Name: Observation du Mouvement ciliaire des cellules épithéliales plexus choroïde Ex Vivo (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min
Description: Découvrez l'analyse du mouvement ciliaire ex vivo des cellules épithéliales du plexus choroïde chez la souris. Cette méthode par microscopie DIC permet de quantifier les mouvements ciliaires et d'étudier leur contrôle développemental.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par un projet pour les universités privées : subvention du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie (MEXT) du Japon (T.I.) et subventions pour la recherche scientifique (C) du MEXT (S.T. et K.N).

Les protocoles et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire ont été approuvés par les soins des animaux et de l&#39;utilisation des comités institutionnels de l&#39;Université de Yamanashi et de l&#39;Université de Waseda. soins aux animaux a été effectuée conformément aux directives institutionnelles. 1. Préparation CPEC <ol><li> Préparer des appareils et des matériaux suivants: un microscope stéréo, de préférence capable de transmettre l&#39;illumination du fond; une paire de pinces horloger (Dumont N ° 3 ou n ° 4), la flamme stérilisé, des ciseaux d&#39;exploitation droites, flamme stérilisé; deux plats 10 cm en plastique stériles contenant 20 ml glacée moyen Leibovitz L-15; Plats à fond de verre de 35 mm contenant 2 ml RT Leibovitz milieu L-15; un bêcher de 100 ml contenant 70% d&#39;éthanol; souriceaux nouveau-nés. </li><li> Immerger brièvement une souris néonatale dans 70% d&#39;éthanol et euthanasier rapidement par décapitation en utilisant les ciseaux d&#39;exploitation. </li><li> Placez la tête immédiatement Leibovitz milieu L-15 glacée dans le stérile à 10 cm dish. </li><li> Retirer la peau des calvaria utilisant la paire de forceps horloger, ouvrir le crâne pour exposer le cerveau, et puis couper les nerfs crâniens pour isoler l&#39;ensemble du cerveau. </li><li> Transférer le cerveau à un nouveau plat contenant Leibovitz milieu L-15 glacée et observer au microscope stéréo, faire en sorte que le cerveau est complètement immergé dans le milieu. </li><li> Réglez la face dorsale du cerveau vers le haut, et d&#39;orienter le cerveau de sorte que les bulbes olfactifs résident à la position trois heures (pour les droitiers). Maintenez le cerveau en douceur avec la pince à la main gauche. </li><li> En utilisant les pinces à dissection fines (Dumont N ° 3 ou # 4) dans la main droite, couper le corps calleux et sous le parenchyme reliant les hémisphères cérébraux, le long de la fissure longitudinale du cerveau. </li><li> Poussez doucement les hémisphères cérébraux loin aux côtés latéraux et d&#39;exposer la fissure transversale cérébrale. </li><li> Séparer les hémisphères par pincement sur the parenchyme entre l&#39;hémisphère et le thalamus. </li><li> Tirez doucement sur le plexus choroïde ventriculaires latérales qui est attaché à la face latérale de l&#39;hippocampe par le affixa lamina. </li><li> Transférer les plexus choroïde isolés au plat à fond de verre de 35 mm contenant du milieu frais Leibovitz L-15, et superposer un poids (liste des matières) doucement pour maintenir le tissu en place. </li></ol> 2. imagerie en direct de CPEC Cilia <ol><li> Confirmez ultraviolet bon (UV) et le filtre (s) déduit (IR) de coupe pour bloquer la lumière inférieure à 400 nm et plus de 700 nm, et que la densité neutre (ND) filtres (25% et 6%) sont insérés dans le trajet de la lumière du microscope inversé. </li><li> Régler la netteté de l&#39;objectif plus ou moins à l&#39;oeil, et ensuite ajuster le condenseur afin que le centre et le foyer pour se conformer à l&#39;éclairage de Köhler. Insérer un contraste interférentiel différentiel approprié (DIC) prisme, un élément DIC, ainsi que des éléments de l&#39;analyseur et le polariseur dans le lichemin lutte pour se conformer à l&#39;optique DIC. </li><li> Régler le contraste de vue par la position du prisme DIC sorte que la structure de la surface du tissu est plus reconnaissable. Si tous les cils des cellules cibles sont mobiles, une vision claire des cils mobiles ne peut pas être obtenue par l&#39;œil en raison de leur mouvement. </li><li> Modifiez le chemin de lumière à la caméra vidéo, et de supprimer les filtres ND pour augmenter la puissance lumineuse. </li><li> Utilisez l&#39;appareil photo en mode de mise au point de régler le champ de vision et de concentration. Au cours de mise au point, dans lequel les images vidéo sont affichées en temps réel sur l&#39;écran, une vue claire des cils mobiles ne sont pas disponibles. </li><li> Utilisez l&#39;appareil photo à 200 Hz avec un temps d&#39;exposition de 0,1 ms pour la période souhaitée (secondes à quelques minutes). Après l&#39;acquisition de la pile de l&#39;image, des images uniques seront afficher structures ciliaires claires. Si bords ciliaires sont floues, d&#39;augmenter le taux de trame ou utiliser un temps d&#39;exposition plus courte. </li><li> Enregistrer le mouvement de CPEC cils au sein 25-60 minutes après l&#39;euthanasie en LeibovitzMilieu L-15. </li></ol> 3. Analyse du mouvement ciliaire <ol><li> Suivre manuellement battant motifs de chaque cil sur le moniteur de l&#39;ordinateur. Marquer les positions de pointe ciliaire dans chaque image avec le pointeur de la souris, qui sont assemblés pour obtenir des informations trajectoire de chaque cil. Soit analyser les informations trajectoire en utilisant le même logiciel ou l&#39;exportation vers d&#39;autres applications plus générales pour une analyse plus approfondie. L&#39;efficacité de cette étape d&#39;analyse est décrite dans la discussion. </li><li> Classer les trajectoires en deux modes de mouvement, de va-et-vient ou de rotation, par oeil. </li><li> Calculer la fréquence ciliaire de battage (CBF) en utilisant la formule suivante: [CBF = (nombre d&#39;images par seconde) / (nombre moyen d&#39;images pour un seul battement)] 14, qui peut être obtenu à partir