Adapter le processus Électrofilage de fournir trois environnements uniques pour un Tri-couches

L'objectif général de cette procédure est d'élaborer par électrofilage un échafaudage tridimensionnel biphasique, permettant la co-culture de cellules humaines adultes complètement différenciées afin de reproduire la matrice extracellulaire naturelle que ces cellules rencontrent dans C deux. Ceci est réalisé en premier lieu par l'électrofilage d'un échafaudage de microfibres à alignement aléatoire. La deuxième étape consiste à former un échafaudage biphasique en réalisant par électrofilage une couche de nanofibres à alignement aléatoire directement sur l'échafaudage de microfibres.

Ensuite, un support distinct de nanofibres alignées est fabriqué par électrofilage. La dernière étape consiste à ensemencer chaque support avec le type cellulaire correspondant et à co-cultiver les supports dans un système de bioréacteur perfusé en tant que construit unique. En définitive, les interactions multicellulaires peuvent être analysées par la mesure de la libération de médiateurs et par immunomarquage.

La construction. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes, comme les membranes transformées en 2D, est que les supports électriques offrent un environnement fibreux en 3D qui peut être adapté pour fournir une morphologie physiologiquement pertinente. Il s'agit d'une structure plus poreuse, permettant la culture en cœur de plusieurs types cellulaires.

Cette méthode offre une plateforme stable utilisant des cellules humaines saines, malades ou groupées comme modèle in vitro. Cela contribuera à réduire notre dépendance aux modèles animaux, dont la pertinence par rapport aux maladies humaines est limitée, ainsi qu’à diminuer le nombre d'animaux utilisés dans les expériences. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur des maladies telles que l'asthme et la BPCO, elle peut également être appliquée à d'autres systèmes, par exemple pour l'étude des maladies inflammatoires de l'intestin ou pour le développement d'un modèle cutané destiné aux tests chimiques.

Pour commencer, préparez trois solutions différentes de PET de 10 millilitres en dissolvant 8 %, 10 % et 30 % de PET dans des mélanges un-à-un de chlorométhane et d'acide trichloroacétique. Agitez les solutions toute la nuit à température ambiante afin de dissoudre complètement le PET d'ici le lendemain. Transférez les solutions de PET dans des seringues et fixez une aiguille de calibre 23 sur la seringue contenant le mélange à 8 %, ainsi que des aiguilles de calibre 18 sur les deux autres seringues contenant les solutions de PET à 10 % et 30 %.

Préparez le support en microfibre. Commencez par charger la seringue contenant la solution de PET à 30 % dans la pompe à seringue, en orientant la pointe de l'aiguille vers le bas. Placez le tambour à 15 centimètres de l'extrémité de l'aiguille et assurez-vous que l'aiguille soit dirigée vers le centre du tambour.

Reliez le câble d'alimentation électrique positive à l'extrémité de l'aiguille à l'aide d'une pince crocodile métallique et mettez le mandrin à la masse en connectant le câble de masse à la douille banane. Allumez le moteur et réglez la vitesse du mandrin à 60 tr/min. Activez la pompe à seringue pour obtenir un débit de 2,0 millilitres par heure.

Lors de la création des échafaudages en microfibres, laissez la pompe fonctionner jusqu'à ce que la solution soit extrudée de l'extrémité de l'aiguille afin de purger le système en éliminant tout air présent dans l'aiguille. Ensuite, arrêtez la pompe de la pompe à seringue.

Régler le volume total de solution à expulser à deux millilitres et démarrer la pompe. Ensuite, appliquer un potentiel de 14 kilovolts entre l'aiguille et le mandrin pour effectuer l'électrofilage pendant une heure, jusqu'à ce que deux millilitres de la solution de PET à 30 % aient été électrofilés. Avec le support de microfibres toujours sur le mandrin, couper le potentiel électrique. Retirer la pince crocodile et remplacer la seringue contenant la solution de PET à 30 % par celle contenant la solution de PET à 8 %.

Rebranchez ensuite la pince crocodile à l'aiguille de calibre 23. Réglez le débit de la pompe à seringue sur 0,5 millilitre par heure et purgez l'aiguille en faisant fonctionner la pompe à seringue jusqu'à ce que la solution s'écoule de l'extrémité. Pendant que le mandrin continue de tourner à 60 tr/min, appliquez un potentiel de 14 kilovolts entre l'extrémité de l'aiguille et le mandrin, puis réglez le volume total à extruder par la pompe à seringue sur deux millilitres.

Faites électrofilamer pendant quatre heures jusqu'à ce que deux millilitres de la solution de PET à 8 % aient été électrofilamés. Une fois l'électrofilage terminé, éteignez l'alimentation électrique et le moteur faisant tourner le mandrin. Coupez le support biphasique avec une lame selon la largeur du mandrin afin d'obtenir une feuille de support en deux dimensions ayant la taille de la surface du mandrin.

Pour préparer des échafaudages de PET alignés, charger la seringue contenant la solution de PET à 10 % dans la pompe à seringue avec la pointe de l'aiguille vers le bas. Ensuite, connecter la pince crocodile à l'aiguille. Régler le débit à 0,5 millilitre par heure et amorcer l'aiguille avec la solution de PET.

Ensuite, allumez le moteur et réglez la vitesse de rotation du mandrin à 2000 tr/min. Puis, activez la pompe à seringue. Réglez l'alimentation électrique à 14 kilovolts et enclenchez l'alimentation électrique pour la filature électrostatique pendant quatre heures, jusqu'à ce que deux millilitres de solution aient été filés électrostatiquement.

