Name: Le cerveau de rongeurs microinjection pour létude de substrats moléculaires de Motivé Comportement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Apprenez la microinjection cérébrale chez les rongeurs éveillés pour étudier les substrats moléculaires du comportement motivé et des troubles psychiatriques. Cette méthode précise permet de fabriquer des canules et des micro-injecteurs sur mesure.

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MSB est soutenu par l’Alcohol Beverage Medical Research Foundation, un prix du Center for Translational Research Award (UL1 TR000058), les National Institutes for Alcohol Abuse and Alcoholism (P50 AA022537) et des fonds de démarrage fournis par le Virginia Higher Education Equipment Trust Fund et la VCU School of Medicine.

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<li>Connor, E. C., Chapman, K., Butler, P., Mead, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+predictive+validity+of+the+rat+self-administration+model+for+abuse+liability%29%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Biobehav+Rev%22%5BJournal%5D)">The predictive validity of the rat self-administration model for abuse liability).</a> Neurosci Biobehav Rev. 35 (3), 912-938 (2011).</li>
<li>Watson, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockade+of+dopamine+D3+receptors+enhances+while+D2+receptor+antagonism+impairs+social+novelty+discrimination+and+novel+object+recognition+in+rats%3A+a+key+role+for+the+prefrontal+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">Selective blockade of dopamine D3 receptors enhances while D2 receptor antagonism impairs social novelty discrimination and novel object recognition in rats: a key role for the prefrontal cortex.</a> Neuropsychopharmacology. 37 (3), 770-786 (2012).</li>
<li>Takahashi, A., Shimamoto, A., Boyson, C. O., DeBold, J. F., Miczek, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA%28B%29+receptor+modulation+of+serotonin+neurons+in+the+dorsal+raphe+nucleus+and+escalation+of+aggression+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">GABA(B) receptor modulation of serotonin neurons in the dorsal raphe nucleus and escalation of aggression in mice.</a> J Neurosci. 30 (35), 11771-11780 (2010).</li>
<li>Spencer, R. C., Klein, R. M., Berridge, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Psychostimulants+act+within+the+prefrontal+cortex+to+improve+cognitive+function%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Psychostimulants act within the prefrontal cortex to improve cognitive function.</a> Biol Psychiatry. 72 (3), 221-227 (2012).</li>
<li>Bowers, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activator+of+G+protein+signaling+3%3A+a+gatekeeper+of+cocaine+sensitization+and+drug+seeking%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activator of G protein signaling 3: a gatekeeper of cocaine sensitization and drug seeking.</a> Neuron. 42 (2), 269-281 (2004).</li>
<li>Abudara, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+connexin43+mimetic+peptide+Gap19+inhibits+hemichannels+without+altering+gap+junctional+communication+in+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The connexin43 mimetic peptide Gap19 inhibits hemichannels without altering gap junctional communication in astrocytes.</a> Front Cell Neurosci. 8, 306(2014).</li>
<li>Cahill, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((D1R%2FGluN1+complexes+in+the+striatum+integrate+dopamine+and+glutamate+signalling+to+control+synaptic+plasticity+and+cocaine-induced+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">D1R/GluN1 complexes in the striatum integrate dopamine and glutamate signalling to control synaptic plasticity and cocaine-induced responses.</a> Mol Psychiatry. 19 (12), 1295-1304 (2014).</li>
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<li>Bedford, J. A., Bailey, L. P., Wilson, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cocaine+reinforced+progressive+ratio+performance+in+the+rhesus+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Biochem+Behav%22%5BJournal%5D)">Cocaine reinforced progressive ratio performance in the rhesus monkey.</a> Pharmacol Biochem Behav. 9 (5), 631-638 (1978).</li>
</ol>

Aucun des auteurs n’a d’intérêts concurrents ou conflictuels.

