Adapter le processus Électrofilage de fournir trois environnements uniques pour un Tri-couches In Vitro Modèle du mur Airway

L’objectif global de cette procédure est d’électro-spinner un échafaudage phasique tridimensionnel, permettant la coculture de cellules humaines adultes entièrement différenciées afin de répliquer la matrice extracellulaire naturelle que ces cellules rencontrent en C deux. Ceci est accompli par d’abord l’électro-filage, un échafaudage en microfibre aligné au hasard. La deuxième étape consiste à former un échafaudage biphasique en faisant tourner électriquement une couche de nanofibres alignée au hasard directement sur l’échafaudage en microfibre.

Ensuite, un échafaudage en nanofibres aligné séparé est électro-filé. La dernière étape consiste à ensemencer chaque échafaudage avec leur type de cellule respectif et à co-cultiver les échafaudages dans un système de bioréacteur à profusion en une seule construction. En fin de compte, les interactions multicellulaires peuvent être analysées par la mesure de la libération de médiateurs et de l’immunomarquage.

La construction. Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que les membranes transformées en 2D, est que les échafaudages électriques fournissent un environnement fibreux 3D qui peut être adapté pour fournir une morphologie physiologiquement pertinente. Il s’agit d’une structure plus poreuse qui permet la culture de base de plusieurs types de cellules.

Cette méthode fournit une plate-forme stable en utilisant des cellules humaines en cohorte, malades ou saines comme modèle in vitro. Cela contribuera à réduire notre dépendance à l’égard des modèles animaux, dont la pertinence pour les maladies humaines est limitée, et à diminuer le nombre d’animaux utilisés dans l’expérimentation. Bien que cette méthode puisse donner un aperçu de maladies telles que l’asthme et la BPCO, elle peut également être appliquée à d’autres systèmes, par exemple pour l’étude des maladies inflammatoires de l’intestin ou pour le développement d’un modèle de peau pour les tests chimiques.

Pour commencer, préparez trois solutions différentes de 10 millilitres de PET en dissolvant 8 %, 10 % et 30 % de PET dans des mélanges individuels de chlorométhane et d’acide trichloracétique. Remuez les solutions pendant la nuit à température ambiante pour dissoudre le PET le lendemain. Transférez les solutions de PET dans des seringues et fixez une aiguille de calibre 23 à la seringue contenant le mélange à 8 % et des aiguilles de calibre 18 aux deux autres seringues contenant les solutions de PET à 10 % et à 30 %.

Préparez l’échafaudage en microfibre. Tout d’abord, chargez la seringue contenant la solution 30 % de PET dans le pousse-seringue avec la pointe de l’aiguille en bas. Positionnez le manl à 15 centimètres de la pointe de l’aiguille et assurez-vous que l’aiguille est pointée au centre du tambour.

Fixez la ligne d’alimentation électrique positive à la pointe de l’aiguille à l’aide d’une pince crocodile métallique et mettez à la terre la manl en connectant la ligne de terre à la prise banane. Allumez le moteur et réglez la vitesse de rotation sur 60 tr/min. Allumez la pompe à seringue pour fournir un débit de 2,0 millilitres par heure.

Lors de la création des échafaudages en microfibre. Laissez la pompe fonctionner jusqu’à ce que la solution soit extrudée de la pointe de l’aiguille afin d’amorcer le système en éliminant tout air dans l’aiguille. Arrêtez ensuite la pompe sur le pousse-seringue.

Réglez le volume total de solution à expulser à deux millilitres et démarrez la pompe. Ensuite, appliquez un potentiel de 14 kilovolts entre l’aiguille et le mandrin pendant une heure jusqu’à ce que deux millilitres de la solution PET à 30 % aient été filés avec l’échafaudage en microfibre toujours sur le mandrin pour désactiver le potentiel de tension. Retirez la pince crocodile et remplacez la seringue contenant la solution PET 30 % par la seringue contenant la solution PET 8 %.

Reconnectez ensuite la pince crocodile à l’aiguille de calibre 23. Modifiez le débit du pousse-seringue à 0,5 millilitre par heure et amorcez l’aiguille en faisant fonctionner le pousse-seringue jusqu’à ce que la solution s’écoule de l’embout. Avec le mandrin continuant à tourner à 60 tr/min, appliquez le potentiel de 14 kilovolts entre la pointe de l’aiguille et le mandrin, et réglez le volume total à extruder par la pompe à seringue à deux millilitres.

Essorage électroélectrique pendant quatre heures jusqu’à ce que deux millilitres de la solution PET à 8 % aient été électro-essorés. Lorsque l’électro-filage est terminé, coupez l’alimentation électrique et le moteur faisant tourner le mandrin. Coupez l’échafaudage biphasique avec une lame sur la largeur du mandrin pour produire une feuille d’échafaudage 2D de la taille de la surface du mandrin.

Pour préparer des échafaudages en PET alignés, chargez la seringue contenant 10 % de solution PET dans le pousse-seringue avec la pointe de l’aiguille en bas. Connectez ensuite la pince crocodile à l’aiguille. Réglez le débit à 0,5 millilitre par heure et amorcez l’aiguille avec une solution PET.

Allumez ensuite le moteur et réglez la vitesse d’essorage du mandrin sur 2000 tr/min. Ensuite, allumez le pousse-seringue. Réglez la tension d’alimentation à 14 kilovolts et allumez l’alimentation électro spin pendant quatre heures jusqu’à ce que deux millilitres de solution aient été électro-essorés.