d&#39;un schéma pointe ciliaire de mouvement (Figure 3 ). Répéter ce calcul pour de multiples cycles de battement ciliaire, parce que d&#39;autres cils sur la même cellule peut interférer avec le mouvement de chaque cilium, ce qui entraîne l&#39;irrégularité. </li><li> Pour analyser l&#39;uniformité angulaire du battement ciliaire axes dans une seule cellule, définir le θ de l&#39;angle de battement pour chaque trajectoire (Figure 4). Pour trajectoires de va-et-vient, adapter les postes de la pointe des cils à une ligne droite, et de définir l&#39;angle θ que la ligne fait avec axe x. Pour trajectoires de rotation, adapter les postes à une ellipse, et de définir l&#39;angle θ que l&#39;axe majeur de l&#39;ellipse fait avec axe x. Détails de la ferrure sont décrits dans la section des résultats représentatifs. </li><li> Pour une description quantitative de chaque trajectoire, calculer généralisée rapport d&#39;aspect AR. En bref, la trajectoire de rotation - θ et AR définir comme étant le rapport entre la largeur de la distribution le long de x - y et -axes (figure 4B). Les détails sont affichés dans la section des résultats représentatifs, et l&#39;interprétation, L&#39;importance et la limitation du paramètre sont décrites dans la discussion. </li></ol> 4. Préparation d&#39;échantillons pour MEB Remarque: SEM est une méthode importante pour évaluer l&#39;état des cils sur CPEC d&#39;une manière globale. Pour préparer des échantillons pour SEM, une procédure standard précédemment rapporté 15 est employé avec de légères modifications. <ol><li> Avant la dissection du tissu du cerveau, préparer le fixateur dans un flacon en verre de 5 ml avec un bouchon en polyéthylène. Le fixateur est constitué de 2% de paraformaldehyde, 2,5% de glutaraldéhyde (moitié de la solution de 16 Karnovsky) dans 0,1 M de tampon phosphate, pH 7,4. </li><li> Disséquer les tissus du cerveau, comme décrit dans l&#39;étape 1. </li><li> Rincer brièvement le tissu isolé avec une solution saline équilibrée de Hank (HBSS) dans un nouveau plat, puis fixer le tissu dans le fixateur dans le flacon de verre pendant 1 heure à température ambiante. Utilisez pipettes de transfert unique et manipuler les spécimens gently. Après rinçage dans HBSS, le tissu devient collant. <ol><li> Pour transférer les échantillons dans la solution de fixateur, lentement expulser une petite quantité de solution contenant le tissu de la pipette de transfert en gouttelettes et ajouter au fixateur. </li></ol></li><li> Après fixation, jeter le fixateur et rincer le tissu avec tampon phosphate trois fois. </li><li> Plonger le tissu dans une solution de saccharose à 10% pour se laver les aldéhydes restants. Pour assurer l&#39;élimination complète des aldéhydes, plonger les échantillons dans la solution pendant 10 min, puis répéter deux fois avec des produits frais 10% de saccharose. Cette étape est importante pour parvenir à post-fixation correcte dans les étapes suivantes. </li><li> Plonger le tissu dans une solution de 1% de tétroxyde d&#39;osmium dans un tampon phosphate pendant 30 min, puis placer sur la glace pour la post-fixation. Juger du degré de osmification par la couleur de l&#39;échantillon: quand aldéhydes sont complètement enlevés, l&#39;échantillon est noir. </li><li> Laver les échantillons de tissus postdéterminés abondamment avec double distilléed l&#39;eau plusieurs fois. </li><li> Déshydrater les échantillons par immersion dans des concentrations échelonnées d&#39;éthanol, généralement 65%, 75%, 85%, 95%, 99% et 100%, pendant 10 minutes chaque. Obtenir de l&#39;éthanol anhydre en plaçant des tamis moléculaires dans 99,5% d&#39;éthanol à partir d&#39;une bouteille nouvellement acheté. Répétez avec déshydratation de l&#39;éthanol anhydre à trois reprises. </li><li> Placer les échantillons déshydratés dans de l&#39;acétate d&#39;isoamyle, un réactif de substitution pour un séchage au point critique, pendant 10 min. Répéter deux fois cette étape. Ce réactif évapore rapidement et l&#39;échantillon peut devenir sèche, provoquant la destruction par la tension de surface. Par conséquent, ne pas sécher l&#39;échantillon complètement. </li><li> Après le dernier échange de l&#39;acétate d&#39;isoamyle, enlever la plupart du solvant, immédiatement envelopper le flacon en verre ouvert avec du papier d&#39;aluminium et placez le flacon sur glace sèche. En utilisant une aiguille ou une pince fine, faire plusieurs trous dans la feuille de recouvrement de l&#39;embouchure de la fiole, de telle sorte que le dioxyde de carbone liquide coule facilement dans la fiole dans le sécheur à point critique. Passez à l&#39;étape suivanteaussi vite que possible. </li><li> Dans cette étape, minimiser le report de l&#39;acétate d&#39;isoamyle dans la chambre de la sécheuse, mais ne laissez pas l&#39;échantillon sécher complètement avant séchage au point critique. En outre, ne pas laisser l&#39;échantillon sur de la glace sèche pour une inutilement beaucoup de temps pour éviter la formation de givre sur le flacon. </li><li> Transférer les flacons de verre papillote contenant les échantillons de tissus dans le sèche-linge au point critique qui assure la structure de la surface du tissu reste intact tandis que l&#39;eau contenue dans l&#39;élimination du tissu. Des informations détaillées sur le fonctionnement du sèche point critique peut être obtenu à partir des instructions du fabricant. </li><li> Manipulez les échantillons soigneusement à l&#39;aide d&#39;un cure-dent pour minimiser les dommages mécaniques. Les échantillons de tissus séchées résultantes sont fragiles. Montez les échantillons sur les moignons métalliques et manteau avec de l&#39;or-palladium en utilisant une pulvérisation d&#39;ions. </li></ol> 5. observation par MEB <ol><li> Observez par SEM et enregistrer des images avec un appareil photo numériqueéquipé d&#39;un microscope électronique à balayage. </li><li> Transférer des données d&#39;image numériques à un ordinateur pour analyse. </li></ol>