La procédure présentée ici est un moyen efficace pour la fabrication de micro-injection canules et microinjecteurs qui aideront à élucider les substrats moléculaires de comportement motivé. Cette méthode offre plusieurs avantages. D&#39;abord, par la fabrication propres implants et microinjecteurs de un, de nouveaux paramètres expérimentaux peuvent être rapidement optimisées;-à-dire, on n&#39;a pas besoin d&#39;attendre pour les composants sur mesure pour arriver. Deuxièmement, en raison du faible diamètre de la canule, plus canules peuvent être implantés simultanément. Cela raccourcit le temps chirurgical nécessaire, ce qui peut améliorer la survie, et permet également de multiples implants par animal. Troisièmement, le logiciel utilisé pour contrôler les chambres opératoires accueille facilement les horaires de rapport progressistes depuis un ratio paradigme fixe peut être rapidement converti en un ratio paradigme progressive en appliquant simplement une liste de paramètres de transition de l&#39;événement qui contient le programme de renforcement souhaitée. Êtrelargement utile, un procédé de micro-injection a été présenté générique qui devrait être largement applicable pour la micro-injection de presque n&#39;importe quel réactif actuellement disponibles. Par conséquent, nous prévoyons que cette technique continuera d&#39;être d&#39;une grande utilité similaire à l&#39;avenir avec des modifications mineures. En changeant seulement quelques variables, cette approche peut être appliquée à un grand nombre de réactifs. Les paramètres qui le plus souvent être manipulées comprennent la longueur du micro-injecteur qui fait saillie à partir de la canule, le volume de l&#39;injection et la vitesse d&#39;injection. Par exemple, on peut vouloir l&#39;injecteur pour faire saillie plus loin de la pointe de la canule pour éviter la cicatrice gliale qui forme généralement autour des implants chroniques. En outre, on peut souhaiter pour injecter un volume plus important. Pour les micro-injections de virus du striatum, un volume de 1 ul est habituellement utilisé et ce volume est typiquement injecté sur une période de temps plus longue (souvent 7-10 min plus 3-10 min temps de diffusion supplémentaire) par rapport à l&#39;utilisation queD pour les réactifs pharmacologiques (généralement 0,3 - 0,5 pi plus de 2 - 3 min plus 1 - 3 min temps de diffusion supplémentaire). L&#39;utilisateur devrait consulter la littérature et / ou empiriquement déterminer les paramètres les mieux adaptés à leurs besoins. Peu importe, le succès de cette procédure dépend essentiellement de 4 variables: 1) la longueur de la canule, 2) la longueur de microinjecteur, 3) la qualité du modèle microinjecteur de pulvérisation, et 4) l&#39;intégrité du système avant l&#39;injection. Parce emplacement de micro-injection est fonction de la profondeur que le micro-injecteur fait saillie à partir de la canule, il est impératif que les deux canules (étape 1.2.8) et la longueur de micro-injecteur (post-flexion, l&#39;étape 2.2.1) sont à la fois connue avec précision et uniforme entre tous les sujets . Cela peut facilement être contrôlé par facilement rejeter tout mettre en œuvre ce ne est pas la longueur nécessaire à la ré-mesure finale. En outre, l&#39;emplacement d&#39;injection ne peut être prédit si elle se produit immédiatement en dessous de la canule de guidage. Ainsi, toute microinjecteur That Does pas vaporiser une longue, mince filet sur des tests (étapes 2.4.6) devraient être rejetées. Une injection de qualité est également liée à l&#39;intégrité du système avant l&#39;injection. Si après la distribution toute l&#39;eau de l&#39;injecteur (avant le remplissage avec le réactif) multiples taches sont observées sur le laboratoire-essuyer, puis une fuite doit être corrigée (Note sur l&#39;étape 2.4.8). En outre, si la bulle (étape 2.4.9) qui sépare le médicament à partir de l&#39;eau dans la tubulure PE20 est pas une, bulle unique (après remplissage de la micro-injecteur ayant réactif), puis l&#39;injecteur est partiellement obstrué. Ce sabot pourrait prévenir ou détourner l&#39;injection. Cela aussi peut être aisément remédié (Note sur l&#39;étape 2.4.8). Si l&#39;on veut micro-injection alors que l&#39;animal est dans le cadre stéréotaxique il ya trois alternatives. En premier lieu, on pourrait augmenter la longueur du col de micro-injecteur de telle sorte qu&#39;il peut être tenu fermement par le manipulateur stéréotaxique et également prolonger suffisamment loin pour permettre la connexion à un tube PE20. D&#39;autre part, sure temporellement pourrait implanter une canule et d&#39;utiliser la norme microinjecteur présenté ici. Troisièmement, on pourrait utiliser dessinée et des pipettes en verre poli. 16,17 Une limitation importante de la procédure présentée ici est qu&#39;il est mieux menée chez le rat bien gérées qui sont familiers avec la procédure. Les rats utilisés pour les données décrites dans la section des résultats nécessaires pas de procédures spéciales de manipulation parce que le même enquêteur manipulé des rats sur une base quotidienne pendant plus de 2 mois. Cela comprenait l&#39;observation quotidienne et la manipulation de l&#39;implant chirurgical pendant au moins 2 semaines. Cependant, les rats peuvent être habitués rapidement par un certain nombre de techniques qui sont utilisées pour avant l&#39;essai d&#39;inhibition de pré-impulsion, qui peut être affecté par le stress. Ces techniques d&#39;habituation spéciales ont été bien détaillé précédemment. 43 En plus de ces procédures, il est conseillé que les rats sont habitués à la procédure de microinjection où microinjecteurs raccourcis sont utilisés duanneau injections «fictives». Au cours de ces injections simulées, il est essentiel que le microinjecteur pas dépasser dans le tissu afin de limiter les dommages aux tissus. En d&#39;autres termes, le micro-injecteur ne doit pas être plié plus de 14 mm. Ainsi, l&#39;accoutumance complet requis pour la mise en oeuvre optimale de cette technique peut être considérée comme une limitation. Bien que plusieurs paradigmes comportementaux existent pour mesurer la motivation, le rapport progressif est couramment utilisé pour quantifier l&#39;effort que l&#39;objet est disposé à exercer pour obtenir un renforcement. Le ratio paradigme progressif produit une mesure connue sous le nom de point d&#39;arrêt, qui est souvent défini comme le nombre maximal de presses à levier dans le dernier rapport complété;..-À-dire, répondre maximale qui a généré un renforçateur 21 Le ratio progressive est sensible à renforçateur grandeur. Par exemple, la cocaïne supérieur (ou saccharose) doses produisent un point d&#39;arrêt supérieur et de la cocaïne inférieure (ou saccharose) doses donnent une breakp inférieureoint. 21,22 conséquent, point d&#39;arrêt est un proxy utilisé couramment pour la motivation et / ou l&#39;efficacité de renforcement. 21,23-26 Parce que l&#39;intention du point d&#39;arrêt est de déterminer quand l&#39;animal cesse de répondre, un paramètre important du rapport progressive paradigme est durée de la session. Longueurs de session finis peuvent mettre un faux plafond sur les valeurs de point d&#39;arrêt, ce qui peut être exacerbée par des pré-traitements qui diminuent anormalement le taux d&#39;auto-administration ou cette augmentation post-renforcement pause. Cette confondre peut être surmonté par un certain nombre d&#39;approches;.. Par exemple, des séances qui se terminent lorsque l&#39;animal a retenu répondre par un multiple de l&#39;intervalle moyen entre perfusion 44 Une variante plus couramment appliquée de cette approche est de mettre fin à des sessions fois répondre a été retenu par une valeur déterminée de façon empirique qui est maintenue constante dans toutes les disciplines. Nous avons fourni la méthode à appliquer cette approche à l&#39;étape 4.4.9.11.

