Le cerveau de rongeurs microinjection pour l'étude de substrats moléculaires de Motivé Comportement

L’objectif global de cette procédure est de fabriquer avec précision une canule et des micro-injecteurs, ainsi que d’effectuer correctement les micro-injections. Ceci est accompli en fabriquant d’abord une canule à une longueur appropriée. La deuxième étape consiste à découper et assembler les micro-injecteurs.

Ensuite, préparez des micro-injecteurs, des tubes et une pompe pour la micro-injection. La dernière étape consiste à terminer la micro-injection et à laisser passer une période de diffusion. En fin de compte, la micro-injection est utilisée pour injecter avec précision des réactifs dans la région cérébrale souhaitée, démontrant ainsi une manipulation appropriée.

Lors de la micro-injection, ce sera Ryan Poland, un étudiant de mon laboratoire. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal car des précautions particulières doivent être prises et toutes les étapes nécessitent une grande attention afin d’assurer un placement correct de la canule et l’emplacement de la microinjection. Pour préparer d’abord la canule, tracez une ligne de référence de 15 millimètres sur le ruban à l’aide d’un stylo à pointe fine.

Utilisez-le ensuite comme guide pour marquer les sections de 15 millimètres séquentiellement sur le tube avec un marqueur permanent pointu. Ensuite, encochez le tube de la canule en le touchant au disque de tronçonnage à rotation lente de l’outil rotatif. Aux points marqués, tournez la canule de 180 degrés et entaillez le côté opposé du tube.

Ne coupez pas complètement le tube car cela pourrait entraîner une occlusion. Ensuite, pliez brusquement le tube afin de le casser en sections de 15 millimètres. Tenez ensuite chaque extrémité de la canule perpendiculairement au disque coupé entre le pouce et l’index.

Faites pivoter le tube de la canule tout en touchant son extrémité à la surface du disque de tronçonnage pour générer une pointe émoussée. Par la suite, alésez les deux extrémités de la canule avec une aiguille biseautée de calibre 26 pour vous assurer que toutes les bavures ont été éliminées et que la canule n’est pas obstruée. Pour préparer l’obturateur, clamp une canule d’environ la moitié de la longueur avec des hémostats droits de poids moyen, posez l’hémostat verrouillé sur le banc de sorte que la canule soit perpendiculaire au banc.

Ensuite, introduisez une extrémité du fil d’ator dans la canule jusqu’à ce qu’elle atteigne le banc. Pliez le fil en pinçant avec les doigts jusqu’à ce qu’un angle de 30 degrés soit atteint tout en maintenant le contact entre l’obturateur et le banc. Après cela, retirez le fil de la canule et coupez la partie excédentaire à 2,5 millimètres du pli avec de petits couteaux diagonaux.

Dans cette procédure, tenez une extrémité du tube du micro-injecteur perpendiculairement avec un hémostat droit verrouillé. Tournez un hémostat tout en maintenant la tension sur le tube et enroulez-le fermement autour de l’hémostatique au moins une fois. Ensuite, mesurez 32 millimètres de l’extrémité libre opposée du tube du micro-injecteur et saisissez ce point perpendiculairement avec un deuxième hémostat.

Pliez le tube d’avant en arrière tout en maintenant la tension jusqu’à ce qu’il se brise. Ensuite, inspectez le tube du micro-injecteur pour vous assurer que les deux extrémités sont droites et que le diamètre intérieur n’est pas obstrué. Tracez une ligne de référence de cinq millimètres sur le ruban à mesurer et marquez séquentiellement des sections de cinq millimètres du tube de la canule à l’aide d’un marqueur permanent.

Ensuite, touchez le tube de la canule au disque de tronçonnage à rotation lente à des points marqués afin d’entailler le tube. Ensuite, pliez brusquement le tube du collier du micro-injecteur afin de le casser en sections de cinq millimètres. Glissez un collier sur chaque tube de micro-injecteur à environ deux centimètres de l’extrémité.

Appliquez une petite quantité de super colle sur le tube du micro-injecteur à cinq millimètres d’une extrémité. Ensuite, glissez le collier sur la perle de super colle de manière à ce qu’il se trouve à un millimètre de l’extrémité du tube de micro-injection. Après cela, couvrez les deux extrémités du collier avec de la colle.