<ol><li>Nonami, Y., Narita, K., Nakamura, H., Inoue, T., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+changes+in+ciliary+motility+on+choroid+plexus+epithelial+cells+during+the+perinatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Developmental changes in ciliary motility on choroid plexus epithelial cells during the perinatal period.</a> Cytoskeleton. 70 (12), 797-803 (2013).</li>
<li>Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+roles+of+cilia+in+developmental+disorders+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The roles of cilia in developmental disorders and disease.</a> Development. 133 (21), 4131-4143 (2006).</li>
<li>Fliegauf, M., Benzing, T., Omran, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((When+cilia+go+bad%3A+cilia+defects+and+ciliopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">When cilia go bad: cilia defects and ciliopathies.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 8 (11), 880-893 (2007).</li>
<li>Oh, E. C., Katsanis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia+in+vertebrate+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cilia in vertebrate development and disease.</a> Development. 139 (3), 443-448 (2012).</li>
<li>Shah, A. S., Ben-Shahar, Y., Moninger, T. O., Kline, J. N., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motile+cilia+of+human+airway+epithelia+are+chemosensory%5BTitle%5D)+AND+%22Science%28New+York%2C+N.Y%29%22%5BJournal%5D)">Motile cilia of human airway epithelia are chemosensory.</a> Science(New York, N.Y). 325 (5944), 1131-1134 (2009).</li>
<li>Kiprilov, E. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+in+culture+possess+primary+cilia+with+hedgehog+signaling+machinery%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells in culture possess primary cilia with hedgehog signaling machinery).</a> The Journal of Cell Biology. 180 (5), 897-904 (2008).</li>
<li>Hirokawa, N., Tanaka, Y., Okada, Y., Takeda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nodal+flow+and+the+generation+of+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nodal flow and the generation of left-right asymmetry.</a> Cell. 125 (1), 33-45 (2006).</li>
<li>Narita, K., Kozuka-Hata, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+multiple+primary+cilia+reveals+a+novel+mode+of+ciliary+development+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of multiple primary cilia reveals a novel mode of ciliary development in mammals.</a> Biology Open. 1 (8), 815-825 (2012).</li>
<li>Takeda, S., Narita, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+vertebrate+cilia%2C+towards+a+new+taxonomy%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%3B+Research+in+Biological+Diversity%22%5BJournal%5D)">Structure and function of vertebrate cilia, towards a new taxonomy.</a> Differentiation; Research in Biological Diversity. 83 (2), S4-S11 (2012).</li>
<li>Ikegami, K., Sato, S., Nakamura, K., Ostrowski, L. E., Setou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+polyglutamylation+is+essential+for+airway+ciliary+function+through+the+regulation+of+beating+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Tubulin polyglutamylation is essential for airway ciliary function through the regulation of beating asymmetry.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (23), 10490-10495 (2010).</li>
<li>Foster, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+ciliary%2Fflagellar+beating+of+Chlamydomonas%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Analysis of the ciliary/flagellar beating of Chlamydomonas.</a> Methods in Cell Biology. 91, 173-239 (2009).</li>
<li>Lechtreck, K. -F., Sanderson, M. J., Witman, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+digital+imaging+of+ependymal+cilia+in+the+murine+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-speed digital imaging of ependymal cilia in the murine brain.</a> Methods in Cell Biology. 91, 255-264 (2009).</li>
<li>Okada, Y., Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observation+of+nodal+cilia+movement+and+measurement+of+nodal+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Observation of nodal cilia movement and measurement of nodal flow.</a> Methods in Cell Biology. 91, 265-285 (2009).</li>
<li>Chilvers, M. A., Rutman, A., O’Callaghan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+beat+pattern+is+associated+with+specific+ultrastructural+defects+in+primary+ciliary+dyskinesia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Ciliary beat pattern is associated with specific ultrastructural defects in primary ciliary dyskinesia.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 112 (3), 518-524 (2003).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetry+and+kinesin+superfamily+protein+KIF3A%3A+new+insights+in+determination+of+laterality+and+mesoderm+induction+by+kif3A-%2F-+mice+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetry and kinesin superfamily protein KIF3A: new insights in determination of laterality and mesoderm induction by kif3A-/- mice analysis.</a> The Journal of Cell Biology. 145 (4), 825-836 (1999).</li>
<li>Karnovsky, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+formaldehyde-glutaraldehyde+fixative+of+high+osmolarity+for+use+in+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use in electron microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 27, 137-138A (1965).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes. Ce document vise à communiquer l&#39;méthodologie détaillée pour observer la motilité des cils dans les tissus du plexus choroïde isolés. Nouveautés scientifiques ont été rapportés dans les études antérieures 1,8.