Les rongeurs et les humains réagissent de manière remarquablement similaire aux stimulicomportementaux 1-3. Cela suggère que les rongeurs sont des sujets appropriés pour élucider les substrats moléculaires du comportement et des conditions psychiatriques complexes4. Comprendre les substrats moléculaires de processus comportementaux complexes, tels que la motivation, nécessite souvent une micro-injection cérébrale. La technique de micro-injection cérébrale et un test de motivation primaire seront présentés ici. Les rats seront utilisés comme sujets, mais ces procédures peuvent facilement être adaptées aux souris bien manipulées. Il s’agit ici de procédures pour la fabrication des canules, des obturateurs (canules factices ou stylets) et des micro-injecteurs. La méthode présentée est nettement plus flexible et plus rentable que les outils préfabriqués. Cette flexibilité s’avérera précieuse lors de l’optimisation des conditions. Surtout, parce que la procédure de micro-injection peut être utilisée pour tester une myriade d’hypothèses ; Les techniques présentées ici devraient être largement applicables. Par exemple, les ligands des récepteurs peuvent être micro-injectés pour comprendre la neurochimie3,5,6 ; des peptides perméables aux cellules et de petites molécules peuvent être micro-injectés pour comprendre les voies de signalisation intracellulaires7-10 ; Des toxines, des inhibiteurs de canaux ioniques ou des cocktails d’antagonistes peuvent être micro-injectés pour comprendre les circuits1,11,12.
Bien que le protocole générique présenté ici puisse être facilement adapté par l’utilisateur à ses besoins particuliers, la procédure est particulièrement bien adaptée aux tests comportementaux puisque la micro-injection se produit chez les rongeurs éveillés qui ne sont que sous une légère contention des mains. Aucune anesthésie ou contention spéciale n’est requise. Cela est possible parce que le cerveau lui-même manque de sensation de douleur. Cependant, si l’anesthésie n’est pas utilisée, la micro-injection doit se faire à travers des canules qui ont été préalablement implantées de manière stéréotaxique. En effet, des nocicepteurs sont présents sur le cuir chevelu, les méninges, qui sont les membranes entourant le cerveau, et le périoste, qui est la membrane recouvrant le crâne. Il est à noter qu’une micro-injection sous anesthésie est parfois souhaitable. Par exemple, lorsque le virus est injecté, et l’on peut souhaiter injecter le virus directement à l’aide d’aiguilles en acier inoxydable15 ou de pipettes en verre, car cela peut réduire les lésions tissulaires et améliorer l’efficacité de la transduction. 16,17 Les micro-injecteurs décrits ci-dessous peuvent être modifiés à cette fin et des suggestions sur la façon de procéder peuvent être trouvées dans la discussion. Étant donné que d’autres articles de JoVE ont démontré l’implantation d’une canule cérébrale stéréotaxique,18-20 ces procédures ne seront pas couvertes ici.
Nous présentons ces procédures de micro-injection avec un test qui quantifie la motivation. Plusieurs modèles de comportement motivé chez les rongeurs sont actuellement utilisés, tels que la boîte de piste et l’échelle de barrière. Ici, nous décrivons comment utiliser un programme de renforcement à rapport progressif opérant pour quantifier la motivation lorsque la réponse opérante est maintenue par un renforçateur. La réponse sur le rapport progressif est sensible à l’amplitude du renforçateur. 21,22 En conséquence, ce test est couramment utilisé comme indicateur de la motivation et/ou du renforcement de l’efficacité. 21,23-30 Étant donné que plusieurs excellentes revues ont traité ce sujet en détail,21,24 nous nous concentrerons principalement sur les questions pratiques.