Lorsque l'électrofilage est terminé, éteignez l'alimentation électrique et le moteur. Coupez le support avec une lame le long de la largeur du mandrin afin d'obtenir une feuille bidimensionnelle de support alignée. Conservez les supports obtenus par électrofilage dans du papier d'aluminium afin de réduire la charge électrostatique.

Utilisez un stylo de biopsie de 0,8 millimètre de diamètre pour découper des disques de supports biphasiques ou alignés à partir des feuilles de SPU. Collez ensuite le disque de support biphasique sur un joint en utilisant une colle non toxique pour aquarium. Placez les joints et les supports dans une plaque de culture tissulaire de 12 puits.

Stérilisez les joints et les échafaudages à l’aide d’un rayonnement ultraviolet de type I pendant 30 minutes de chaque côté des échafaudages. Imprégnez-les ensuite d’une solution antibiotique antimycotique à 20 % pendant une nuit à quatre degrés Celsius le jour suivant. Lavez les échafaudages avec du PP S3 trois fois et conservez-les dans du PBS à quatre degrés Celsius jusqu’à leur utilisation.

Transférez les échafaudages biphasiques du PBS vers une nouvelle plaque de 12 puits et réchauffez-les dans un milieu DMEM supplémenté avec 10 % de FCS pendant une heure à 37 degrés Celsius. Retirez le milieu DMEM supplémenté et placez la phase de microfibres des échafaudages ; ajoutez 15 000 cellules fibroblastes MRC-5 en 30 microlitres de milieu DMEM supplémenté sur chaque échafaudage afin de favoriser la pénétration des fibroblastes dans l'échafaudage. Placez la plaque sur un agitateur orbital et agitez les échafaudages à 100 tr/min pendant deux heures.

Ensuite, ajouter deux millilitres de milieu DMEM complémenté à chaque échafaudage et incuber les échafaudages toute la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Le jour suivant, retirer le milieu des puits et retourner les échafaudages afin que la phase en nanofibres des échafaudages soit orientée de façon apicale. Ensuite, ensemencer 30 000 cellules épithéliales Cali trois dans 30 microlitres de milieu D-M-E-M-F 12 complémenté avec 10 % de FCS sur la phase en nanofibres de l'échafaudage.

Incuber la matrice pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avant d'immerger les matrices dans un mélange 70/30 de milieu D-M-E-M-F 12 et de milieu DMEM supplémenté, puis poursuivre l'incubation statique pendant 12 heures supplémentaires pour cultiver les cellules musculaires lisses des voies respiratoires. Tout d'abord, transférer les matrices alignées du PBS dans une nouvelle plaque de 12 puits et les réchauffer, ainsi que le milieu DMEM supplémenté, pendant une heure à 37 degrés Celsius. Retirer le milieu DMEM supplémenté et ajouter 25 000 cellules musculaires lisses des voies respiratoires dans 30 microlitres de milieu DMEM supplémenté sur chaque matrice, puis incuber pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Une fois fixés, plongez les échafaudages dans un milieu complémenté de DMEM. Replacez-les dans l'incubateur et laissez-les toute la nuit avant de mettre en place une triculture dans le bioréacteur. Le jour suivant, placez l'échafaudage biphase dans la chambre du bioréacteur, la phase épithéliale orientée vers le haut, dans la chambre.

Placer ensuite le support aligné sous le support biphasique de manière à ce qu'il soit adjacent à la phase de microfibres du support biphasique. Verrouiller les deux chambres du bioréacteur ensemble. Puis assembler deux circuits de perfusion en flux continu dans une étuve comme décrit dans le protocole textuel accompagnant et pomper le milieu autour des deux circuits à environ 0,1 millilitre par minute à l'aide d'une pompe péristaltique après une semaine.

Retirer le milieu de la chambre apicale et poursuivre la culture. Les cellules épithéliales sont maintenues à l'interface air-liquide pendant une semaine supplémentaire avant analyse, après deux semaines de culture dans le bioréacteur. La structure tri-culture présentée ici a été fixée et sectionnée afin de montrer les noyaux cellulaires répartis dans les trois couches du dispositif. Les noyaux cellulaires ont été colorés au DAPI et apparaissent en bleu, tandis que le matériau de la structure apparaît en gris. Voici des images au microscope électronique à balayage de supports de nanofibres et de microfibres électrofilées, ainsi que de supports alignés, préparés respectivement pour l'ensemencement des cellules épithéliales, des fibroblastes et des cellules musculaires lisses.

Les trois types cellulaires ont montré une augmentation de la viabilité lorsqu’ils ont été cultivés sur leurs supports respectifs pendant une période de deux semaines. Chacun a également continué à exprimer des protéines spécifiques au type cellulaire après la période de culture de deux semaines. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d’étudier la matrice extracellulaire native que vous cherchez à recréer à l’aide des fibres électrofilées.

Les cellules présenteront un comportement différent lorsqu'elles adhèrent à des topographies 3D variées. Par exemple, les cellules épithéliales ne formeront une barrière fonctionnelle que lorsqu'elles sont cultivées sur des nanofibres. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment construire un système de co-culture multicouche, utilisable pour l'étude des interactions intercellulaires dans un environnement de culture dynamique.

N'oubliez pas qu'il est important d'ajuster les paramètres d'électrofilage, tels que le débit et la tension, en fonction du polymère et du système solvant que vous prévoyez d'utiliser lors de cette procédure. Cela est crucial pour obtenir les fibres souhaitées. De plus, pensez à effectuer l'électrofilage dans une hotte ou un placard ventilé afin de permettre l'extraction adéquate des solvants.