Lorsque l’électro-essorage est terminé, coupez l’alimentation électrique et le moteur. Coupez l’échafaudage avec une lame sur la largeur du mandrin pour produire une feuille d’échafaudage 2D alignée. Rangez les échafaudages électro-filés dans du papier d’aluminium pour réduire la charge électrostatique.

À l’aide d’un stylo à biopsie de 0,8 millimètre de diamètre, on peut découper des disques d’échafaudages biphasiques ou alignés à partir des feuilles d’USP. Collez ensuite le disque d’échafaudage biphasique sur un joint à l’aide d’une colle d’aquarium non toxique. Placez les joints et les échafaudages dans une plaque de culture tissulaire à 12 puits.

Stérilisez les joints et les échafaudages à l’aide d’un rayonnement ultraviolet I pendant 30 minutes de chaque côté des échafaudages. Ensuite, trempez dans une solution antimycosique antibiotique à 20 % pendant la nuit à quatre degrés Celsius le lendemain. Lavez les échafaudages avec du PP S3 plusieurs fois et stockez-les dans du PBS à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient utilisés.

Transférez les échafaudages biphasiques du PBS dans une plaque fraîche à 12 puits et réchauffez-les dans un milieu DMEM complété par 10 % de FCS pendant une heure à 37 degrés Celsius. Retirez le milieu supplémenté en DMEM et placez la phase microfibre des échafaudages en ensemencement de 15 000 cellules de fibroblastes MRC dans 30 microlitres de milieu supplémenté en DMEM sur chaque échafaudage pour aider les fibroblastes à pénétrer dans l’échafaudage. Placez la plaque sur un agitateur orbital et agitez les échafaudages à 100 tr/min pendant deux heures.

Ajoutez ensuite deux millilitres de média supplémenté en DMEM à chaque échafaudage et incubez les échafaudages pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Le lendemain, retirez le média des puits et retournez les échafaudages de manière à ce que la phase nanofibre des échafaudages soit orientée vers l’apex. Ensuite, ensemencez 30 000 cellules épithéliales de Cali dans 30 microlitres de milieu D-M-E-M-F 12 complété par 10 % de FCS sur la phase nanofibre de l’échafaudage.

Incuber l’échafaudage pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone avant de les immerger dans un mélange de milieux D-M-E-M-F 12 et DMEM et de poursuivre l’incubation statique pendant 12 heures supplémentaires pour cultiver les voies respiratoires. Tout d’abord, transférez les échafaudages alignés du PBS dans une plaque fraîche à 12 puits et réchauffez-les ainsi que les milieux supplémentés en DMEM pendant une heure à 37 degrés Celsius. Retirez le milieu supplémenté en DMEM et ajoutez 25 000 cellules musculaires lisses des voies respiratoires dans 30 microlitres de milieu supplémenté en DMEM à chaque échafaudage et incubez-les pendant deux heures à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Une fois fixés, immergez les échafaudages dans un média supplémenté en DMEM. Remettez-les dans l’incubateur et laissez-les toute la nuit avant de mettre en place une triculture dans le bioréacteur. Le lendemain, placez l’échafaudage de semences biphasiques dans la chambre du bioréacteur avec la phase épithéliale vers le haut dans la chambre.

Placez ensuite l’échafaudage aligné sous l’échafaudage biphasique de manière à ce qu’il soit adjacent à la phase microfibre de l’échafaudage biphasique. Verrouillez les deux chambres du bioréacteur ensemble. Ensuite, assemblez deux circuits d’écoulement de perfusion dans un incubateur comme décrit dans le protocole de texte ci-joint et pompez des fluides autour des deux circuits à environ 0,1 millilitre par minute à l’aide d’une pompe péristaltique après une semaine.

Retirer le milieu de la chambre apicale et de la culture. Les cellules épithéliales à l’interface air-liquide pendant une semaine supplémentaire avant l’analyse après deux semaines dans le bioréacteur, l’échafaudage tri-culture montré ici a été fixé et sectionné pour montrer que les noyaux cellulaires répartis dans les trois couches des noyaux des cellules de construction ont été colorés avec DPI et apparaissent en bleu là où le matériau de l’échafaudage apparaît gris. Voici des images au microscope électronique à balayage de la microfibre de nanofibre filée et des échafaudages alignés qui ont été préparés pour l’ensemencement des cellules épithéliales, des fibroblastes et des cellules musculaires lisses respectivement.

Les trois types de cellules ont montré une augmentation de la viabilité lorsqu’ils ont été cultivés sur leurs échafaudages individuels sur une période de deux semaines. Ils ont également continué à exprimer des protéines spécifiques au type cellulaire après la période de culture de deux semaines. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de rechercher la matrice extracellulaire native que vous essayez de recréer avec les fibres électriques.

Les cellules se comportent différemment lorsqu’elles sont attachées à différentes topographies 3D. Par exemple, les cellules épithéliales ne formeront une barrière fonctionnelle que lorsqu’elles seront cultivées sur des nanofibres. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de construire un système de co-culture multicouche, qui peut être utilisé pour l’étude des interactions intercellulaires dans un environnement de culture dynamique.

N’oubliez pas qu’il est important d’adapter vos paramètres d’électrofilage, tels que le débit et la tension, en fonction du système de polymères et de solvants que vous avez l’intention d’utiliser lors de cette procédure. Ceci est crucial pour générer les fibres souhaitées. De plus, n’oubliez pas de choisir de faire tourner une hotte ou un placard ventilé pour permettre aux solvants d’être correctement extraits.