<table><tbody><tr><td>Tube de canule</td><td>Amazon Supply/ Petites pièces</td><td>HTXX-26T-60</td><td>26 G, Hypotube S/S 316-TW 26GA</td></tr><tr><td>Obturateur</td><td>Amazon Supply/ Petites pièces</td><td>GWXX-0080-30-05</td><td>Calibre 33, Fil S/S 316LVM 0.008 IN</td></tr><tr><td>Fil de micro-injecteur</td><td>MicroGroup</td><td>33RW 304</td><td>Calibre 33</td></tr><tr><td>Super Glue</td><td>Loctite</td><td>3924AC</td><td>Liquide, Non-gel, peut être autoclavé</td></tr><tr><td>Tube en plastique de micro-injecteur</td><td>Becton Dickson</td><td>427406</td><td>PE20</td></tr><tr><td>Hémostats de poids moyen</td><td>World Precision Instruments</td><td>501241-G</td><td></td></tr><tr><td>Ruler</td><td>Fisher</td><td>09-016</td><td>150 mm</td></tr><tr><td>#7 Forceps</td><td>Stoelting</td><td>52100-77</td><td>Dumont, Dumostar</td></tr><tr><td>Outil rotatif</td><td>Dremmel</td><td>285</td><td></td></tr><tr><td>Disque de tronçonnage</td> à deux vitesses <td>McMaster Carr</td><td>3602</td><td>15/16 » x 0.025 »</td></tr> <tr><td>Pompe de micro-injection</td><td>Harvard Apparatus</td><td>PhD 2000</td><td></td></tr><tr><td>1 ul Seringue en verre</td><td>Hamilton</td><td>7001KH</td><td>Style d’aiguille : 25s/2.75"/3</td></tr><tr><td>Applicateur à pointe de coton</td><td>Fisher</td><td>23-400-101</td><td></td></tr><tr><td>Lingettes de laboratoire</td><td>Kimwipes</td><td>34133</td><td></td></tr><tr><td>Logiciel opérant</td><td>Coulbourn</td><td>Chambres opérantes d’état</td><td></td>graphique</tr><tr><td></td><td>Coulborun</td><td>Habitest</td><td></td></tr></tbody></table>

le cerveau de rongeurs microinjection pour l&#39;étude de substrats moléculaires de motivé comportement

Rodent Brain Microinjection to Study Molecular Substrates of Motivated Behavior

La micro-injection cérébrale peut aider à élucider les substrats moléculaires de comportements complexes, tels que la motivation. À cette fin, les rongeurs peuvent servir de modèles appropriés, en partie parce que la réponse aux stimuli pertinents sur le plan comportemental et les circuits analysant les résultats stimulus-action sont étonnamment similaires entre les humains et les rongeurs. Dans l’étude de substrats moléculaires de comportements complexes, la micro-injection de réactifs qui modifient, augmentent ou réduisent au silence des systèmes spécifiques est une technique inestimable. Cependant, il est crucial que le site de micro-injection soit ciblé avec précision afin de faciliter l’interprétation des résultats. Nous présentons une méthode pour la fabrication d’instruments chirurgicaux et d’aiguilles de micro-injection qui permet une micro-injection précise et une personnalisation illimitée à un coût minimal. Il est important de noter que cette technique peut être réalisée avec succès chez des rongeurs éveillés si elle est menée en conjonction avec d’autres articles de JoVE qui couvrent les procédures chirurgicales requises. De plus, il existe de nombreux paradigmes comportementaux qui sont bien adaptés pour mesurer la motivation. Le rapport progressif est une méthode couramment utilisée qui quantifie l’efficacité d’un renforçateur pour maintenir la réponse malgré une augmentation (souvent exponentielle) des exigences de travail. Ce test est sensible à l’amplitude du renforçateur et aux manipulations pharmacologiques, ce qui permet de déterminer l’efficacité et/ou la motivation du renforcement. Nous présentons également une approche simple de la programmation d’un logiciel opérant pour s’adapter à un calendrier de renforcement à rapport progressif.