Perspectives de cette méthode Bien que la technique décrite ici ne prévoit pas une analyse plus détaillée des cils que les méthodes déjà publiées, la signification de cette technique réside dans la simplicité du système et l&#39;efficacité des coûts, qui peut être facilement appliquée au dépistage tout type de motilité ciliaire ex vivo. En particulier, TI Workbench fournit une interface simple et conviviale qui permet aux chercheurs d&#39;observer et d&#39;analyser la motilité cilia...

Les cils sont des projections ressemblant à des cheveux à la surface de la plupart des cellules de vertébrés, qui ont attiré l’attention des chercheurs médicaux en raison d’une classe de maladies appelées ciliopathies 2-4. Malgré l’expression omniprésente de l’organite, une grande variété de fonctions ciliaires ont été rapportées, y compris la motilité et la biodétection. Par exemple, les cils mobiles à la surface de la muco-épithélium transportent le mucus5 et les débris épithéliaux vers la sortie des tractus, prévenant ainsi les maladies en dégageant la surface des épithéliums. De plus, au cours des premières périodes de développement et des stades embryonnaires, les cils régulent la prolifération des cellules souches6 et sont impliqués dans la détermination de l’asymétrie gauche-droite du corps du vertébré7. 
Les cellules épithéliales du plexus choroïde (CPEC) sont des dérivés des cellules neuroépithéliales qui recouvrent la surface du tissu du plexus choroïde dans le cerveau, qui jouent un rôle important dans le maintien de l’homéostasie de l’environnement intracrânien par la production de liquide céphalo-rachidien (LCR). Il a déjà été démontré que les CPEC ont plusieurs cils non mobiles qui régulent la production de LCR par le biais de récepteurs couplés aux protéines G qui sont spécifiquement concentrés sur les cils8. Bien que ces cils aient été considérés comme des cils quiescents non mobiles, il a été découvert que certains cils CPEC présentent une motilité transitoire au cours de la période néonatale1. Cette découverte était très importante car elle a révélé que les cils dits non mobiles ne sont pas nécessairement immobiles dès le début du développement et pourraient présenter une motilité transitoire pendant des fenêtres de temps spécifiques, peut-être en réponse à des exigences et des fonctions physiologiques spécifiques9. Pour décrire précisément la nature motile des cils CPEC, il est nécessaire de développer un système d’observation ex vivo qui englobe l’analyse des profils cinétiques propres aux cils CPEC. 
En ce qui concerne la motilité, bien que plusieurs rapports techniques aient décrit des observations des cils mobiles de l’épithélium trachéal5,10, des flagelles unicellulaires mobiles11, des cils mobiles ditsconventionnels 12 et des cils ganglionnaires13, les méthodes analytiques détaillées applicables à des structures relativement ondulées telles que le plexus choroïde n’ont pas été bien documentées jusqu’à présent. De plus, une résolution temporelle élevée est nécessaire pour analyser le mouvement ciliaire des CPEC, dans lesquels des caméras à grande vitesse coûteuses sont indispensables. Pour contourner cette nécessité et simplifier la surveillance de la motilité ciliaire de divers types de cellules, une caméra à faible coût et à grande vitesse a été introduite, et une méthode facilement accessible et pratique pour enregistrer la motilité des cils mobiles, en particulier pour décrire la vitesse et le modèle de mouvement de chaque cil, a été développée1. De plus, le logiciel original d’analyse d’images « TI Workbench » a été utilisé ici pour faciliter l’analyse détaillée de la motilité. Collectivement, cette méthode fournit une nouvelle stratégie concise pour analyser le mouvement ciliaire avec la microscopie électronique à balayage corrélative (MEB), qui peut être adoptée dans un large éventail de recherches sur le cilium.