uniques (SNP-FISH) pour distinguer les transcrits d’ARN ribosomique dérivés du locus de l’ADN ribosomique du chromosome X ou Y chez Drosophila melanogaster.

FISH sensible au polymorphisme mononucléotidique Détection de la transcription de l’ARN ribosomique spécifique du locus chez Drosophila melanogaster

Ici, nous fournissons des détails sur la préparation des lysats et la réalisation de la traduction in vitro à l’aide d’embryons de Drosophila .

Traduction d’ARNm in vitro sans cellules chez les lysats de Drosophila

Découvrez la purification d'ARN traduit par affinité (TRAP) pour isoler l'ARNm de populations cellulaires rares dans les embryons de Drosophila. Cette méthode permet l'analyse spécifique de la traduction sans dissociation cellulaire.

TRAP-rc, Translating ribosome Purification par affinité à partir de populations de cellules rares de

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