Fixez ensuite une aiguille de calibre 26 à la seringue d’un millilitre remplie d’eau stérile. Et glissez le morceau de huit centimètres de tube en plastique du micro-injecteur sur l’aiguille, en veillant à ne pas percer le tube après quoi glissez l’autre extrémité du tube en plastique sur l’extrémité du collier du micro-injecteur séché. Poussez le piston de la seringue rempli d’eau pour tester le brevet C.In cette étape, pliez le micro-injecteur terminé à 15 millimètres de l’extrémité opposée au collier de 95 degrés.

Ensuite, coupez le tube en plastique à 70 centimètres et faites-le glisser sur le collier du micro-injecteur. Pour préparer la pompe à la micro-injection, réglez le diamètre de l’aiguille de micro-injection du débit de perfusion souhaité et le volume d’injection cible sur le tube. Réglez ensuite le mode de pompe sur volume afin qu’un volume précis soit délivré automatiquement.

Ensuite, ajustez la butée arrière de la pompe pour permettre à la seringue d’être remplie au volume d’injection plus 0,2 microlitre supplémentaire. Placez maintenant l’extrémité de la seringue étanche dans l’eau stérile contenue dans un petit bateau de lactosérum et agitez doucement le piston pour lubrifier uniformément le fil interne. Tirez le piston vers la butée arrière de la pompe pour remplir l’aiguille de micro-injection d’eau.

Diapositive suivante. Le tube PE 20 qui est relié au micro-injecteur sur une aiguille de calibre 26 attachée à une seringue remplie d’eau stérile d’un millilitre. Vaporisez de l’eau stérile à travers le micro-injecteur et inspectez le modèle et la distance de pulvérisation.

Placez ensuite un micro-injecteur stérilisé sur un champ stérile. Faites glisser le tube de l’aiguille, coupez le tube sous la zone endommagée par l’aiguille tout en le maintenant droit pour éviter que l’eau ne s’écoule. Ensuite, poussez légèrement le piston de la seringue de micro-injecteur vers l’avant pour créer une gouttelette à l’extrémité de l’aiguille et faites glisser le tube PE 20 rempli d’eau sur l’aiguille.

Après cela, poussez complètement le piston vers l’avant pour préparer le chargement de l’échantillon et assurez-vous qu’il ne reste pas d’éthanol à l’état de traces dans le micro-injecteur. Vérifiez que le réglage ne fuit pas en touchant plusieurs fois la gouttelette d’eau qui se forme à l’extrémité du micro-injecteur avec une lingette de laboratoire propre. Tirez ensuite le piston de la seringue vers l’arrière de 0,2 microlitre pour créer une bulle entre l’eau stérile et le tube PE 20 et la solution à injecter.

Après cela, placez le micro-injecteur dans le réactif à injecter et tirez lentement le piston de la seringue vers la butée arrière. Pour préparer l’animal à l’injection, tenez la poitrine du rat contre la poitrine de l’expérimentateur. Nettoyez la zone autour de la canule avec un applicateur en coton imbibé de bétadine.

Tamponnez le capuchon de la tête trois fois avec de la bétadine, puis frottez deux fois avec de l’éthanol. Placez ensuite le micro-injecteur rempli dans la canule. Appuyez sur le bouton de démarrage de la pompe de micro-injection et surveillez le mouvement des bulles.

Lorsque l’injection est terminée, retirez le micro-injecteur de la canule et remplacez-le par un obturateur. Cette figure montre la transfection de la région des astrocytes du noyau accumbens par un virus micro-injecté, et cette figure montre la réduction de la motivation des rats à s’auto-administrer de l’éthanol en activant un transgène qui était surexprimé dans le noyau accumbens. L’activation de la peur par l’administration systémique de CNO a considérablement réduit la motivation des rats à s’auto-administrer de l’éthanol après l’abstinence par rapport à la CNO du véhicule, ce qui n’a eu aucun effet dans une cohorte également entraînée qui exprimait la GFP au lieu de la crainte qu’elle avait une fois maîtrisée.

Cette technique peut permettre des outils de micro-injection cérébrale personnalisés et une plus grande flexibilité des procédures expérimentales. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler qu’il est impératif de localiser précisément la micro-injection pour obtenir l’effet souhaité.