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Réactifs requis</td></tr><tr><td colspan="4">pour l’imagerie de cellules vivantes</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">pour préparation MEB</td></tr><tr><td>ethanol</td><td>Wako Chemicals</td><td>057-00456</td><td></td></tr><tr><td>La solution saline équilibrée de Hank’s</td><td>Life Technologies</td><td>14170112</td><td></td></tr><tr><td>le paraformaldéhyde&nbsp ;</td><td>Merck</td><td>1040051000</td><td></td></tr><tr><td>glutaraldéhyde&nbsp ;</td><td>Nacalai tesque</td><td>17003-05</td><td></td></tr><tr><td>acétate d’isoamyle</td><td>Nacalai tesque</td><td>02710-95</td><td></td></tr><tr><td>Tamis moléculaires 4A 1/8&nbsp ;</td><td>Wako Chemicals</td><td>130-08655</td><td>pour la préparation de tampon phosphate d’éthanol anhydre</td></tr><tr><td>salin (PBS)</td><td>Tampon phosphate Sigma-Aldrich</td><td>D1408</td><td></td></tr><tr><td>, 0,1 M</td><td></td><td></td><td>Pour faire 100 ml, mélanger 19,0 ml de 0,1&nbsp ; M NaH2PO4 et 81,0 ml de 0,1 ; M Na2HPO4</sub</td></tr><tr><td>>monosodique phosphate (dihydraté)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31718-15</td><td></td></tr><tr><td>phosphate disodique (anhydre)</td><td>Nacalai tesque</td><td>31801-05</td><td></td></tr><tr><td>suclose</td><td>Nacalai tesque</td><td>30406-25</td><td></td></tr><tr><td>tétroxyde d’osmium</td><td>Nisshin EM</td><td>300</td><td></td></tr><tr><td>glace</td><td></td><td></td><td></td> carbonique</tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td colspan="4">Outils et matériaux pour la dissection</td></tr><tr><td colspan="4">pour l’imagerie en direct et la préparation MEB</td></tr> <tr><td>stéréomicroscope</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>essuie-tout</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Phi ; Plat</td><td></td><td></td><td></td>en plastique de 10</tr><tr><td>cm Bécher</td><td></td><td></td><td></td>de 100 ml</tr><tr><td>Ciseaux de commande droits</td><td>Sansyo</td><td>S-2B</td><td></td></tr><tr><td>Pince d’horloger</td><td>Dumont</td><td>N° DU-3 ou -4, INOX</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">pour l’imagerie de cellules vivantes</td></tr> <tr><td>plat à fond en verre</td><td>Matsunami Glass</td><td>D110300</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">pour la préparation MEB</td></tr> <tr><td>flacon en verre</td><td></td><td></td><td></td>alminum</tr><tr><td>de 5 ml avec bouchon en polyéthylène</td><td>Nichiden Rika-Glass</td><td>PS-5A</td><td></td></tr><tr><td>pipette de transfert</td><td>Samco Scientific</td><td>SM251-1S</td><td>pour transfert d’échantillon</td></tr><tr><td>cure-dent</td><td></td><td></td><td>pour transfert d’échantillon</td></tr><tr><td>pulvérisation ionique avec or-palladium</td><td>Hitachi</td><td>Sécheur point critique E-1030</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Hitachi</td><td>HCP-2</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[en-tête]</td></tr><tr><td colspan="4">Equipements et matériaux microscopiques</td></tr><tr><td colspan="4">pour l’imagerie de cellules vivantes</td></tr><tr><td>microscope inversé</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>100 W Boîtier et alimentation</td><td>Olympus</td><td>U-ULH et BH2-RFL-T3</td><td></td></tr><tr><td>100 W lampe au mercure</td><td>Ushio</td><td>USH103D</td><td></td></tr><tr><td>condenseur DIC, n.a. 0.55</td><td>Olympus</td><td>IX-LWUCD</td><td></td></tr><tr><td>obturateur électrique</td><td>Vincent Associates</td><td>VS35S22M1R3-24 et VMM-D1</td><td>obturateur manuel peuvent être utilisés.</td></tr><tr><td>Filtre passe-bande (400-700&nbsp ; nm, et phi ; 45&nbsp ; mm)</td> <td>Koshin Kagaku</td><td>C10-110621-1</td><td></td></tr><tr><td>Filtre ND (&Phi ; 45 mm)</td><td>Olympus</td><td>45ND6, 45ND25</td><td>combinaison de filtres ND 25 % et 6 % sont utilisés</td></tr><tr><td>objectif objectif (immersion dans l’eau) avec élément DIC</td><td>Olympus</td><td>UApo 40XW/340, n.a., 1.15 avec caméra vidéo haute vitesse IX-DPAO40</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Allied Vision Technologies</td><td>GE680</td><td>&#8805 ; Fréquence d’images de 200 Hz et temps d’exposition de 1 ms,</td></tr><tr><td>logiciel d’acquisition / analyse</td><td>d’images logiciel interne</td><td>TI Workbench</td><td>capable d’acquérir à des fréquences d’images élevées.</td></tr><tr><td>PC pour le contrôle / l’analyse de la caméra</td><td>Apple</td><td>Mac Pro</td><td></td></tr><tr><td>table d’isolation des vibrations</td><td>Meiritsu Seiki</td><td>AD0806</td><td></td></tr><tr><td>poids pour tissus</td><td>Warner Instruments</td><td>kits d’ancrage de tranche</td><td>Il peut être fabriqué avec une maille de nylon collée à une forme en U écrasée &Phi ; 0,5&nbsp ; mm fil de platine.</td></tr>verre <tr><td>de protection (poids alternatif pour le tissu)</td><td>Matsunami</td><td>sur commande</td><td>Un verre de protection peut être utilisé comme poids de tissu.</td></tr><tr><td colspan="4">pour MEB</>microscope</td></tr> <tr><td>inversé</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>microscope électronique à balayage</td><td>JEOL</td><td>JSM-6510</td><td></td></tr></tbody></table>