Ici, nous montrons des exemples de résultats qui peuvent être obtenus avec le procédé ci-dessus. Montré premier est un quartier typique qui est transfectées par des vecteurs viraux (Figure 3). En général, un volume de ~ 1 transfectées 3 mm est obtenue dans un tissu striatal. Le volume de la région transfectée peut être quantifiée à travers des sections en série à l&#39;aide de la méthode de Cavalieri 32 Fait important, le volume transfectées dépend de nombreux facteurs tels que le type de tissu étant transfectée. sérotype viral; promoteur; débit et le volume injecté; nombre de particules injectées; injecter pH; et si réactifs hyperosmolaires, tels que le mannitol, ont été utilisés. 33,34 Typiquement, nous micro-injection 10 12 particules / ml, 1 pl / latéraux plus de 10 min, et laissez 7 min supplémentaires avant de remplacer obturateurs. En outre, le produit à injecter est généralement autour de pH 8. Ensuite, nous montrons que la motivation peut être manipulé par soit l&#39;expression du transgène (figure 4)ou une micro-injection de réactif pharmacologique (figure 5). Dans la figure 4, nous avons exprimé un récepteur Designer Exclusivement Activé par Designer Drugs (de DREADDs). La région codante du récepteur a été suivie par DREADD un site d&#39;entrée de ribosome interne et une cassette mCitrine. Le mCitrine permet la visualisation commode de cellules transfectées. Le DREADD a été couplé à la protéine G hétérotrimérique-Gaq. Activation du couplage DREADD Gaq peut stimuler les astrocytes, 28,35 et la DREADD lui-même peut être activé par l&#39;administration systémique de la clozapine N-oxyde (CNO, 3 mg / kg, ip). Les rats ont été formés 14,22,36 à levier répondre pour le renforcement de l&#39;éthanol, où 3 presses à levier ont donné une chance de boire pendant les jours 1 h séances de plus de 60 jours consécutifs. Ensuite, les rats ont été contraints à l&#39;abstinence, et DREADDs Gaq couplés ont été exprimés dans le noyau accumbens astrocytes de base. Après trois semaines d&#39;abstinence, la motivation à l&#39;auto-ADMI<html> nistre de l&#39;éthanol a été mesurée par point d&#39;arrêt. 21,27-30 activation du noyau accumbens astrocytes de base, par l&#39;intermédiaire de l&#39;administration systémique CNO, a diminué la motivation des rats pour reprendre l&#39;éthanol auto-administration après l&#39;abstinence par rapport à un véhicule. Surtout, le CNO n&#39;a eu aucun effet dans une cohorte aussi formé qui exprimait la protéine fluorescente verte au lieu de la DREADD. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig3.jpg" /> Figure 3. striatum ventral région Représentant transfectées par le virus microinjecté. Cette image illustre la région du noyau accumbens astrocytes qui ont été transfectées en suivant la méthode ci-dessus. Les données sont reproduites à partir de Bull et al. 13 avec la permission du titulaire du droit d&#39;auteur. Les détails peuvent être trouvés dans cette publication et le matériel complémentaire d&#39;accompagnement.blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig4.jpg" /> Figure 4. Motivation des rats à auto-administrer de l&#39;éthanol a été réduite par l&#39;activation d&#39;un transgène qui a été sur-exprimé dans le noyau accumbens astrocytes de base. Le virus a été microinjecté et la motivation mesurée par point d&#39;arrêt après avoir laissé une semaine pour le virus d&#39;exprimer. Le transgène exprimé était un créateur Receptor Exclusivement Activé par Designer Drugs (de DREADDs). Une ANOVA à sens unique (F (2,30) = 3,29, p = 0,04), suivie par un post-hoc Scheffé révélé que l&#39;activation de la DREADD par l&#39;administration systémique de la clozapine N-oxyde (CNO, 3 mg / kg, ip ) réduit de façon significative la motivation des rats à auto-administrer de l&#39;éthanol après l&#39;abstinence par rapport à un véhicule CNO n&#39;a eu aucun effet dans une cohorte aussi formé qui exprimait la protéine fluorescente verte (GFP) au lieu de la DREADD. Les données sont reproduites à partir de Bull et al. 13 avec la permission du titulaire du droit d&#39;auteur. Les détails peuvent être trouvés dans cette publication et le matériel complémentaire d&#39;accompagnement. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53018/53018fig5.jpg" /> Figure 5. microinjection de Gap bloqueurs de jonction a augmenté la motivation des rats à l&#39;auto-administrer éthanol après l&#39;abstinence Deux bloquants des jonctions lacunaires ont été évalués pour leur effet sur ​​la motivation (mesurée par l&#39;intermédiaire de points d&#39;arrêt) de rats à l&#39;auto-administrer de l&#39;éthanol:. Méfloquine et 18- a-acide glycyrrhétinique (18-α). Une ANOVA à deux voies a révélé que la micro-injection de bloqueurs écart-jonction dans le noyau accumbens base a augmenté la motivation des rats à l&#39;auto-administrer éthanol après l&#39;abstinence (F (3,40) = 5,56, p = 0,003). Les données sont reproduites à partir de Bull et al. 13 avec la permission du titulaire du droit d&#39;auteur. Les détails peuvent être trouvés dans cette publication etle matériel complémentaire d&#39;accompagnement.

