Une méthode de référence de microdilution de bouillon pour dalbavancine In Vitro Tests de sensibilité des bactéries qui se développent Aerobically

L’objectif général de la procédure suivante est de déterminer la concentration inhibitrice minimale de dalbavancine. Pour ce faire, il suffit d’utiliser la méthode de micro-dilution du bouillon en mettant l’accent sur les étapes clés propres à Dalbavancin. La dilution bouillon et intermédiaire de la dalbavancine est effectuée dans du DMSO et la dilution finale est effectuée dans un bouillon Mueller Hinton ajusté complété par du polysorbate.

Les dilutions sont distribuées dans une plaque à 96 puits et inoculées avec une suspension standardisée de bactéries. La plaque est ensuite incubée pendant 16 à 24 heures et examinée pour déterminer la quantité minimale de dalbavancine nécessaire pour inhiber la croissance bactérienne. L’adhésion à cette méthode normalisée garantira des résultats cohérents avec les isolats cliniques et, comme le montre ici, les isolats de contrôle de la qualité Dalbavancin est un agent antimicrobien lipoglycopeptide semi-synthétique qui a été approuvé en mai 2014 par la FDA pour le traitement des infections bactériennes aiguës de la peau et des structures cutanées causées par des organismes à Gram positif.

Cette méthode décrit la méthode normalisée de susceptibilité à la microdilution du bouillon pour le dassin, qui comprend l’utilisation de DMSO pour la préparation de solutions mères dans du polysorbate 80 afin d’atténuer l’adhérence de l’agent sur le plastique. La démonstration visuelle de cette méthode est utile. Comme les étapes de préparation de la solution mère et de la plaque MIC ne sont pas typiques par rapport à la plupart des agents antimicrobiens. Ces étapes sont propres aux agents lipoglycopeptidiques et sont importantes à suivre afin d’obtenir des résultats de CMI reproductibles et précis.

Gina Fisher, une chercheuse scientifique de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Veuillez noter que des précautions de sécurité appropriées conformes au niveau de biosécurité deux doivent être utilisées lors de l’exécution de la procédure suivante. Commencez par peser la quantité appropriée de dalbavancine pour préparer une solution mère de 800 microgrammes par millilitre.

Ajoutez la quantité appropriée de NEAT DMSO dans un tube stérile en verre ou en plastique, puis transférez la poudre dans le tube et vortexez-la. Prochain. À l’aide de la solution mère de DALBAVANCIN de 800 microgrammes par millilitre, préparer 100 fois les concentrations finales de CMI sur plaque comme indiqué dans les colonnes un à quatre. C’est ce qu’on appelle les concentrations intermédiaires.

Le volume total préparé dépendra du nombre de panneaux MIC. Enfin, diluez les concentrations intermédiaires de un à 100 dans un bouillon Mueller Hinten non ajusté, également connu sous le nom de C-A-M-H-B, complété par 0,004 % P 80. La concentration de travail résultante de DALBAVANCIN et de P 80 est le double de la concentration finale.

Étant donné que l’ajout d’inoculum entraînera une dilution d’une à deux à l’aide d’une pipette multicanaux avec des pointes stériles, distribuez 50 microlitres de chaque dilution de dalbavancine dans les puits appropriés du panel de microdilution stérile à 96 puits. Le format de la plaque MIC permet de tester huit inoculaires par plaque. Si les panneaux ne sont pas utilisés immédiatement, appliquez un film plastique pour les sceller, puis placez-les dans des sacs en plastique et conservez-les dans un congélateur non dégivrable à au moins moins 60 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires.

Dans cette démonstration, une assiette fraîchement préparée sera inoculée. Pour préparer l’inoculum, sélectionnez plusieurs colonies bien isolées à partir d’une tarière de sang de 18 à 24 heures ou d’une autre plaque de tarière non sélective. Ici, le contrôle de la qualité s aria et les souches calleuses EPHI sont utilisés.

Touchez le haut de chaque colonie avec un écouvillon stérile et transférez-en une partie dans un tube contenant un à cinq millilitres de C-A-M-H-B ou de solution saline. Continuez à transférer jusqu’à ce que la turbidité corresponde à un étalon McFarland de 0,5 dans les 15 à 30 minutes suivant la préparation, diluez l’inoculum un à 100 dans C-A-M-H-B pour arriver à une concentration finale de cinq fois 10 à la cinquième UFC par millilitre. La plage acceptable est de deux à huit fois 10 à la cinquième UFC par millilitre.

À l’aide d’une pipette multicanaux avec des pointes stériles, transférez immédiatement 50 microlitres de l’inoculum final dans chaque puits approprié de la plaque du panneau MIC ici. Quatre rangées sont inoculées avec chacun des deux isolats, pour un total de quatre répétitions par isolat. Ensuite, pour effectuer un contrôle de pureté, utilisez une pipette pour transférer un à 10 microlitres de la solution dans le contrôle de croissance positif dans une gélose non sélective, comme la gélose au soja de try decay avec 5 % de sang de mouton.