observation du mouvement ciliaire des cellules épithéliales plexus choroïde<em&gt; ex vivo</em

Observation of the Ciliary Movement of Choroid Plexus Epithelial Cells Ex Vivo

<classe p='jove_content'>Le plexus choroïde est situé dans la paroi ventriculaire du cerveau, dont la fonction principale est censée être la production de liquide céphalo-rachidien. Les cellules épithéliales du plexus choroïde (CPEC) recouvrant la surface du tissu du plexus choroïde hébergent plusieurs cils uniques, mais la plupart des fonctions de ces cils restent à étudier. Pour découvrir la fonction des cils CPEC en particulier en ce qui concerne leur motilité, un système d’observation ex vivo a été mis au point pour surveiller la motilité ciliaire pendant les périodes embryonnaire, périnatale et postnatale. Le plexus choroïde a été disséqué dans le ventricule cérébral et observé à l’aide d’un microscope à contraste vidéo équipé d’une optique de contraste interférentiel différentiel. Dans ces conditions, une méthode simple et quantitative a été développée pour analyser les profils mobiles des cils CPEC pendant plusieurs heures ex vivo. Ensuite, les changements morphologiques des cils au cours du développement ont été observés par microscopie électronique à balayage pour élucider la relation entre la maturité morphologique des cils et la motilité. Fait intéressant, cette méthode pourrait délimiter les changements dans le nombre et la longueur des cils, qui ont culminé au jour postnatal (P) 2, tandis que la fréquence des battements a atteint un maximum à P10, suivi d’un arrêt brutal à P14. Ces techniques permettront d’élucider les fonctions des cils dans divers tissus. Bien que des techniques similaires aient été publiées dans un précédent rapport1, la présente étude se concentre sur des techniques détaillées pour observer la motilité et la morphologie des cils CPEC ex vivo.

Vue d&#39;ensemble du flux de production est représenté sur la Figure 1, y compris les images des dispositifs. Observations de mouvement direct de CPEC Film 1 montre un film de CPEC isolés à partir d&#39;une souris périnatale et Movie 2 montre une vue agrandie des images dans le film 1. Il convient de noter que des conseils individuels ciliaires sont moins claires dans les images fixes par rappor...

Dans cette étude, une technique détaillée de microscopie optique a été optimisée pour l’observation et l’analyse en temps réel du mouvement des cils CPEC ex vivo, ainsi qu’une méthode de microscopie électronique pour l’analyse ultrastructurale.

Observation du Mouvement ciliaire des cellules épithéliales plexus choroïde<em&gt; Ex Vivo</em

The choroid plexus is located in the ventricular wall of the brain, the main function of which is believed to be production of cerebrospinal fluid. ...