Les rongeurs sont un modèle approprié pour étudier les substrats moléculaires du comportement et des troubles psychiatriques complexes. La micro-injection cérébrale chez les rongeurs éveillés peut être utilisée pour élucider les substrats de la maladie. Une méthode de micro-injection cérébrale efficace et personnalisable ainsi que l’exécution d’un paradigme opérant qui quantifie la motivation sont présentées.

Le cerveau de rongeurs microinjection pour l&#39;étude de substrats moléculaires de Motivé Comportement

Brain microinjection can aid elucidation of the molecular substrates of complex behaviors, such as motivation. For this purpose rodents can serve as ...

L'objectif général de cette procédure est de fabriquer avec précision une canule et des micro-injecteurs, ainsi que d'effectuer correctement une microinjection. Cela est réalisé en premier lieu en fabriquant une canule d'une longueur appropriée. La deuxième étape consiste à couper et assembler les micro-injecteurs.Ensuite, préparez les micro-injecteurs, les tubes et une pompe pour la microinjection. La dernière étape consiste à réaliser la microinjection et à laisser passer une période de diffusion. En définitive, la microinjection permet d'injecter précisément des réactifs dans la région cérébrale souhaitée, en démontrant une manipulation appropriée.Pendant la microinjection, Ryan Poland, un étudiant de mon laboratoire, sera présent. En général, les personnes novices dans cette méthode éprouvent des difficultés car il faut faire preuve d'une attention particulière et chaque étape exige une grande vigilance afin de garantir un positionnement adéquat de la canule et un emplacement correct de la microinjection. Pour préparer la canule, tracez d'abord une ligne de repère de 15 millimètres sur le ruban à l'aide d'un stylo fin.Ensuite, utilisez-le comme guide pour marquer successivement les sections de 15 millimètres sur le tube à l’aide d’un marqueur permanent pointu. Ensuite, entaillez le tube de la canule en le touchant avec le disque de coupe tournant lentement de l’outil rotatif. Aux points marqués, faites pivoter la canule de 180 degrés et entaillez le côté opposé du tube.Ne coupez pas complètement le tube, car cela pourrait entraîner une occlusion. Ensuite, pliez fermement le tube afin de le diviser en sections de 15 millimètres. Puis tenez chaque extrémité de la canule perpendiculairement au disque de coupe entre le pouce et l'index.Faire tourner le tube de la canule tout en touchant son extrémité à la surface du disque coupé afin d'obtenir une extrémité émoussée. Ensuite, ébarber les deux extrémités de la canule à l’aide d’une aiguille biseautée de calibre 26 pour s’assurer que toutes les bavures ont été retirées et que la canule est dégagée. Pour préparer l’obturateur, pincer une canule à environ la moitié de sa longueur avec des pinces hémostatiques droites de poids moyen, puis poser la pince verrouillée sur le plan de travail de manière que la canule soit perpendiculaire au plan de travail.Ensuite, introduire une extrémité du fil d'ator dans la canule jusqu'à ce qu'elle atteigne le plan de travail. Courber le fil en le pinçant avec les doigts jusqu'à obtenir un angle de 30 degrés, tout en maintenant le contact entre l'obturateur et le plan de travail. Puis, retirer le fil de la canule et couper la partie excédentaire à 2,5 millimètres du coude à l'aide de petites pinces coupantes diagonales.Dans cette procédure, maintenez une extrémité du tube du micro-injecteur perpendiculairement à l’aide d’un clamp droit verrouillé. Tournez le clamp tout en maintenant une tension sur le tube et enroulez-le étroitement autour du clamp au moins une fois. Ensuite, mesurez 32 millimètres à partir de l’autre extrémité libre du tube du micro-injecteur et saisissez ce point perpendiculairement à l’aide d’un deuxième clamp.Courbez le tube vers l’avant et vers l’arrière tout en maintenant la tension jusqu’à ce qu’il casse. Ensuite, inspectez le tube du micro-injecteur pour vous assurer que les deux extrémités sont droites et que le diamètre intérieur est dégagé. Tracez une ligne de référence de cinq millimètres sur le ruban à mesurer et marquez séquentiellement des sections de cinq millimètres du tube de canule à l’aide d’un marqueur permanent.Ensuite, amenez le tube de la canule en contact avec le disque de coupe tournant lentement aux points marqués afin de pratiquer des entailles dans le tube. Puis, pliez brusquement le tube du collier du micro-injecteur afin de le couper en sections de cinq millimètres. Faites glisser un collier sur chaque tube de micro-injecteur, à environ deux