Observation du Mouvement ciliaire des cellules épithéliales plexus choroïde Ex Vivo

L’objectif général de l’expérience suivante est d’analyser le mouvement de la cellule épithéliale du plexus choroïde, Celia ex vivo. Ceci est réalisé en excisant d’abord le cerveau d’un embryon ou d’un chiot de souris pour isoler le tissu du plexus choroïde. Le mouvement ciliaire est visualisé par contraste interférentiel différentiel, ou microscopie DIC, puis un film numérique des pointes ciliaires est acquis pour le suivi manuel des positions des pointes ciliaires.

En fin de compte, les mouvements de pointe reconstitués du Celia sont catégorisés et quantifiés en fonction des modèles de leurs mouvements. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire, telles que : comment la mortalité de Celia est-elle contrôlée au cours du développement et comment le modèle de mobilité change-t-il au fil du temps ? L’implication de l’étendue de ces techniques était l’analyse physiologique du chemin et le diagnostic.

La Syrie a associé des maladies comme notre compréhension fondamentale de la Syrie cinétique est encore des éperons. Commencez par placer une souris néonatale rincée à 70 % d’éthanol, la tête dans du liebovitz L 15 glacé, un milieu dans un plat stérile de 10 centimètres immédiatement après la décapitation. Ensuite, utilisez une paire de pinces d’horloger pour retirer le cuir chevelu du crâne.

Ensuite, coupez le crâne par une section médiane le long de la suture longitudinale pour exposer le cerveau, suivi d’une coupe des nerfs crâniens pour prélever l’organe entier. Transférez le cerveau isolé dans une nouvelle boîte remplie de glace fraîche, de milieu froid, avec la face dorsale vers le haut et placez la boîte sous un microscope stéréoscopique. Orientez ensuite le tissu de manière à ce que les bulbes olfactifs soient positionnés à trois heures, et saisissez doucement le cerveau à l’aide de la pince horlogère.

De l’autre main, utilisez une pince à dissection fine pour couper les poons cérébraux reliant les hémisphères cérébraux au tronc cérébral. Pincez le Céphalon de Dion pour séparer davantage les hémisphères et placez la surface coupée vers le haut, puis tirez sur la lamina afia pour retirer le plexus choroïde ventriculaire latéral attaché au côté latéral de l’hippocampe. Lorsque le plexus choroïde a été isolé, transférez le tissu dans une boîte à fond en verre de 35 millimètres contenant du milieu frais, et placez un poids sur le tissu pour le maintenir doucement en place dans les 25 à 60 minutes suivant l’euthanasie, commencez l’imagerie en direct de la cellule épithéliale du plexus choroïde Célie, en ajustant la mise au point de la lentille de l’objectif à l’œil nu.

Ajustez le condenseur de manière à ce que le centre et la mise au point soient conformes à l’éclairage Kula. Insérez ensuite les éléments optiques appropriés dans le trajet lumineux pour qu’ils soient conformes à l’optique DIC. Déplacez le prisme DIC pour ajuster le contraste des images à une position où la structure de surface du tissu sera clairement reconnue.

Ensuite, basculez le chemin de la lumière sur la caméra vidéo et augmentez la puissance de la lumière. Avec la suppression des filtres à densité neutre, ajustez un champ d’observation et de mise au point, en réglant la résolution temporelle de la caméra vidéo à 200 hertz et le temps d’exposition à 0,1 milliseconde pour la période d’imagerie souhaitée. Ensuite, acquérez les images après l’obtention de la pile d’images, chaque image affichera une image claire de Celia pour suivre manuellement les modèles de battement de chaque cil.

À l’aide du pointeur de la souris, vous devez marquer la position des pointes ciliaires dans chaque image. Ensuite, à l’aide du logiciel approprié, analysez les données de trajectoire et classifiez les trajectoires dans l’un des deux modes de mouvement d’avant en arrière ou de rotation à l’œil. À l’aide de la formule, calculez la fréquence de battement ciliaire pour plusieurs cycles de battement ciliaire.

Comme les autres Célia sur la même cellule, cela peut interférer avec le mouvement de chaque cil. Ensuite, il s’agit d’analyser l’uniformité angulaire des axes de battement ciliaires au sein d’une seule cellule. Pour les trajectoires d’avant en arrière, les positions des pointes de Celia s’ajustent à une ligne droite, définissant thêta comme l’angle que la ligne forme avec l’axe X.

Pour les trajectoires de rotation, ajustez les positions à une ellipse en définissant thêta comme l’angle que le grand axe de l’ellipse forme avec l’axe x. Enfin, pour une description quantitative de chaque trajectoire, faites pivoter les trajectoires de thêta en définissant leurs rapports d’aspect comme les rapports entre les largeurs de leur distribution le long des axes x et y. Dans ce premier clip, une vue de dessus des cellules épithéliales du plexus choroïde avec Celia à partir d’un bébé souris du deuxième jour postnatal, imagée par microscopie vidéo à haute vitesse, montre que la surface irrégulière du tissu du plexus choroïde le rend visible à la fois dans les plans de mise au point et de flou.

Dans ce deuxième clip, une vue agrandie de la zone encadrée du film précédent est montrée, ce qui permet d’observer de plus près les mouvements de rotation et de va-et-vient présentés par le cil individuel. Ici, les trajectoires des mouvements représentatifs de la pointe ciliaire reconstituées à partir d’enregistrements vidéo sur plusieurs cycles sont présentées avec les trajectoires temporelles des coordonnées x et y des positions de la pointe tracées dans les graphiques. Pour démontrer un déphasage entre les deux coordonnées dans ces graphiques, les coordonnées x et Y ont été normalisées et superposées.

Bien que les CLIA mobiles soient facilement reconnues par l’imagerie en direct, il n’est pas facile d’identifier les CLIA non mobiles par cette méthode. Pour pallier cette difficulté, la microscopie électronique à balayage peut être indispensable pour obtenir des images entières des clia quelle que soit leur motilité. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’effectuer la dissection suffisamment rapidement pour que la fraîcheur de l’échantillon soit préservée et que la motilité de la Syrie soit maintenue.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la préparation d’échantillons de tissus avec des céréales virales, ainsi que de la surveillance et de la quantification de la mortalité du CX vivo.