L'objectif général de l'expérience suivante est d'analyser le mouvement des cellules épithéliales du plexus choroïde, cils ex vivo. Cela est réalisé en excisant d'abord le cerveau d'un embryon ou d'un jeune souriceau afin d'isoler le tissu du plexus choroïde. Le mouvement ciliaire est visualisé par contraste interférentiel différentiel, ou microscopie DIC, puis un film numérique des extrémités des cils est enregistré afin de suivre manuellement les positions des extrémités ciliaires.En fin de compte, les mouvements de la pointe reconstitués des cils sont classés et quantifiés selon les motifs de leurs déplacements. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire, telles que : Comment la mortalité des cils est-elle contrôlée durant le développement, et comment le motif de mobilité évolue-t-il au fil du temps ? L'implication de ces techniques s'étend à l'analyse et au diagnostic pathophysiologiques.Les maladies associées à la Syrie, car nos connaissances fondamentales sur la kinétique de la Syrie sont encore limitées. Commencez par placer une souris néonatale rincée à l'éthanol à 70 %, la tête dans du milieu Liebovitz L 15 glacé, dans une boîte stérile de 10 centimètres immédiatement après la décapitation. Ensuite, utilisez une pince de bijoutier pour retirer le cuir chevelu du crâne.Ensuite, ouvrir le crâne par une section médiane le long de la suture longitudinale afin d'exposer le cerveau, puis sectionner les nerfs crâniens pour prélever l'organe entier. Transférer le cerveau isolé dans une nouvelle boîte remplie de milieu frais et froid sur de la glace, avec la face dorsale vers le haut, et placer la boîte sous un microscope stéréo. Orienter ensuite le tissu de manière à ce que les bulbes olfactifs soient positionnés à trois heures, et saisir délicatement le cerveau avec une pince de bijoutier.Avec l'autre main, utilisez des pinces de dissection fines pour couper les pons cérébraux reliant les hémisphères cérébraux au tronc cérébral. Pincez le céphalon de Dion afin de séparer davantage les hémisphères et placez la surface coupée vers le haut, puis tirez sur la lamina affixa pour retirer le plexus choroïde des ventricules latéraux attaché au côté latéral de l'hippocampe. Une fois le plexus choroïde isolé, transférez le tissu dans une boîte de culture en verre de 35 millimètres contenant un milieu frais, et positionnez un poids sur le tissu pour le maintenir délicatement en place. Commencez l'imagerie en direct des cellules épithéliales ciliées du plexus choroïde dans un délai de 25 à 60 minutes suivant l'euthanasie, en ajustant manuellement la mise au point de l'objectif.Réglez le condenseur de manière à ce que le centre et la mise au point correspondent à l'éclairage Kula. Insérez ensuite les éléments optiques appropriés dans le trajet de la lumière pour respecter les optiques DIC. Déplacez le prisme DIC afin d'ajuster le contraste des images à une position où la structure de surface du tissu sera clairement reconnaissable.Ensuite, basculez le trajet de la lumière vers la caméra vidéo et augmentez la puissance lumineuse. Après avoir retiré les filtres neutres, réglez un champ d'observation et la mise au point, en configurant la résolution temporelle de la caméra vidéo à 200 hertz et le temps d'exposition à 0,1 milliseconde pour la période d'acquisition souhaitée. Ensuite, acquérez les images ; une fois la pile d'images obtenue, chaque image individuelle affichera une image nette des cils, permettant de suivre manuellement les motifs de battement de chaque cil.Utilisez le pointeur de la souris pour marquer la position des extrémités ciliées dans chaque image. Ensuite, à l'aide du logiciel approprié, analysez les données de trajectoire et classez les trajectoires en l'un des deux modes de mouvement : aller-retour ou rotationnel, à l'œil nu. À l'aide de la formule, calculez la fréquence de battement cilié pour plusieurs cycles de battement cilié.Comme d'autres cils sur la même cellule peuvent interférer avec le mouvement de chaque cil. Ensuite, analyser l'uniformité angulaire des axes de battement ciliaire au sein d'une seule cellule. Pour les trajectoires aller-retour, ajuster les positions des extrémités des cils à une droite, en définissant thêta comme l'angle que cette droite forme avec l'axe X.Pour les trajectoires de rotation, ajustez les positions à une ellipse en définissant thêta comme l'angle que l'axe majeur de l'ellipse forme avec l'axe des x. Enfin, pour une description quantitative de chaque trajectoire, faites pivoter les trajectoires d'un angle thêta et définissez leurs rapports d'aspect comme les rapports entre les largeurs de leur distribution selon les axes x et y. Dans ce premier extrait, une vue de dessus des cellules épithéliales du plexus choroïde portant des cils, provenant d'un souriceau de deux jours après la naissance et observées par microscopie vidéo à grande vitesse, est présentée ; la surface irrégulière du tissu du plexus choroïde rend les cils visibles à la fois dans les plans en focus et hors focus.Dans cette deuxième séquence, une vue agrandie de la zone encadrée de la vidéo précédente est montrée, permettant une observation plus détaillée des mouvements de rotation et de va-et-vient effectués par le cilium individuel. Ici, les trajectoires représentatives des déplacements de l'extrémité ciliaire, reconstituées à partir des enregistrements vidéo sur plusieurs cycles, sont présentées avec les courbes temporelles des coordonnées x et y des positions de l'extrémité tracées dans les graphiques. Afin de démontrer un déphasage entre les deux coordonnées dans ces graphiques, les coordonnées x et y ont été normalisées et superposées.Bien que les CLIA mobiles soient facilement reconnaissables par imagerie vivante, il n'est pas aisé d'identifier les CLIA non mobiles par cette méthode. Pour surmonter cette difficulté, la microscopie électronique à balayage peut s'avérer indispensable afin d'obtenir des images complètes des cils, indépendamment de leur mobilité. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'effectuer la dissection suffisamment rapidement pour préserver la fraîcheur de l'échantillon et maintenir la mobilité de Syria.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment préparer des échantillons de tissus avec du liquide viral, ainsi que comment surveiller et quantifier la mortalité du CX in vivo.

observation-ciliary-movement-choroid-plexus-epithelial-cells-ex

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Cette vidéo démontre le développement d’un modèle ex vivo de germination choroïdienne pour étudier l’angiogenèse microvasculaire oculaire. L’essai consiste à cultiver des explants d’yeux de souris contenant le tissu choroïde attaché à la sclérotique et à l’épithélium pigmentaire rétinien dans des conditions spécifiques qui favorisent la germination microvasculaire choroïdienne.