centimètres de l'extrémité.Appliquez une petite quantité de colle super glue sur le tube du microinjecteur à cinq millimètres d'une de ses extrémités. Ensuite, faites glisser le collier par-dessus la goutte de colle super glue de manière à ce qu'il se trouve à un millimètre de l'extrémité du tube de microinjection. Après cela, recouvrez les deux extrémités du collier de colle.Ensuite, fixez une aiguille de calibre 26 à la seringue d'un millilitre remplie d'eau stérile. Faites glisser le morceau de tubing en plastique de l'injecteur micro 8 centimètres sur l'aiguille, en veillant à ne pas percer le tube, puis faites glisser l'autre extrémité du tubing en plastique sur l'extrémité du collier de l'injecteur micro desséché. Appuyez sur le piston de la seringue remplie d'eau pour vérifier la perméabilité. À cette étape, courbez l'injecteur micro terminé à 15 millimètres de l'extrémité opposée au collier, selon un angle de 95 degrés.Ensuite, coupez le tube en plastique à 70 centimètres et faites-le glisser sur le collier du microinjecteur. Pour préparer la pompe à microinjection, réglez sur le tube le diamètre de l'aiguille de microinjection, le débit d'infusion souhaité et le volume d'injection cible. Puis, réglez le mode de la pompe sur « volume » afin qu'un volume précis soit délivré automatiquement.Ensuite, régler le butoir de la pompe pour permettre de remplir la seringue jusqu'au volume d'injection plus 0,2 microlitre supplémentaire. Placer maintenant la pointe de la seringue gastight dans l'eau stérile contenue dans un petit récipient en plastique et agiter doucement le piston afin de lubrifier uniformément le fil interne. Tirer le piston jusqu'au butoir de la pompe pour remplir l'aiguille de microinjection avec de l'eau.Diapositive suivante. Le tube PE 20 est relié au micro-injecteur sur une aiguille de calibre 26 fixée à une seringue stérile d'un millilitre remplie d'eau stérile. Pulvériser de l'eau stérile à travers le micro-injecteur et examiner le motif et la distance de pulvérisation.Ensuite, placez un micro-injecteur stérilisé sur un champ stérile. Faites glisser le tube hors de l'aiguille, puis coupez le tube sous la zone endommagée par l'aiguille en le maintenant droit pour éviter que l'eau ne s'écoule. Puis, poussez légèrement en avant le piston de la seringue du micro-injecteur afin de former une gouttelette à l'extrémité de l'aiguille, et faites glisser le tube PE 20 rempli d'eau sur l'aiguille.Ensuite, pousser complètement le piston vers l'avant afin de préparer le chargement de l'échantillon et s'assurer qu'aucune trace d'éthanol ne demeure dans le micro-injecteur. Vérifier la présence de fuites en touchant à plusieurs reprises avec un essuie-tout propre la goutte d'eau formée à l'extrémité du micro-injecteur. Puis, tirer le piston de la seringue de 0,2 microlitre vers l'arrière afin de créer une bulle entre l'eau stérile, le tube PE 20 et la solution à injecter.Ensuite, placer le micro-injecteur dans le réactif à injecter et tirer lentement le piston de la seringue jusqu'au butoir. Pour préparer l'animal à l'injection, maintenir la poitrine du rat contre la poitrine de l'expérimentateur. Nettoyer la zone autour de la canule avec un applicateur en coton imbibé de Bétadine.Imprégnez le capuchon de la tête trois fois avec du Bétadine, puis passez de l'éthanol deux fois. Ensuite, insérez le micro-injecteur rempli dans la canule. Appuyez sur démarrer sur la pompe de micro-injection et surveillez le déplacement de la bulle.Lorsque l'injection est terminée, retirez le micro-injecteur de la canule et remplacez-le par l'obturateur. Cette figure montre la transfection de la région des astrocytes du noyau accumbens par un virus micro-injecté, et cette figure illustre la réduction de la motivation des rats à s'autoadministrer de l'éthanol en activant un transgène surexprimé dans le noyau accumbens. L'activation des sites des astrocytes du noyau accumbens par l'administration systémique de CNO a réduit de manière significative la motivation des rats à s'autoadministrer de l'éthanol après une période d'abstinence, comparativement au véhicule de CNO, qui n'a eu aucun effet sur un groupe témoin également entraîné mais exprimant GFP au lieu du transgène DREADD.Cette technique permet de personnaliser les instruments de microinjection cérébrale et offre une plus grande souplesse dans les procédures expérimentales. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel de se rappeler qu'une localisation précise de la microinjection est indispensable pour obtenir l'effet souhaité.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Behavior