Utilisez une boucle stérile pour étaler la solution sur la surface de la plaque. Tournez la plaque à 90 degrés et striez à nouveau pour vous assurer que l’inoculum est uniformément réparti. Couvrez l’assiette et mettez-la de côté.

En préparation d’un comptage de colonie, utilisez une pipette à canal unique pour transférer 10 microlitres de la solution dans le puits de contrôle de croissance à 10 millilitres de mélange salin, puis transférez 100 microlitres dans un milieu agricole non sélectif approprié, tel que essayez la gélose de soja avec 5 % de sang de mouton à l’aide d’une boucle stérile, étalez la solution sur toute la surface agricole. Répétez ce processus deux fois dans des directions différentes pour assurer une distribution uniforme de l’inoculum. Ensuite, empilez jusqu’à quatre panneaux MIC dans un récipient en plastique en veillant à ce que le panneau supérieur soit hermétiquement fermé avec un couvercle.

Placez ensuite une serviette en papier humide à l’intérieur du récipient en plastique et fermez-le solidement avec le couvercle dans les 30 minutes suivant l’inoculation. Incuber les panneaux de CMI, la plaque de comptage des colonies et la plaque de contrôle de la pureté dans un incubateur d’air ambiant à plus ou moins deux degrés Celsius pendant 16 à 20 heures. Le lendemain, lisez la concentration minimale inhibitrice comme la concentration la plus faible qui inhibe complètement la croissance bactérienne dans les puits détectée à l’œil nu.

Déterminez le nombre de colonies sur la plaque de dénombrement des colonies. Multipliez le nombre compté par le facteur de dilution. Par exemple, 50 colonies multipliées par un facteur de dilution de 10 000 équivalent à cinq fois 10 puissance cinq UFC par millilitre.

Une fourchette acceptable est de 20 à 80 colonies, ce qui équivaut à deux à huit fois 10 à la cinquième colonie formant des unités par ml. La concentration de l’inoculum est une variable importante pour contrôler le test de sensibilité afin d’obtenir des résultats précis. Enfin, vérifiez la plaque de pureté.

Si toutes les colonies sont similaires aux colonies utilisées comme inoculum, alors il peut être considéré comme pur. S’il y a d’autres colonies présentes, il est possible qu’un contaminant soit présent dans le panel de CMI et l’essai doit être répété. Les résultats de la DAL bevans, de la CMI ont été comparés à ceux obtenus à l’aide de la méthode de dilution agricole, comme indiqué ici.

Les résultats de l’Agri MIC pour les Dal bevans sont généralement deux à huit fois plus élevés que ceux du bouillon. Microdilution, résultats de la CMI. Ce contraste donne de la vancomycine, qui se fait par des méthodes de bouillon et d’agriculture.

Par conséquent, la dilution agricole n’est pas recommandée pour les tests de bouillon de dalbavancin dalbavancin. Microdilution MIC, les résultats du contrôle de la qualité doivent se situer dans les plages attendues, comme indiqué ici. L’organisme de contrôle de la qualité SS, A TCC 2 9 2 1 3 avec une CMI modale très claire de 0,06 microgramme par millilitre, a été un bon indicateur de la variation de la méthode.

Si les résultats obtenus se situent à l’extérieur des limites attendues pour les organismes de contrôle de la qualité ou s’ils tendent vers la limite inférieure ou supérieure de la plage, une validation plus poussée de la méthode est justifiée. En plus de valider la méthode à l’aide d’organismes de contrôle de la qualité, les données de la dalbavancine et de la CMI provenant des programmes régionaux de surveillance antimicrobienne peuvent servir de base aux résultats de la CMI attendue dans le cadre d’un laboratoire clinique, comme le montre le présent document, les résultats de la CMI pour les isolats collectés en Europe et aux États-Unis de 2011 à 2013 étaient inférieurs à 0,25 microgramme par millilitre pour 99,9 % des UIS et 100 % des streptocoques. D’après ces données de surveillance, il est évident que les résultats de la CMI de la dalbavancine pour les staphylocoques et les streptocoques supérieurs à 0,12 microgramme par millilitre sont rares.

Si un nombre plus élevé est observé, le test doit être répété et/ou envoyé à un laboratoire de référence pour validation. La préparation de la dilution du stock dans le DMSO et l’ajout de P 80 à la dilution du bouillon à une concentration de 0,002 % dans le puits final de la CMI sont les étapes essentielles pour obtenir des résultats précis et reproductibles de la CMI de la dalbavancine Comme toujours, mais surtout dans ce domaine du développement de la résistance bactérienne, des résultats précis de sensibilité aux antimicrobiens sont essentiels au choix du clinicien du traitement approprié.