Essai de germination choroïde pour étudier la prolifération microvasculaire oculaire ex vivo

Cette vidéo montre la procédure d’isolement des cellules immunitaires des plexus choroïdes de souris. Cette procédure est utilisée dans la recherche en neuroimmunologie pour comprendre comment les cellules immunitaires du plexus choroïde affectent la santé du cerveau et diverses maladies neurologiques.

Isolement des cellules immunitaires des plexus choroïdes de souris

Source : Al Omran, A. J., et al. Imagerie en direct des cils épendymaux dans les ventricules latéraux du cerveau de la souris. J. Vis. Exp. (2015). Cette vidéo montre une technique d’imagerie en direct utilisant la microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) pour observer le battement des épendymes cils dans les sections sagittales du cerveau de souris. Les cils épendymaires propulsent le liquide céphalo-rachidien (LCR), et leur activité est enregistrée dans des coupes cérébrales...

Imagerie en direct de l’activité ciliaire des cellules épendymaires dans une coupe de cerveau de souris

Source : Van Wonterghem, E., et al. Microdissection et microscopie électronique à balayage à monture entière, visualisation du plexus choroïde de souris. J. Vis. Exp. (2022)Cette vidéo montre la préparation et l’imagerie du tissu du plexus choroïde à partir du cerveau d’une souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage (MEB). Le processus comprend la fixation des tissus, la déshydratation et l’enrobage d’une couche de platine conductrice pour stabiliser et préparer l’échantillon...

Visualisation du plexus choroïde du cerveau d’une souris à l’aide de la microscopie électronique à balayage

Utilisation de haute résolution contraste d'interférence différentiel (DIC) microscopie, un ex vivo observation du battement des cils épendymaire mobiles situés dans les ventricules du cerveau de souris est démontrée par live-imagerie. La technique permet un enregistrement de l'unique fréquence ciliaire battant et l'angle battant ainsi que leurs propriétés calcium intracellulaire oscillation de stimulation.

Imagerie en direct de la épendymaire Cilia dans les ventricules latéraux du cerveau de souris

Les cellules épithéliales du plexus choroïde (CP) forment la barrière hémato-céphalo-rachidien (BCSFB). Un modèle in vitro du BCSFB utilise des cellules de papillome du plexus choroïde humain (HIBCPP). Cet article décrit la culture et l’infection basolatérale des cellules HIBCPP à l’aide d’un système d’insertion filtrante de culture cellulaire.

Un plexus choroïde épithéliale Modèle base de cellules de la barrière Fluid Human Blood-céphalo-rachidien pour étudier l&#39;infection bactérienne du côté basolatéral

Le but du présent protocole est de démontrer la mise en culture de cellules épithéliales de (RPE) pigmentaire sur âgées et/ou malades humains la membrane de Bruch. Cette méthode convient à étudier le comportement de cellules RPE sur une matrice extracellulaire compromise.

Mise en culture des cellules épithéliales pigmentaire sur un modèle Ex Vivo de la Membrane de Bruch humain âgé

L’objectif de ce protocole est de caractériser un nouveau modèle de neurodégénérescence glaucomateuse basé sur une cautérisation thermique à 360° du plexus vasculaire limbique, induisant une hypertension oculaire subaiguë.

Cautérisation complète du plexus vasculaire limbique pour le glaucome induit chirurgicalement chez les rongeurs

Cette étude utilise la cytométrie en flux et deux stratégies de contrôle différentes sur des plexus choroïdes cérébraux perfusés isolés; ce protocole identifie les principaux sous-ensembles de cellules immunitaires qui peuplent cette structure cérébrale.

Isolement et caractérisation des cellules immunitaires des plexus choroïdes de souris micro-disséqués

Le plexus choroïde (CP), un tissu peu étudié en neurosciences, joue un rôle clé dans la santé et la maladie du système nerveux central. Ce protocole décrit une technique de microdissection pour isoler le CP et l’utilisation de la microscopie électronique à balayage pour obtenir une vue d’ensemble de sa structure cellulaire.

Microdissection et microscopie électronique à balayage à monture entière Visualisation du plexus choroïde de souris

Découvrez l'analyse du mouvement ciliaire ex vivo des cellules épithéliales du plexus choroïde chez la souris. Cette méthode par microscopie DIC permet de quantifier les mouvements ciliaires et d'étudier leur contrôle développemental.

Observation du Mouvement ciliaire des cellules épithéliales plexus choroïde

Explorer plus de vidéos