Comportement

La surveillance des niveaux de neurotransmetteurs extracellulaire dans les régions cérébrales distinctes d'animaux se déplaçant librement offre un aperçu sur le lien entre la libération des neurotransmetteurs et des comportements. En microdialyse in vivo couplée à une détection électrochimique fournit anatomiques et une résolution excellentes chimiques et des informations sur la façon dont la neurotransmission basale est altérée par des manipulations pharmacologiques ou physiologiques.

Survivable chirurgie stéréotaxique chez les rongeurs

Source : Poland, R. et al. Micro-injection de cerveau de rongeur pour étudier les substrats moléculaires du comportement motivé. J. Vis. Exp. (2015)Dans cette vidéo, une installation de micro-injection remplie d’eau composée d’une seringue et d’un tube de micro-injecteur est utilisée pour une administration précise du médicament. Un rat avec une canule guide pré-implantée subit une micro-injection cérébrale ciblée, permettant une administration précise d’agents thérapeutiques chez les animaux...

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Ce protocole décrit l’assemblage et l’utilisation d’un injectrode pour une administration précise de médicament dans des régions cérébrales ciblées d’un rat anesthésié, suivie d’une surveillance de l’activité neuronale par des signaux électriques enregistrés.

Micro-injection de médicament avec enregistrement électrophysiologique dans le cerveau d’un rat

Source : Paolone, G., et al. Aiguilles personnalisées pour les micro-injections dans le cerveau des rongeurs. J. Vis. Exp. (2018).Cette vidéo montre l’injection d’une micro-aiguille de cerveau de rongeur à l’aide d’une micro-aiguille de quartz trouée. La micro-aiguille est attachée à une seringue et à une micropompe pour contrôler le débit de livraison. L’aiguille contenant la solution d’injection est insérée dans le cerveau avec la vitesse de livraison réglée à faible. Une fois positionné, la...

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La micro-injection stéréotaxique de vecteurs viraux exprimant la recombinase Cre pour étudier le rôle des gènes cibles de cocaïne préférence de place conditionnée

Ici, nous fabriquons une pipette en verre avec une double fonction : l’inhibition des structures cérébrales profondes par des micro-injections de médicaments et le suivi en temps réel de leurs effets grâce à des enregistrements électrophysiologiques simultanés.

Simultanée électrophysiologique Enregistrement et micro-injections d&#39;agents inhibiteurs dans le cerveau des rongeurs

Injection stéréotaxique de lentivirus exprimant les ADNc ou shRNA peuvent moduler l'expression génique dans des zones spécifiques du cerveau de souris. Ici, nous présentons un protocole de combiner injections stéréotaxiques avec des tâches comportementales, comme le test Open Field (OFT) et le test de natation forcée (FST).

Application Technique d&#39;injection stéréotaxique pour étudier les effets génétiques sur les comportements des animaux

Nous avons montré qu’une implantation de la microélectrode dans le cortex moteur des rats provoque immédiates et durables les déficits moteurs. Les méthodes proposées dans la présente ébauche une chirurgie d’implantation de microélectrodes et trois rongeurs tâches comportementales pour élucider les changements potentiels dans la motricité fine ou brute en raison de dommages causés à l’implantation au cortex moteur.

Comportement des tests pour évaluer les déficits fonctionnels causés par l’Implantation de la microélectrode dans le Cortex de moteur de Rat rongeur

Décrite ici est une procédure stéréotaxique qui peut cibler des régions cérébrales difficiles et difficiles à atteindre (en raison de limitations spatiales) en utilisant une approche coronale inclinée. Ce protocole est adaptable aux modèles de souris et de rats et peut être appliqué à diverses applications neuroscientifiques, y compris l’implantation de canules et les microinjections de constructions virales.

Approche stéréotaxique angulaire adaptable pour des techniques de neuroscience polyvalentes

Apprenez la microinjection cérébrale chez les rongeurs éveillés pour étudier les substrats moléculaires du comportement motivé et des troubles psychiatriques. Cette méthode précise permet de fabriquer des canules et des micro-injecteurs sur mesure.

Le cerveau de rongeurs microinjection pour l'étude de substrats moléculaires de Motivé Comportement

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